（中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院眼科，沈陽 110005）

視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP）是一種進行性、不可逆性、遺傳性視網(wǎng)膜疾?。?］。常表現(xiàn)為夜盲、視野缺損和漸進性視力下降。RP一般先累及中周部視網(wǎng)膜，逐漸向后極部進展。這是由于光感受器細胞中的視桿細胞最先發(fā)生凋亡，隨著疾病進展，視錐細胞也逐漸死亡［2-3］。目前已發(fā)現(xiàn)超過80種基因可導致RP。Spata7基因突變是導致早發(fā)型隱性遺傳RP的關鍵基因之一，可致光感受器細胞早期死亡［4-7］。SPATA7蛋白表達于視網(wǎng)膜光感受器細胞中連接纖毛處，其突變導致光感受器細胞的連接纖毛破壞，引發(fā)光感受器細胞相關蛋白的內(nèi)節(jié)到外節(jié)的轉(zhuǎn)運障礙［8-9］。視紫紅質(zhì)蛋白（rhodopsin，RHO）位于光感受器細胞外節(jié)處，是維持光感受器細胞功能的重要蛋白。當RHO合成后無法被轉(zhuǎn)運到光感受器細胞外節(jié)時，會停留在光感受器細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER），導致ER應激，并發(fā)生光感受器細胞死亡［10-13］。部分RP是由于RHO在光感受器細胞ER內(nèi)的非正常折疊或運輸障礙造成。由此推測Spata7基因突變可能導致RHO在ER內(nèi)聚集，發(fā)生ER應激，導致光感受器細胞死亡。

規(guī)律間隔成簇短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9技術是近年來用于基因敲除的基因編輯方法，多用于全身目的基因敲除［14-16］。本研究首次運用腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）作為載體，將CRISPR/Cas9系統(tǒng)搭載入視網(wǎng)膜，構建Spata7視網(wǎng)膜內(nèi)敲除模型，驗證了CRISPR/Cas9技術視網(wǎng)膜內(nèi)靶向敲除的有效性，并進一步探討了Spata7基因在光感受器細胞中的功能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6基因背景的野生型小鼠在12 h光照和12 h暗適應下飼養(yǎng)。本研究嚴格遵守ARVO關于在眼科和視覺研究中的動物使用聲明，實驗方案獲得中國醫(yī)科大學倫理委員會的批準。

1.2 方法

1.2.1 AAV載體的構建：運用http：//crispr-era.stanford.edu網(wǎng)站進行Spata7gRNA的設計，選取分數(shù)最高的gRNA（GTTCTGGACTTCGCTGGAGG）。將Spata7gRNA克隆進pTR-GRK1 AAV8載體，同時將GFP克隆入同一載體，形成AAV8-GRK1-GFP-Spata7gRNA結構。將Cas9單獨克隆入另一載體，形成AAV8-GRKCas9載體結構。AAV8-Spata7gRNA和AAV8-Cas9的病毒濃度分別為3.15×1013和3.45×1013vg/mL。

1.2.2 視網(wǎng)膜下注射：AAV8-Spata7gRNA-GFP與AAV8-Cas9按 1︰1混合。將出生14 d的小鼠分為2組，實驗組右眼注射1 μL AAV混合液，左眼注射等量PBS，對照組左右眼均注射1 μL PBS，以對照注射本身對左右眼帶來的損傷。將小鼠麻醉后，用30號斜角針頭在角鞏膜緣睫狀體平坦部進行淺穿刺，將35號鈍針引入玻璃體腔并向腹側(cè)推進，直到針尖穿過視網(wǎng)膜，用超微量泵Ⅱ和Micro4控制器將病毒懸液注入視網(wǎng)膜下間隙。

1.2.3 視網(wǎng)膜電生理檢查：將小鼠置于暗室過夜后，在暗室內(nèi)行暗適應視網(wǎng)膜電圖（electroretinogram，ERG）檢查，采用6個閃光強度（-34，-24，-14，-4，0，10 dB）記錄a波和b波。

1.2.4 實時PCR：于注射1個月后摘取小鼠視網(wǎng)膜，三唑試劑（美國Invitrogen公司）提取總RNA，DNA酶Ⅰ（美國Invitrogen公司）處理，防止基因組DNA污染。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA。采用Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（美國Fisher Scientific公司）和StepOne實時PCR系統(tǒng)（美國Invitrogen公司）測定敲除后Spata7的mRNA表達水平，并用GAPDH進行標準化。Spata7上游引物序列為5’-TACCCGCCCATA AAGTCAAG-3’，下游引物序列為5’-CAGATGGGGA CAGTGATGTG-3’；GAPDH引物序列為5’-ACCCAG AAGACTGTGGATGG-3’，5’-CACATTGGGGGTAGG AACAC-3’。

1.2.5 免疫熒光檢測及HE染色：處死小鼠后，取眼球置入Davidson’s fixative溶液固定過夜，脫水、包埋、切片，制成7 μm厚切片。切片脫蠟后行抗原修復，冷卻后用1×PBS清洗。于0.5%TBS-Triton X中孵育20 min后，在含有10%山羊血清的緩沖液中室溫孵育1 h，加入1︰500雞抗GFP、1︰25小鼠抗Cas9、1︰500小鼠抗RHO抗體和1︰100兔抗CHOP，4 ℃孵育過夜。TBS洗滌，二抗（1︰500 Alexa Fluor?488結合山羊抗兔IgG、1︰500 Cy3?山羊抗鼠IgG、1︰500 Cy3?山羊抗雞IgG）室溫下孵育2 h。用1︰1 000 Topro3/DAPI和洗滌液對細胞核進行復染。最后，在載玻片上滴入長效防污劑（美國Life Technologies公司）。石蠟切片HE染色，所有切片取材位置相同，為靠近視盤中央處。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析和圖表繪制，采用獨立樣本t檢驗比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Spata7體內(nèi)敲除后眼底照相

對AAV注射1個月后的實驗組小鼠進行眼底照相，觀察小鼠的視網(wǎng)膜損傷情況以及GFP的表達情況。如圖1所示，在正常光頻道下，可見AAV注射眼視網(wǎng)膜鼻上方及顳上方血管弓附近視網(wǎng)膜色素上皮萎縮、邊界不清，視網(wǎng)膜鼻上方可見星狀白色增殖膜，病灶面積約占視網(wǎng)膜10%～20%，病灶內(nèi)繼發(fā)色素增殖呈斑駁樣，并伴有部分黃色滲出，視盤周圍血管紋理清晰，色澤正常。病灶周邊可見熒光著染，提示GFP在AAV注射眼視網(wǎng)膜細胞內(nèi)大量表達。藍光下可見與PBS注射眼相比，AAV注射眼有大量的GFP表達，幾乎覆蓋整個視網(wǎng)膜，表達效率約為80%。說明病毒注射成功，視網(wǎng)膜注射和病毒感染保持較高效率。

圖1 視網(wǎng)膜下腔注射1個月后實驗組小鼠眼底照相檢查結果Fig.1 Fundus imaging results of mice in experimental group one month after injection

根據(jù)小鼠視網(wǎng)膜眼底照相結果確定病毒感染成功后，取實驗組及對照組小鼠各4只行ERG，檢查注射后光感受器細胞的功能。結果如圖2所示，在不同光照強度下，對照組小鼠左右眼a波和b波數(shù)值接近（P＞0.05），且在正常數(shù)值范圍內(nèi)（在光強度為1 cd2/m2時，a波正常值為100～150 μV，b波正常值300～350 μV）。說明視網(wǎng)膜下腔注射不會對視網(wǎng)膜造成損傷。而實驗組小鼠在不同光照強度下，AAV注射眼a波和b波均明顯低于PBS對照眼，在光強度為1 cd2/m2時，a波降低約100 μV，b波降低約200 μV（P＜0.05），提示AAV注射眼光感受器細胞大量死亡。

2.2 Spata7基因體內(nèi)敲除的效率

將4只注射AAV 1個月后的實驗組小鼠處死，取視網(wǎng)膜行實時熒光定量PCR檢測。結果顯示，AAV注射眼Spata7的表達效率比PBS注射眼低54%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。說明1 μL AAV病毒/CRISPR系統(tǒng)混合液（濃度3×1013vg/mL）行一次性視網(wǎng)膜下腔注射對Spata7基因的敲除效率為54%。

2.3 HE染色結果

HE染色結果如圖3所示，對照組（左右眼均注射PBS）左右眼視網(wǎng)膜光感受器細胞層厚度一致且未見明顯細胞死亡。進一步說明了視網(wǎng)膜下腔注射不會對光感受器細胞產(chǎn)生大的損傷，且左右眼注射水平相對一致。而實驗組小鼠AAV注射眼光感受器細胞層（外核層）明顯薄于PBS對照眼，意味著Spata7部分敲除后光感受器細胞大量死亡。

2.4 免疫熒光染色結果

免疫熒光染色結果顯示，GFP和Cas9蛋白的表達基本覆蓋整個視網(wǎng)膜，與眼底照相結果一致。AAV-Spata7-GFP-gRNA和AAV-Cas9病毒可感染同一光感受器細胞，實現(xiàn)了對細胞內(nèi)Spata7基因的敲除（圖4）。與PBS注射眼相比，實驗組小鼠AAV注射眼ER內(nèi)RHO大量表達于光感受器細胞內(nèi)節(jié)，少量表達于外核層。同時，在AAV注射眼光感受器細胞內(nèi)節(jié)中可見ER應激標記蛋白CHOP的表達（圖5）。

3 討論

圖2 視網(wǎng)膜下注射1個月后2組小鼠ERG檢查結果Fig.2 One month after sub-retinal injection，the results of ERG in the two groups were examined

圖3 實驗組和對照組小鼠的HE染色結果Fig.3 HE Staining results of the mice in experimental and control groups

圖4 GFP與Cas9 蛋白的免疫熒光染色結果Fig.4 Immunofluorescence staining results of GFP and Cas9

圖5 RHO和CHOP免疫熒光染色結果Fig.5 Immunofluorescence staining results of RHO and CHOP

為了研究Spata7基因突變后光感受器細胞死亡的機制，本研究首次運用AAV載體和視網(wǎng)膜下腔注射技術，在小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)建立了CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對Spata7基因進行視網(wǎng)膜內(nèi)特異性敲除。實驗組小鼠眼底照相顯示GFP高表達，免疫熒光顯示GFP和Cas9蛋白廣泛表達，qRT-PCR顯示Spata7mRNA表達水平顯著降低，均表明AAV感染及Spata7視網(wǎng)膜內(nèi)敲除效率較高；實驗組小鼠ERG a波和b波峰值顯著降低，視網(wǎng)膜光感受器細胞層（外核層）明顯變薄，表明光感受器細胞大量死亡，提示Spata7基因視網(wǎng)膜內(nèi)敲除模型建立成功。該模型的建立，對比傳統(tǒng)意義上利用CRISPR/Cas9技術構建Spata7基因敲除鼠，獲得的效果等同，即敲除后早期即發(fā)生光感受器細胞大量死亡。但本模型的優(yōu)勢在于定點敲除視網(wǎng)膜內(nèi)的Spata7基因，而全身其他器官的Spata7基因則被保留，因此，不影響小鼠發(fā)育及其他器官功能，尤其是公鼠的睪丸功能，保證了敲除鼠的生育能力。同時，該方法與利用Cre-Loxp系統(tǒng)構建的選擇性敲除鼠相比，優(yōu)勢在于耗時少，方法簡單，不需要進行篩選［17-18］，既避免了全身敲除對小鼠其他器官功能帶來傷害，又大幅節(jié)省了研究時間，提高了研究效率。同為運用AAV作為載體搭載CRISPR/Cas9系統(tǒng)進入視網(wǎng)膜，另一研究團隊用此方法對小鼠RHO基因進行了敲除，但其AAV對視網(wǎng)膜的感染效率僅為30%，目的基因的敲除效率也隨之顯著降低［19］。而本研究通過改進小鼠視網(wǎng)膜下腔注射的進針角度，大幅提高了AAV感染效率。小鼠視網(wǎng)膜下腔注射常規(guī)進針角度與水平面成45°，但本研究組發(fā)現(xiàn)由于出生14 d小鼠與成年鼠眼位有細微差別，導致斜行45°進針并不能保證注射位點靠近視網(wǎng)膜后極部，從而導致AAV感染效率降低，故將進針角度調(diào)高至75°～80°，保證了注射位點靠近后極部，大幅度提高了AAV對視網(wǎng)膜的感染效率（80%），保證了CRISPR/Cas9系統(tǒng)對Spata7基因的有效敲除。

本研究對Spata7基因視網(wǎng)膜內(nèi)敲除1個月后光感受器細胞的死亡機制進行了探討。結果顯示，RHO在實驗組小鼠AAV注射眼光感受器細胞內(nèi)節(jié)中呈高表達，提示RHO滯留在光感受器細胞ER內(nèi)。ER應激標記蛋白CHOP在小鼠AAV注射眼光感受器細胞內(nèi)節(jié)中高表達，意味著RHO在ER內(nèi)的聚集引發(fā)了ER應激。說明視網(wǎng)膜內(nèi)敲除Spata7基因后，RHO不能被轉(zhuǎn)運到光感受器細胞外節(jié)，而停留在了ER，造成了ER應激，導致光感受器細胞凋亡。

本研究也存在局限性：僅探討了AAV注射1個月后Spata7基因的敲除情況及敲除后的光感受器細胞死亡情況，關于AAV搭載的CRISPR/Cas9系統(tǒng)對Spata7基因的遠期敲除效應還有待繼續(xù)研究；僅對AAV注射眼和PBS對照眼的光感受器細胞死亡情況和RHO運輸情況進行了比較，未對AAV注射眼內(nèi)不同AAV注射效率區(qū)域之間進行比較；Spata7視網(wǎng)膜內(nèi)的敲除效率還可進一步提高。對此，可將常用的、分子量較大的SpCas9改為近年新發(fā)現(xiàn)的、分子量較小的SaCas9，使Cas9、gRNA和GFP 包裝進入同一AAV載體，以克服AAV載體容量有限不能同時搭載這三者的局限性［20］，同時在此基礎上可設計多個gRNA同步定位Spata7基因，以提高敲除效率。