劉愛(ài)麗，諶 輝

（天津醫(yī)科大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，天津 300070）

由于細(xì)胞膜兩側(cè)離子的不均勻分布，導(dǎo)致膜兩側(cè)存在一定的電位差， 稱為膜電位（ membrane potential）[1]。細(xì)胞未接收刺激時(shí)處于非興奮狀態(tài)下的膜電位為靜息膜電位（resting membrane potential，RMP）[1-2]。靜息膜電位對(duì)細(xì)胞維持良好的功能狀態(tài)起關(guān)鍵調(diào)控作用，如細(xì)胞增殖、分化、遷移以及發(fā)育和再生過(guò)程中的形態(tài)形成等，具有重要生物學(xué)意義[3-7]。當(dāng)膜電位比靜息膜電位變得更正時(shí)，細(xì)胞發(fā)生去極化；如果變得更負(fù)，則稱為超級(jí)化[8]。有研究發(fā)現(xiàn)膜電位與多種病理生理狀態(tài)（腫瘤、發(fā)育障礙等）有密切關(guān)系[4,9]。因此，對(duì)細(xì)胞膜電位的研究至關(guān)重要。本文利用膜片鉗技術(shù)，記錄4 種氯化鉀濃度下小鼠海馬神經(jīng)元膜電位的變化以及動(dòng)作電位特性的改變。研究不同濃度氯化鉀對(duì)神經(jīng)元膜電位和動(dòng)作電位的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4～6 周齡SPF 級(jí)C57BL/6J 雄性小鼠，購(gòu)于北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠在12 h/12 h 晝/夜循環(huán)的室溫（21～24 ℃）環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，自由飲食取水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處理均符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 溶液配置

（1）人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF，mmol/L）：2 mmol/L CaCl2、2 mmol/L MgSO4、120 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L KCl、1.25 mmol/L NaH2PO4、26 mmol/L NaHCO3、10 mmol/L Glucose，pH=7.4～7.6，用HCl 和NaOH 調(diào)節(jié)pH 值。

（2）電極內(nèi)液（mmol/L）：150 mmol/L Kalium-D-gluconat、10 mmol/L KCl、10 mmol/L HEPES、0.25 mmol/L EGTA、5 mmol/L MgATP，pH=7.2，用KOH調(diào)節(jié)pH 值。

（3）氯化鉀溶液：1 mol/L。

以上試劑中Kalium-D-gluconat、HEPES、EGTA、MgATP 購(gòu)于Sigma 公司，其他均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 小鼠海馬腦片的制備

將小鼠快速斷頭取腦，置于充滿混合氧（95% O2+5% CO2）的0～4 ℃人工腦脊液中冷凍1～2 min，取出放置于冷凍手術(shù)臺(tái)上進(jìn)行修塊，然后用膠水將腦組織固定于全自動(dòng)震蕩切片機(jī)（VT1200S，Leica）上，切成350 μm 厚度的腦片。將腦片轉(zhuǎn)移到32 ℃人工腦脊液中孵育1 h 后于室溫條件下繼續(xù)孵育，整個(gè)孵育過(guò)程中持續(xù)通混合氧（95% O2+5% CO2）。孵育完成后，將腦片置于記錄浴槽中，在正置顯微鏡（BX51WI，Olympus）下挑選表面光滑、輪廓清晰的海馬CA1 錐體神經(jīng)元進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄[10]。

1.4 全細(xì)胞膜片鉗記錄

實(shí)驗(yàn)中所用電極由水平拉制儀（Sutter P-97）拉制， 入液電阻為 3～5 MΩ 。 利用膜片鉗放大器（MuitiClamp700B）和數(shù)模轉(zhuǎn)換器（Digidata 1440）采集記錄信號(hào)，并在Clampex 10.7 軟件上設(shè)置相應(yīng)的Protocol 并采集數(shù)據(jù)，采樣頻率為10 kHz，低通濾波為2 kHz。神經(jīng)元與電極形成高阻（＞2 GΩ）封接之后，給予負(fù)壓破膜形成全細(xì)胞模式，將串聯(lián)電阻和膜電容補(bǔ)償?shù)?0%～80%，利用P/4 漏減刺激脈沖進(jìn)行實(shí)時(shí)漏減。補(bǔ)償后將電壓鉗模式轉(zhuǎn)換成電流鉗模式，記錄神經(jīng)元膜電位。整個(gè)記錄過(guò)程在室溫（21～25 ℃）下進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均利用軟件pCLAMP Clampfit 10.7和Graphpad Prism 6.02 處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用t-test 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作圖，數(shù)據(jù)結(jié)果用Mean±SEM 來(lái)表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)水平為0.05（*P＜0.05，**P＜0.01 有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 氯化鉀對(duì)海馬神經(jīng)元膜電位的影響

電流鉗模式下記錄小鼠海馬CA1 錐體神經(jīng)元靜息膜電位，待記錄基線穩(wěn)定后，依次加入1 mol/L 氯化鉀溶液將記錄浴液中的 K+濃度增加到 5、7.5、10 mmol/L，并持續(xù)記錄膜電位的變化。如圖1 所示，神經(jīng)元靜息膜電位為-64.42±0.36 mV（N=10）。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氯化鉀會(huì)刺激神經(jīng)元，使膜電位發(fā)生去極化。隨著氯化鉀濃度的升高，膜電位持續(xù)去極化，分別為：-58.5±0.33 mV（N=8），-51.79±0.45 mV（N=10），-44.00± 0.65 mV（N=10）。

圖1 不同濃度氯化鉀對(duì)海馬神經(jīng)元膜電位的影響

2.2 氯化鉀對(duì)海馬神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏挠绊?/h3>

氯化鉀刺激神經(jīng)元發(fā)生膜去極化，使細(xì)胞產(chǎn)生興奮性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)記錄浴液中K+濃度增加至7.5 mmol/L時(shí)，膜電位會(huì)達(dá)到閾電位從而誘發(fā)產(chǎn)生動(dòng)作電位（action potential，AP），如圖2 所示。圖2(a)為7.5 mmol/L KCl組和10 mmol/L KCl 組的動(dòng)作電位發(fā)放曲線圖，相同時(shí)長(zhǎng)內(nèi)10 mmol/L 組誘發(fā)動(dòng)作電位的數(shù)量較7.5 mmol/L多。圖2(b)為單個(gè)動(dòng)作電位的波形圖。7.5 和10 mmol/L KCl 誘發(fā)動(dòng)作電位的發(fā)放頻率（frequence of AP，Hz）分別為1.556±0.438 3 Hz（N=8）、3.474±0.4931 Hz（N=8），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，見(jiàn)圖2(c)）。與7.5 mmol/L KCl 相比，10 mmol/L KCl 引起膜電位去極化，海馬神經(jīng)元興奮性升高。

圖2 不同濃度氯化鉀對(duì)海馬神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢话l(fā)放頻率的影響

隨后，利用pCLAMP Clampfit 10.7 提取數(shù)據(jù)，對(duì)7.5 和10 mmol/L KCl 誘發(fā)動(dòng)作電位的一些特性進(jìn)行分析，包括幅值（amplitude of AP）、到達(dá)頂峰時(shí)長(zhǎng)（time to peak amplitude）、最大上升斜率（max rise slope）以及最大下降斜率（max decay slope）等，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)比較（見(jiàn)表1）。如圖3 所示，KCl 濃度分別增加至7.5 和10 mmol/L 時(shí)，動(dòng)作電位的幅值和最大上升斜率均具有顯著性差異（P＜0.01），最大下降斜率也有明顯差異（P＜0.05），而到達(dá)頂峰時(shí)長(zhǎng)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)7.5、10 mmol/L KCl 對(duì)動(dòng)作電位的特性有明顯影響。

表1 不同濃度氯化鉀誘發(fā)動(dòng)作電位特性的數(shù)值

圖3 不同濃度氯化鉀對(duì)動(dòng)作電位特性的影響

3 結(jié)語(yǔ)

海馬神經(jīng)元為可興奮性細(xì)胞，接受化學(xué)刺激或電刺激后膜電位會(huì)發(fā)生改變。當(dāng)受到強(qiáng)烈刺激時(shí)，膜電位會(huì)達(dá)到閾電位從而產(chǎn)生動(dòng)作電位。動(dòng)作電位是維持神經(jīng)元興奮性功能的基礎(chǔ)[11-12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氯化鉀會(huì)使神經(jīng)元膜電位發(fā)生去極化，神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)。并且隨著濃度的增加，膜電位持續(xù)去極化。7.5 mmol/L KCl 可誘發(fā)神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位，10 mmol/L KCl 誘發(fā)動(dòng)作電位的頻率增加，興奮性增強(qiáng)。與7.5 mmol/L KCl比較，10 mmol/L KCl 誘發(fā)動(dòng)作電位的幅值明顯減小，最大上升斜率顯著降低，最大下降斜率升高，而到達(dá)頂峰時(shí)長(zhǎng)沒(méi)有明顯變化。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，高濃度氯化鉀可誘發(fā)神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位，且動(dòng)作電位的頻率、幅值、上升斜率和下降斜率受氯化鉀濃度影響。