楊鏡玉，李文亮

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，云南昆明 650032）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）為世界上最常見的癌癥之一，據(jù)研究報道：CRC在2018年有近200萬新發(fā)病例和100萬死亡病例，為全球癌癥死亡的第三大原因之一[1-2]；預(yù)計到2030年，該病在全球?qū)⑦M一步增加60%[3]。CRC根據(jù)分子變化可分為三大類：（1）染色體不穩(wěn)定型（chromosomal Instability，CIN）；（2）微衛(wèi)星不穩(wěn)定型（microsatellite instability，MSI）；（3）CpG島甲基化表型（CpG Island Methylator phenotype，CIMP）。大約75%的CRC與染色體不穩(wěn)定性（CIN）改變有關(guān)，而MSI在所有CRC病例中占10%～20%，包括12%散發(fā)性結(jié)直腸癌（sporadic colorectal cancer，SCRC）和3%遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（hereditarynon-polyposis colorectal cancer，HNPCC，Lynch綜合征）[4-6]。幾項研究估計大約25%的CRC病例是家族性的，不遵循經(jīng)典的孟德爾遺傳模式[6-7]。近幾年來，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌是一種多生物學(xué)和遺傳學(xué)特征性的異質(zhì)性疾病，在臨床表現(xiàn)、預(yù)后和個體治療反應(yīng)，甚至在同一病理階段都存在顯著差異，不通過識別其分子和遺傳特征很難診斷和治療[8]。

隨著研究深入，MSI作為CRC及其他實體瘤的重要基因標志物，被公認是結(jié)直腸癌的重要致癌途徑之一，在CRC的篩查、分類、診斷、治療和預(yù)后的應(yīng)用中具有重要臨床意義，已經(jīng)越來越受到關(guān)注，并成為臨床熱點。本文將綜述MSI及其與結(jié)直腸癌（遺傳性和散發(fā)性腫瘤）的關(guān)系，并著重要對MMR和MSI檢測的分子技術(shù)及相關(guān)免疫檢查點抑制劑（ICPIs）的免疫治療的新進展進行綜述。

1 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性

微衛(wèi)星（microsatellite，MS），又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STRs），是指散布在整個基因組中以少數(shù)幾個核苷酸（1-6個堿基對）為單位串聯(lián)重復(fù)的DNA序列，約占人類基因組的3%。由于MS的重復(fù)結(jié)構(gòu)，它特別容易發(fā)生復(fù)制錯誤，而正常情況下由DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)（mismatchrepair，MMR）進行修復(fù)[9]。

錯配修復(fù)（MMR）系統(tǒng)旨在糾正DNA復(fù)制和重組過程中產(chǎn)生的錯誤插入、缺失和堿基錯配，這種修復(fù)途徑高度保守，借此保護基因組的完整性。MutS和MutL是MMR系統(tǒng)中涉及的主要蛋白質(zhì)。MSH2、MSH3和MSH6是MutS的同源物；MLH1，MLH2，MLH3是MutL的同源物，MutL減數(shù)分裂后形成同源物PMS1和PMS2[10]。當在真核基因組中檢測到錯配時，MSH2與MSH6或MSH3結(jié)合，分別導(dǎo)致MutSα 和MutSβ異二聚體的形成。MutSα 識別單堿基錯配和小插入/ 缺失環(huán)，而MutSβ識別更大的環(huán)。MutSα 或MutSβ可以通過將腺苷三磷酸（adenosinetriphosphate，ATP）與二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）交換來募集MutLα，MutLβ或MutLγ 異二聚體（如果MLH1分別與PMS2，PMS1或MLH3偶聯(lián)）。這種復(fù)合物（MutS-MutL）在DNA周圍產(chǎn)生滑動鉗?；瑒鱼Q中的蛋白質(zhì)與外切核酸酶-1和增殖細胞核抗原（PCNA）相互作用，這種復(fù)合物將子鏈切除。最后，分別通過DNA聚合酶和DNA連接酶進行重新合成和重新連接，以達到修復(fù)錯配蛋白缺失[11-12]。MMR功能缺陷（deficient mismatch repair，dMMR）時，MS出現(xiàn)的復(fù)制錯誤得不到糾正并不斷累積，使得MS序列長度或堿基組發(fā)生改變，稱為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）。MSI腫瘤DNA中的被定義為存在相應(yīng)的種系DNA中不存在的交替大小的重復(fù)DNA序列[13]。

MSI由DNA錯配修復(fù)（MMR）蛋白功能缺陷導(dǎo)致。最近研究證明MSI參與許多遺傳型和散發(fā)型腫瘤的發(fā)病機制，包括結(jié)直腸癌、頭頸部鱗癌、非小細胞肺癌、鱗狀基底細胞皮膚癌、黑色素瘤、胃、膀胱、子宮內(nèi)膜和卵巢癌[14]。因此，測定CRC中MSI狀態(tài)對診斷、分類、預(yù)后和治療具有重要臨床意義，越來越受到重視。

2 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性相關(guān)結(jié)直腸癌

MSI是公認的結(jié)直腸癌的重要致癌途徑之一，其在所有CRC病例中占10%～20%，包括12%散發(fā)性結(jié)直腸癌（sCRC）和3%遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（hereditary non-polyposis colorectal cancer，HNPCC），即Lynch綜合征[15]。因而，開展對MSI相關(guān)CRC（MSI型CRC）篩查、識別、治療和預(yù)后的研究具有重要的臨床應(yīng)用意義。

2.1 散發(fā)性結(jié)直腸癌

散發(fā)性結(jié)直腸癌（Sporadic colorectal cancer，sCRC）約占MSI在所有CRC病例中的12%，稱為MSI型sCRC。它最常見的原因是體細胞啟動子超甲基化導(dǎo)致MLH1基因的表觀遺傳失活（約70%～95%），而MSH2和MSH6的改變較少見[16]。與Lynch綜合征不同，MSI型sCRC在大約50%的病例中與BRAFV600E突變相關(guān)[17]。大約5%～15%的CRC腫瘤中可診斷出來BRAF突變，且目前認為BRAF突變是一個預(yù)后較差的生物標志物。BRAF突變發(fā)生率可能因腫瘤分期不同而不同。有報告表明，在dMMR型sCRC中，轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌與早期結(jié)直腸癌相比，BRAF突變的發(fā)生率更高（34.6%vs 24%）[17]。根據(jù)MSI/MMR、KRAS和BRAF狀態(tài)的不同，不同亞型的大腸癌預(yù)后可能不同[18]。與轉(zhuǎn)移性CRC相比，II期CRC的MSI發(fā)生頻率更高[19]。

MSI型sCRC的臨床病理特征包括好發(fā)于右半結(jié)腸和女性患者，粘液或髓樣組織學(xué)表現(xiàn)，腫瘤浸潤性淋巴細胞和克羅恩樣肉芽腫，以及比CIN癌更好的分期及預(yù)后[20]。MSI很少是散發(fā)性直腸癌的主要途徑，因此當這種結(jié)合發(fā)生時，通常與Lynch綜合征有關(guān)。

MSI狀態(tài)在所有階段的CRC中都是一個重要的預(yù)后因素[21]。據(jù)Mohan等[22]的一項單中心研究表明，該研究回顧了1 250名CRC患者，與MSS型CRC相比，MSI型CRC患者在I期和II期疾病中的無病生存率（diseasefreesurvival，DFS）有所改善。然而，在III期中，MSI型CRC的特征是更突出的淋巴血管周圍浸潤和神經(jīng)周圍浸潤，并且這個亞組的DFS比III期的MSS型CRC患者短。根據(jù)Kim等人的研究結(jié)果表明，微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定型（MSI-high，MSI-H）CRC患者比 MSI-L型（MSI-low，MSI-L）或 MSS型（microsatellite stability，MSS）CRC患者有更長的DFS（HR0.619（95%CI:0.508～0.755，P＜0.001），更容易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)（30.0%vs 12.0%，P=0.032）或腹膜轉(zhuǎn)移（40.0%vs 12.3%，P=0.003），而腹外復(fù)發(fā)比MSI-L或MSS型CRC少（肝轉(zhuǎn)移44.7%vs 15.0%，P=0.004）；肺轉(zhuǎn)移42.5%vs 10.0%，P=0.004））[23]。

2.2 Lynch綜合征（LS）

在所有新發(fā)的結(jié)直腸癌病例中，其中3%可歸因于Lynch綜合征（lynch syndrome，LS）[24]。LS舊稱遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌（hereditary non-polyposis colorectal cancer，HNPCC），是最常見的遺傳性結(jié)腸癌綜合征，是一種常染色體顯性遺傳疾病，由幾種MMR基因（包括染色體2p16上的MSH2，染色體3p21上的MLH1，染色體2p16上的MSH6和染色體7p22上的PSM2）之一發(fā)生雜合性致病性胚系突變所致，或由EPCAM基因缺失導(dǎo)致MSH2不表達所致[25]。由于MMR基因功能缺陷，LS患者常表現(xiàn)為錯配修復(fù)功能缺陷（deficient mismatch repair，dMMR）或微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定性（MSI-High，MSI-H）。目前認為[26]，當一個錯配修復(fù)基因發(fā)生胚系突變時，極有可能引起該基因在另一個拷貝中發(fā)生“二次打擊”即發(fā)生體細胞突變，從而致癌，即“二次打擊”學(xué)說。該學(xué)說認為[26]，遺傳性腫瘤第一次突變發(fā)生于生殖細胞，第二次突變發(fā)生于體細胞。而散發(fā)性腫瘤兩次突變均發(fā)生于體細胞。因此“二次打擊”學(xué)說[26]解釋了遺傳性腫瘤表現(xiàn)出早發(fā)性、多發(fā)性、雙側(cè)性的特征，而散發(fā)性腫瘤則表現(xiàn)出遲發(fā)性、單發(fā)性、單側(cè)性特征。

LS患者與sCRC患者相比，LS發(fā)病年齡更早（45～60歲vs.69歲）[27]。雖然結(jié)直腸癌是與Lynch綜合征相關(guān)的最常見的癌癥，但也可以發(fā)生腸外癌癥，包括子宮內(nèi)膜癌（最常見）、小腸癌、輸尿管癌、腎盂癌、胃癌、肝膽管癌和卵巢癌[28]。LS臨床特征包括：早期，同時或異時性CRC，右側(cè)結(jié)腸癌占主導(dǎo)。多表現(xiàn)為低分化，黏液性，髓樣生長[29]。

LS患者腫瘤間質(zhì)有大量淋巴細胞浸潤，提示對高突變負荷產(chǎn)生了相應(yīng)的免疫反應(yīng)。高突變是由MMR功能缺失導(dǎo)致錯配的堿基得不到修復(fù)進而積累，這反過來又提供了高度的免疫原性，提高了免疫治療的反應(yīng)性[17]。dMMR型CRC與錯配修復(fù)功能完整（proficient mismatch repair，pMMR）的CRC相比，具有早期診斷和較低的轉(zhuǎn)移傾向的特征。dMMR型CRC的發(fā)病率在II期為20%，在III期中為11%，在IV期為3.5%[30]。多項研究[31]顯示，非轉(zhuǎn)移性dMMR型CRC患者的預(yù)后明顯好于同分期的pMMR型CRC患者。在復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性的CRC患者中，dMMR型CRC患者的預(yù)后與pMMR型CRC患者相似或更差，這一發(fā)現(xiàn)仍未得到解釋[32]。

MMR蛋白/MSI的檢測可對LS進行初篩。LS診斷包括：鑒定錯配修復(fù)基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）胚系突變或EpCAM（上皮細胞粘附分子）胚系缺失（導(dǎo)致MSH2失活）。據(jù)報道，MLH1或MSH2突變占Lynch相關(guān)癌癥的60%～80%，剩下則多歸因于MSH6或PMS2突變，EpCAM突變非常罕見[33]。MSH2突變與腸外惡性腫瘤，尤其是與子宮內(nèi)膜癌高風險相關(guān)。而MSH6突變攜帶者患腸癌或腸外癌的年齡晚于MLH1或MSH2突變的患者[34]。MLH1和PMS2表達缺失，說明MLH1啟動子發(fā)生體細胞甲基化（常發(fā)生于sCRC）或MLH1胚系突變（LS-CRC）；MSH2和或MSH6或PMS2缺失通常由胚系突變引起。免疫組化測定結(jié)果與MSI測定顯示出高度一致性[35]。當發(fā)現(xiàn)錯配修復(fù)蛋白缺失或MSI時，繼續(xù)行BRAFV600E測試或MLH1甲基化分析，體細胞BRAFV600E突變與MLH1甲基化相關(guān)，在胚系突變中未觀察到[36]。值得注意的是，MMR蛋白/MSI的檢測作為初篩手段有可能漏診部分LS。一方面原因是MMR蛋白/MSI的檢測對LS的敏感度分別為83%和77%～89%，存在一定漏診率[37]；另一方面，LS不僅表現(xiàn)為首發(fā)結(jié)直腸癌，也有相當部分患者首發(fā)腫瘤為腸外腫瘤，因此僅對結(jié)直腸癌患者進行MMR蛋白/MSI的篩查也是漏診的重要原因[38]。

3 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測方法

MSI多由MMR蛋白表達缺失所致。因此，可通過檢測MMR蛋白或MSI來反映微衛(wèi)星狀態(tài)。通過IHC法檢測MMR蛋白和通過PCR法檢測MSI是評估相同生物學(xué)效應(yīng)的不同檢測方法。一般而言，dMMR相當于MSI-H表型，pMMR相當于MSI-L/MSS表型[39]。

3.1 IHC檢測法

IHC法檢測MMR蛋白是一種間接評估微衛(wèi)星狀態(tài)的方法。IHC法就檢測4個常見MMR蛋白（MLH1，MSH2，PMS2和MSH6）的抗體表達，陽性表達定位于細胞核。如果任何一個蛋白表達缺失，即定義為錯配修復(fù)功能缺陷（deficient mismatch repair，dMMR）；如果4個蛋白表達均為陽性，即定義為錯配修復(fù)功能完整（proficient mismatch repair，pMMR）。IHC檢測應(yīng)強調(diào)標本處理規(guī)范，采用自動判讀與人工判讀相結(jié)合。人工判讀易受主觀因素影響[39]。

3.2 PCR檢測法

直接檢測MSI狀態(tài)的常用方法是多重熒光PCR毛細血管電泳法，這也是目前認可的金標準。PCR法是從人的腫瘤組織樣本的幾個微衛(wèi)星位點擴增DNA，與來自每位患者的正常DNA進行比較。目前推薦的5個微衛(wèi)星（MS）檢測位點（BAT25、BAT26、D2S123、D5S346和D17S250）。判斷標準分為三級：2個及2個以上位點不穩(wěn)定為微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（MSI-high，MSI-H）；1個位點不穩(wěn)定為微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定（MSI-low，MSI-L）；如果所有5個位點均穩(wěn)定為微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）[39]。

3.3 二代測序（nextgenerationsequencing，NGS）法

近年來，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，歐洲腫瘤內(nèi)科學(xué)會（european societyfor medical oncology，ESMO）指南推薦將NGS作為MSI的二線檢測方法。MSI檢測可通過經(jīng)驗證的NGSpanel進行，其優(yōu)勢在于還可覆蓋檢測其它多基因突變狀態(tài)，如KRAS、BRAF等。目前已報道的基于NGS的MSI檢測包括 ：MSIsensor[40]、MANTIS[41]、mSINGS[42]、MSI-ColonCore[43]。其中中國團隊研發(fā)的MSI-ColonCore，與PCR毛細管電泳法一致性為99%，與IHC法一致性為92.4%。該實驗招募了91例原發(fā)性結(jié)直腸癌患者，其中54例患者經(jīng)IHC法檢測術(shù)后病灶組織判為dMMR，另37例判為pMMR。從腫瘤組織中提取DNA，分別用NGS和PCR毛細管電泳法評估微衛(wèi)星狀態(tài)。該實驗研究表明，MSI-ColonCore檢測的靈敏度可達97.9%（47/48），特異度達100%（37/37）。MSI-ColonCore利用一組特定的重復(fù)長度的覆蓋率作為每個微衛(wèi)星基因座的主要特征，如果覆蓋率小于給定的閾值，則判讀為微衛(wèi)星不穩(wěn)定。樣品的MSI狀態(tài)由給定樣品中不穩(wěn)定基因座的百分比確定[43]。隨著NGS技術(shù)的發(fā)展，基于MSI-NGS分析的優(yōu)勢越來越凸顯。相較于IHC法及PCR毛細管電泳法存在人工判讀結(jié)果帶來的主觀差異，NGS數(shù)值量化結(jié)果更加客觀，更有利于檢出分析低頻的MSI；其次，相較于PCR法需要正常組織作為對照，NGS法構(gòu)建DNA文庫可參考人類全基因組公開數(shù)據(jù)結(jié)果，且一旦驗證完成投入檢測未知樣本，并不需要匹配正常組織作為對照；其三，NGS測序可同時捕獲CRC患者的突變譜和MSI狀態(tài)，從而減少所需的組織樣本量并簡化測試過程。這將有利于無法耐受手術(shù)的患者，尤其是大多數(shù)轉(zhuǎn)移癌患者[42]。隨著NGS技術(shù)不斷成熟，利用NGS測定基于外周血循環(huán)DNA（circulatingtumorDNA，ctDNA）的MSI檢測（MSIfromblood，b-MSI）也成為可能，如上海瑞金醫(yī)院開展的運用NGS測序檢測MSI在大腸癌患者血液中的運用（NCT03561350），主要研究目標即通過檢測晚期CRC患者血液標本中的循環(huán)腫瘤ctDNA，來評價NGS方法檢測b-MSI的可行性和可靠性。b-MSI檢測有望對取材困難的晚期腫瘤患者提供新的選擇。

4 治療與預(yù)后

當前，對于CRC的治療提倡綜合治療，包括手術(shù)、靶向治療、新輔助治療、輔助化療等。耐藥性依然是導(dǎo)致晚期CRC患者低存活率的主要原因[44]。腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）對于CRC治療的影響已引起學(xué)界廣泛關(guān)注，TME為結(jié)直腸癌細胞提供了存活、生長、免疫逃避及轉(zhuǎn)移的環(huán)境[45]。評估免疫細胞狀態(tài)及浸潤情況也作為預(yù)后評估及預(yù)測的重要指標。

近幾年來，以免疫檢查點抑制劑（immune check-point inhibitors，ICPIs）為代表的免疫治療在抗癌方面取得了長足進步。ICPIs是一類具有釋放免疫系統(tǒng)潛力的新型免疫治療藥物。雖然大多數(shù)胃腸道癌癥被認為免疫原性差，但基礎(chǔ)研究及臨床試驗數(shù)據(jù)已經(jīng)證明，各種胃腸道癌患者的亞群對ICPIs在內(nèi)的治療具有很高的反應(yīng)性[46]。目前為止，MSI-H的結(jié)直腸癌患者依然是對當前ICPIs有反應(yīng)的唯一亞組[44]。研究發(fā)現(xiàn)MSI腫瘤有大量的淋巴細胞浸潤，稱為腫瘤浸潤性淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）。豐富的CD3+和CD8+細胞毒性TIL在宿主中觸發(fā)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致一個稱為“免疫編輯”的過程，是產(chǎn)生免疫耐受，免疫逃逸的重要原因。一系列檢查點抑制劑調(diào)節(jié)該免疫編輯過程，包括程序性死亡受體-1（programmed death-1，PD-1）、程序性死亡受體配體-1（programmed death lig and-1，PD-L1）以及細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白4（cyto-toxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）等[47]。有研究表明，MSI腫瘤的突變負荷或新抗原比MSS腫瘤高出20倍以上，從而導(dǎo)致這些“超突變”表型的對免疫治療反應(yīng)性增強。MSI腫瘤與MSS腫瘤相比，MSI腫瘤中的TIL上PD-1的表達率（77%vs 39%）和腫瘤細胞上PD-L1的表達率（32%vs 13%）明顯增高[48]。在使用派姆單抗（Pembrolizumab，抗PD-1）治療MSI-H患者的II期臨床實驗中，觀察到總緩解率（objective response，OR）、疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）、無進展生存期（progression-free survival，PFS）均上升。同樣的，當用納武單抗（Nivolumab，抗PD-L1）治療MSI-H患者，也觀察到明顯益處[49]。對于ICPIs治療沒有取得滿意療效的腫瘤，越來越多研究[50]建議ICPIs與化療或靶向治療相結(jié)合。目前普遍認為，化療或靶向治療可以增加腫瘤的免疫原性[50]。Howard等[51]開展的Ib期臨床研究（NCT01633970）證實MSI-H型mCRC患者接受Atezolizumab+Bevacizumab治療后，疾病控制率為90%。這種組合的耐受性很好，且沒有意外的毒性發(fā)生。除了聯(lián)用貝伐珠單抗外，幾種免疫治療聯(lián)合靶向治療的相關(guān)研究也在招募進行中，有望取得更多突破。

盡管ICIPs治療在MSI-HCRC患者中取得了顯著療效，但MSI的存在僅占CRC病例的15%，而MSI-H的發(fā)生率占5.9%甚至更低[52]。所以，絕大多數(shù)患者不在ICPIs臨床獲益范圍內(nèi)。Bendall等[53]進行了一項1b期試驗，使用PDL-1抑制劑Atezolizumab和Cobimetinib（MEK途徑抑制劑）聯(lián)合治療轉(zhuǎn)移性MSS型CRC，聯(lián)合用藥方案在23名患者中的客觀反應(yīng)率（ORR）為17%。22例KRAS突變型腫瘤患者的ORR為20%。6個月OS率為72%。Ebert研究團隊[54]設(shè)計使用MEK抑制劑G-38963抑制MEK并聯(lián)合使用PD-1抑制劑，實驗觀察到更長期的存活率，而單一用藥僅表現(xiàn)出腫瘤生長的初始延遲。實驗還觀察到，MEK抑制劑可作用于T細胞分化的幼稚階段，MEK抑制劑可抑制CD8+T細胞表達Nur77，Nur77與T細胞死亡有關(guān)，抑制Nur77表達，可挽救T細胞衰竭。協(xié)同使用PD-1/PD-L1抑制劑可使pMMR患者獲益，目前已在III期臨床實驗（NCT02788279）中進行評估。這種針對MSS腫瘤，聯(lián)合MEK抑制劑和PD-1/PD-L1抑制劑協(xié)同治療，為ICPIs治療開辟新的途徑，并有望長期獲益?？梢灶A(yù)見，未來免疫治療仍是最熱門的治療手段之一。未來研究熱點方向包括：（1）篩選尋找合適的免疫檢查點抑制劑的生物標記；（2）尋找合適的聯(lián)合用藥方案，以規(guī)避單藥治療弊端等，以期在實體腫瘤中獲得長足進步。

5 結(jié)語

綜上所述，MSI被認為是結(jié)直腸癌（遺傳性和散發(fā)性腫瘤）發(fā)病的重要因素，可以作為檢測結(jié)直腸癌的篩選工具，評估患者預(yù)后的一個指標，以及對化療和免疫治療反應(yīng)的預(yù)測指標。開展MSI分析對CRC患者的分類篩查與識別、免疫治療決策和預(yù)后評估具有重要的臨床應(yīng)用意義。