王 勇，孫 鋒，蘇來曼·艾則孜，李玉玲，伍國紅，駱強偉，郭平峰

(新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所,新疆鄯善 838200)

0 引 言

【研究意義】葡萄是重要的果樹樹種，其栽培面積和產量位居水果第二[1]，葡萄產業(yè)在我國的果樹上占有重要的位置[2]。我國葡萄種質資源豐富，國家果樹種質鄭州圃、山西圃、左家圃收集保存國內外野生資源、地方品種、育成品種等各類葡萄種質資源3 395份次。我國自20世紀50、60年代起至今累計培育出葡萄品種(系)200多個[3]。目前對葡萄等非主要農作物品種關注不夠[4]。開展品種鑒定與譜系分析方法研究，對種苗認證、品種登記和植物新品種保護有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】果樹傳統(tǒng)的種質資源的鑒定方法有形態(tài)學、孢粉學、細胞學[5]、同工酶[6]等，這些方法因受環(huán)境、品種或技術等方面的影響，不能快速、準確、有效地完成品種資源間的鑒定[5,6]。TP-M13-SSR(simple sequence repeat with tailed primer M13)技術是結合熒光測序技術與SSR標記技術開發(fā)的SSR擴增產物熒光測序檢測技術，其檢測結果重復性好、準確性高、且操作程序簡單，是種質資源鑒定的最簡單、有效的方法[7]。目前已應用在葡萄[8-10]、蘋果[6,11-14]、梨[15-17]、桃[5]、櫻桃[18]、棗[19,20]、杏[21]、核桃[22]等果樹的指紋圖譜構建和親緣關系分析中，提高了品種資源的鑒定能力，加強了品種知識產權的保護。【本研究切入點】目前研究培育出了新郁、新雅、新葡1號、火州紫玉等多個品種(系)，其中一些品種已開展了大面積推廣，但到目前為止還未曾利用分子手段開展譜系分析與品種保護方面的研究?！緮M解決的關鍵問題】研究以自育的19個品種(系)葡萄為試材,基于TP-M13-SSR技術，構建指紋圖譜，并編碼建立種質分子身份證，為苗木認證、新品種登記及保護奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 葡萄品種(系)譜系

試驗于2019年5～12月在新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所分子實驗室和葡萄制干鮮食兼用品種改良課題實驗室進行。19份葡萄品種(系)材料均取自新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所葡萄資源圃。表1

表1 19個葡萄品種(系)譜系Table 1 The genealogy of 19 grape varieties (lines)

1.1.2 引 物

選用16對SSR標記引物。其中，VVS2、SCU06、VVMD5、VVMD6、VVMD7、VVMD27、VRZAG29、VRZAG62、VRZAG79等9對引物為國際通用葡萄SSR引物[7]，VCHR15a，VCHR13a，VCHR4a，VRZAG67，VMC7H3，SCU15vv，UDV-088等7對引物為前期工作篩選出的具有較高多態(tài)性信息量(PIC)的引物。引物均由北京擎科生物技術公司合成，每對引物F序列的5’端進行FAM熒光標記修飾。表2

1.2 方 法

1.2.1 葡萄基因組DNA的提取

參照CTAB改良法[23]提取葡萄試材基因組DNA；通過瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的試材基因組DNA的濃度和純度；將DNA溶液分為2份，1份放入攝氏度-20℃冰箱里長期保存，1份放入攝氏度4℃冰箱備用。

1.2.2 反應體系

使用PCR反應體系為：2×TaqMix酶10 μL，SSR雙引物混合液(10 μM/mL)0.8 μL，模板(20 ng/μL)2.0 μL，dd H2O 7.2 μL，總反應體系為20 μL，PTC-100型PCR儀上進行反應。擴增程序參照王勇等[23]的方法，在操作中根據(jù)各引物差異進行體系優(yōu)化。

1.2.3 PCR產物的檢測

利用2%的瓊脂糖凝膠對擴增的PCR產物進行水平電泳檢測，若有擴增結果不理想的，需要進行補充，由生物技術公司通過毛細管電泳檢測產物片段種類和大小。

表2 16對葡萄SSR標記引物序列及其熒光標記Table 2 Sequences and labeled fluoresce of 16 SSR primers

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用PowerMarker v3.25 軟件計算等位基因個數(shù)、 基因型個數(shù)、 等位基因頻率，依據(jù)所得的等位基因頻率，計算各標記位點的多態(tài)性信息含量(PIC)，公式：

Pij是第i個標記位點的第j個等位基因的頻率。

數(shù)據(jù)標準化處理參考陳昌文等[5]的方法。根據(jù)每對引物對不同種質擴增片段對應的分子量大小，按從小到大依次編碼為 1～8。若引物擴增的某一品種有 2 個等位基因時，選擇條帶小的編碼賦值。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA質量檢測

研究表明，基因組 DNA片段完整，濃度很高，能夠做模版，開展PCR擴增。圖1

圖1 試材基因組DNA提取電泳檢測Fig. 1 Results of genomic DNA electrophoresis of the materials

2.2 PCR產物毛細管電泳

研究表明，4對引物擴出了7個多態(tài)性基因片段，4對等位基因型，其中VVS2擴增的基因為純合等位基因，SCU06、VVMD5、VMC7H3為雜合等位基因，4對引物的2次擴增結果均存在輕微差異，試驗的擴增體系和毛細管電泳結果良好。圖2～5，表3

表3 4對引物對新郁重復擴增的毛細管電泳檢測Table 3 The detection results of repeated amplification of Xinyu with 4 pairs of primers

圖2 引物SCU06對新郁葡萄重復擴增的毛細管電泳檢測圖譜Fig. 2 The detection pattern of repeated amplification of Xinyu grape by SCU06 primer

圖3 引物VVS2對新郁葡萄重復擴增的毛細管電泳檢測圖譜Fig. 3 The detection pattern of repeated amplification of Xinyu grape by VVS2 primer

圖4 引物VVMD5對新郁葡萄重復擴增的毛細管電泳檢測圖譜Fig. 4 The detection pattern of repeated amplification of Xinyu grape by VVMD5 primer

圖5 引物VMC7H3對新郁葡萄重復擴增的毛細管電泳檢測圖譜Fig. 5 The detection pattern of repeated amplification of Xinyu grape by VMC7H3 primer

2.3 16對SSR標記PCR擴增

研究表明，利用16對SSR標記引物對19份葡萄種質資源進行擴增，共有69個等位位點，擴增出105個等位基因，平均每個SSR引物有6.56對等位基因，平均每個 SSR 位點有 4.31 個。擴增產物片段大小的變幅為109～252 bp，每個位點的基因型個數(shù)變幅為4(VrZAG29)～16(VRZAG67)。16 對引物中擴增出等位位點數(shù)最多的是VRZAG67，最少的是VrZAG29、SCU15vv和VCHR13a；多態(tài)性信息指數(shù)(PIC)變化范圍為0.28～0.92，平均為0.72；其中引物VRZAG67的 PIC 值最高為0.92，引物 VrZAG29 的 PIC 值最低為0.28。多態(tài)性信息指數(shù)(PIC)是用來衡量 SSR 引物多態(tài)性高低的一個重要指標。按照衡量基因變異程度高低的PIC指標(>0.5 時，為高度多態(tài)性信息引物；在0.25～0.5時，為中度多態(tài)性信息引物；<0.25 時，低度多態(tài)性信息引物)，篩選出的 16 對 SSR 引物，除VrZAG29外，均為高度多態(tài)性引物。15 對SSR引物能以較高的信息量反映出葡萄品種的基因型多樣性水平，可以用于遺傳多樣性水平分析。表4

表4 16對SSR標記引物擴增Table 4 The statistics of amplification results of 16 pairs of SSR marker primers

2.4 19個葡萄品種(系)的指紋條帶

研究表明，每個品種在16個位點上均有純合等位基因和雜合等位基因2種類型，其中新葡1號的純合等位基因最高，12個位點為純合等位基因，比率為75%，SP275居第2，有11個，火州紫玉第3。新雅的雜交等位基因最高，15個位點為雜交等位基因，比率為93.75%，新郁、紫霞居第2，均為14個，SP522、SP137、居第3，均為13個。VRZAG79、VVMD27 2對引物擴增條帶幾乎相同，可能為同一基因位點。SP4614具有3個特異等位基因(VVS2-143、SCU06-177、VVMD7-250)，SP6164、SP8028、SP10140各具有一個特異等位基因(分別為VVMD7-242、VRZAG79-182、VrZAG62-191)。表5～7

表5 19個葡萄品種(系)的指紋條帶Table 5 The fingerprint bands of 19 grape varieties (lines)

表6 19個葡萄品種(系)的指紋條帶Table 6 The fingerprint bands of 19 grape varieties (lines)

表7 16對葡萄SSR標記引物對19個葡萄品種(系)擴增的等位基因雜合度Table 7 The statistics of allele heterozygosity of 19 grape varieties (lines) amplified by 16 pairs of SSR marker primers

2.5 構建19個自育葡萄品種(系)指紋圖譜

研究表明，16對引物中擴增最多的等位基因數(shù)為8，故賦值范圍為1～8。取位點小的進行分子編碼，給分子身份證字符串的每位上賦予1個字符。對19份供試葡萄品種進行分子編碼，用選取的 5對引物可以將19個品種(系)進行有效區(qū)分。選擇多態(tài)性信息較高的引物5對，構建指紋圖譜。表8～10

表8 16對葡萄SSR標記引物對19個葡萄品種(系)擴增結果Table 8 The amplification results of 19 grape varieties (lines) with 16 pairs of SSR marker primers

表9 19個葡萄品種(系)的指紋圖譜Table 9 The fingerprint of 19 grape varieties (lines)

表10 SSR引物組合對葡萄品種(系)的區(qū)分Table 10 Differentiation of grape varieties (lines) by SSR primer combinations

按照引物多態(tài)性信息量(PIC)的高低順序對品種進行區(qū)分，引物VRZAG67(PIC為0.92)能夠區(qū)分SP137、SP10140 2個品系，VRZAG67+VVS2可以區(qū)分9個品種(系)，VRZAG67+VVS2+SCU06仍是區(qū)分9個品種(系)，VRZAG67+VVS2+SCU06+VVMD7可以分區(qū)13個品種(系)，VRZAG67+VVS2+SCU06+VVMD7+VCHR4a可以分區(qū)17個品種(系)，VRZAG67+VVS2+SCU06+VVMD7+VCHR4a+VCHR15a仍是分區(qū)17個品種(系)，最后在增加引物VVMD5才能將紫霞和新雅區(qū)別開來，這說明紫霞與新雅的親緣關系很近。第3對引物SCU06和第6對引物VCHR15a在19個品種(系)的區(qū)分上，沒有實際意義，按照最簡原則，將兩者去除，最終5對引物能夠實現(xiàn)19個品種(系)的鑒別，使用5位數(shù)進行數(shù)字編碼賦值。表11

表11 19個葡萄品種(系)分子身份證編碼Table 11 Molecular ID code of 19 Variety (line)

3 討 論

SSR標記是一種既具有高穩(wěn)定性又具有高準確性的分子標記[24]，在果樹品種資源鑒定中具有重要的應用價值。在蘋果上，張春雨等[11]采用SSR分子標記構建了新疆野蘋果核心種質。金萬梅等[12]利用SSR標記開展了蘋果矮化砧木SH系鑒定，探明了7 份SH系的“同物多名”、“異物同名”問題。高源等[6,14]利用3對TP-M13-SSR標記完成了國家果樹種質興城梨、蘋果圃保存的 131 份蘋果地方品種、育成品種及其野生近緣種區(qū)分，利用6對TP-M13-SSR標記完成了314份來自19個國家的蘋果栽培品種的區(qū)分。在梨上，張東等[15]利用6對SSR引物對 29個砂梨品種或類型做了親緣關系分析。高源等[16]利用SSR熒光標記構建中國建國以后選育的92個梨品種指紋圖譜，為品種鑒別提供依據(jù)。魯敏等[17]采用10對EST-SSR 引物和9個果實品質性狀指標對收集的220份野生刺梨資源的遺傳多樣性進行了分析。在桃上，陳昌文等[5]利用8對SSR標記核心引物構建了173份中國桃主要品種資源及其野生近緣種的分子身份證。在櫻桃，艾呈祥等[18]構建了24個甜櫻桃主要栽培品種SSR指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。在棗上，麻麗穎等[19]利用12對SSR引物構建了36份棗品種SSR指紋圖譜，為棗樹分類、種質鑒定和分子育種提供了重要的工具。王斯琪等[20]用SSR標記進行棗樹子代自然授粉實生苗父本鑒定。在杏上，劉娟等[21]利用4對ISSR引物構建了48個新疆主栽杏品種(系)指紋圖譜庫。在核桃上，周貝貝等[22]采用表型性狀和 SSR 標記的方法建立核桃親子鑒定方法。在葡萄上，王慧玲等[9]利用9對國際通用SSR標記引物構建了13個中國葡萄優(yōu)新品種的分子身份證。馬亞茹等[10]開發(fā)了葡萄無核性狀的SSR分子標記VvSD10，這將對葡萄雜種后代進行早期無核性狀鑒定，為分子標記 輔助育種奠定基礎。郭大龍等[8]利用SSR分子標記技術構建了48份葡萄核心種質。利用16對SSR標記引物研究了19個自育葡萄品種(系)基因型和遺傳多樣性，從中篩選出5對核心引物構建了指紋圖譜和分子身份證。

9對國際通用SSR標記引物[7]除VRZAG29外均能在19份實驗材料中表現(xiàn)較高的PIC值，前期篩選的7對引物也均表現(xiàn)出了較高的PIC值，其中VRZAG67的為0.92，高于任何國際通用SSR標記引物的。為實現(xiàn)利用最少引物組合，區(qū)分最多材料的目的，文中按照PIC值高低選擇SSR標記引物開展19份品種材料鑒定，發(fā)現(xiàn)SCU06在新葡1號、紫霞、新雅、火州紅玉、火州黑玉、SP522、SP122、SP8028、SP891、SP115等10份材料上不存在多態(tài)性，VCHR15a在紫霞、新雅等2份材料上不存在多態(tài)性，最終篩選出了5對SSR標記。其中VRZAG67、VCHR4a為自選引物，VVS2、VVMD7、VVMD5為國際通用引物。這說明國際通用引物不是萬能的，在一些近緣品種間的高效鑒定時存在局限性。

葡萄是一種具有高度雜合性的果樹樹種[25]。文中16對SSR標記引物在19個品種(系)中擴增出了不同類型的基因型，出現(xiàn)了較高比率的雜合等位基因型，比如，新雅的為15/16、新郁和紫霞均為14/16，但也出現(xiàn)了一些純合比率較高的類型，比如新葡1號為12/16、SP275為11/16，但這些基因型均表現(xiàn)為純合與雜交的混合類型，這體現(xiàn)了葡萄的雜合特性。

4 結 論

采用16對SSR標記引物研究了19個自育葡萄品種(系)基因型和遺傳多樣性，從中檢測出69個等位位點，105個等位基因，并認為新雅、新郁、紫霞等3個品種雜合度相對較高，新葡1號，SP275等2個品種(系)相對純合度較高，但均為雜合類型品種(系)。

從16個SSR標記引物篩選出5對多態(tài)性信息量相對較高的引物，完成了19個品種(系)的鑒定，構建指紋圖譜，并編碼賦值，形成了分子身份識別碼，為品種(系)間的鑒定與區(qū)分提供了依據(jù)。但由于葡萄種質共有上千余份，構建的種質分子身份證已經(jīng)有5位，如果繼續(xù)對更多的品種構建分子身份證，需要增加 SSR 引物數(shù)量，增加分子身份證的位數(shù)。