廖小立 陶宏婷 吳端生 姚 峰 陳科潔

(1.湖南交通工程學(xué)院,衡陽 421001)(2.湖南省永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,永州 425100)(3.南華大學(xué)實驗動物學(xué)部,衡陽 421001)

銫-137(137Cs)是一個在核反應(yīng)堆裂變產(chǎn)生的放射性核素,很容易在水和空氣中傳播,其半衰期為30年,按放射性核素的毒性分組,137Cs屬于中度毒性核素,能釋放出β和γ兩種射線。隨著核工業(yè)的發(fā)展和核電站核泄漏事故的發(fā)生,137Cs-γ對環(huán)境已經(jīng)構(gòu)成了一定的危害。研究137Cs-γ輻射的生物效應(yīng),有益于核輻射污染監(jiān)測與防護[1]。

擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)是 Vos等人于1995年創(chuàng)建的一種分子標記技術(shù)[2]。AFLP是一種評估生物種群間或種群內(nèi)遺傳變異的高度可靠的遺傳標記,已成功地應(yīng)用于多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的遺傳多態(tài)性分析[3-4],也有少量文獻報道將AFLP標記應(yīng)用到環(huán)境污染物或核輻射脅迫下的遺傳毒性效應(yīng)檢測中[5-8]。本文研究137Cs-γ輻照對實驗紅鯽AFLP多態(tài)性的影響,探討AFLP標記應(yīng)用到輻射生物監(jiān)測的可行性,為推廣實驗紅鯽在環(huán)境安全性評價中的應(yīng)用積累實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗魚及飼養(yǎng)

2年齡的實驗紅鯽 C1HD系,50尾,雌雄各半,平均體長115 mm,平均質(zhì)量34.6 g,養(yǎng)殖用水為曝氣3天的自來水,水溫(20.4±1)℃、pH值(6.84±0.4)、溶氧量(6.21±0.4)mg/L。遺傳質(zhì)量均符合湖南省地方標準[9],由南華大學(xué)實驗動物學(xué)部提供。

1.2 主要儀器及試劑

HXFS-IA生物輻照儀:中國核工業(yè)集團;水平電泳槽(DYCP-38B):北京市六一儀器廠;凝膠成像系統(tǒng):Tanon;紫外可見分光光度計(UV2450):SHIMADZU(日本);梯度 PCR儀:Bio-rad(美國)。AFLP引物:由上海生工公司合成。瓊脂糖:Spanish;甲酰胺加樣緩沖液:leagene;SDS,λDNA/HindⅢ:購于北京天根公司;6×DNA buffer、2×Taq Master Mix、100 bp DNA Ladder、50 bp DNA Ladder、DNA提取試劑盒,均購于康為世紀公司;EcoRⅠ、TrulⅠ(MseⅠ),購于 MBI。T4DNA連接酶、T4DNA連接酶緩沖液,購于Thermo;溴化乙錠(EB),購于上海生工公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組及處L:根據(jù)前期急性毒性試驗獲得的實驗紅鯽137Cs-γ輻照半數(shù)致死劑量(LD50為31.05 Gy)[10],實驗紅鯽隨機分為5組,10尾/組,即空白對照組,1/16 LD50(1.94 Gy)輻照組、1/8 LD50(3.88 Gy)輻照組、1/4 LD50(7.76 Gy)輻照組、1/2 LD50(15.53 Gy)輻照組。輻照處L組均用HXFS-IA生物輻照儀按實驗分組所需劑量的137Cs-γ一次性輻照,劑量率為47.79 cGy/min,魚體照射面積約5 000 mm2。參照文獻[11]介紹的方法進行操作。

實驗紅鯽被輻照后,再喂養(yǎng)7～14 d。在第 7天和第14天時,每組隨機取實驗紅鯽3尾,活體尾靜脈取血,提取全基因組 DNA,用于 AFLP-PCR實驗。

1.3.2 基因組DNA提取及濃度檢測:基因組DNA的提取參照標準酚-氯仿抽提法進行[12]。用核酸測定儀測量230 nm、260 nm、280 nm光吸收度(A),根據(jù)A260/A280和A260/A230比值,計算 DNA的濃度。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 AFLP-PCR分子標記檢測:①基因組 DNA酶切-連接:AFLP所用接頭和引物由上海生工合成。采用EcoRⅠ、TrulⅠ限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶進行紅細胞基因組的雙酶切-連接。反應(yīng)體系40μL含基因組 DNA(50 ng/μL)5μL,10×T4DNA連接酶 buffer 4μL,10×buffer Tango 4μL,ATP(10 mmol/L)1μL,EcoRⅠ接頭(5μmol/L)1μL,EcoRⅠ接頭(5μmol/L)1μL,EcoRⅠ(10 U/μL)0.5μL,TrulI(10 U/μL)0.5μL,T4DNA連接酶(5 U/μL)0.4μL,ddH2O 22.6μL。 37℃ 酶切連接,過夜,結(jié)束后65℃溫育20 min,-20℃保存或用于擴增。

②連接產(chǎn)物預(yù)擴增:在預(yù)擴增的25μL反應(yīng)體系中含:稀釋后的連接產(chǎn)物5μL,引物各 1μL,2×Taq PCR m ix 12.5μL,ddH2O 5.5μL。PCR擴增條件:94℃變性2 min,94℃,30 s、56℃,30 s、25 個循環(huán),72℃延伸5 m in。-20℃保存。

③選擇性擴增:將擴增產(chǎn)物按1∶20稀釋,作為選擇性擴增的模板。每管25μL,選擴體系中含:稀釋后的預(yù)擴增產(chǎn)物5μL,EcoRⅠ引物1μL,TrulⅠ引物2μL,2×Taq PCR m ix 12.5μL,ddH2O 4.5μL。PCR擴增條件:94℃變性2 min,第一輪擴增參數(shù):94℃、30 s,65℃、30 s,72℃、120 s,以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7℃,擴增 13個循環(huán);接著按 94℃、30 s,56℃、30 s,72℃、120 s擴增23個循環(huán);72℃延伸5 min。-20℃保存。

④AFLP產(chǎn)物的凝膠電泳:預(yù)擴增和選擇性擴增的產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。選擇性擴增反應(yīng)完成后,在垂直電泳儀上用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后銀染,顯影,讀取條帶。

1.4 統(tǒng)計方法

運用Quantity one軟件分析條帶有無,有擴增條帶計為“1”,無擴增條帶計為“0”,將 AFLP擴增圖譜轉(zhuǎn)化為0、1矩陣,統(tǒng)計分析AFLP標記PCR擴增產(chǎn)物圖譜、擴增條帶數(shù)、擴增片段大小。用PopGene軟件統(tǒng)計不同個體、不同處L組以及不同時間的多態(tài)性位點數(shù)、基因多態(tài)性信息含量(PIC)、基因雜合度(H)、香農(nóng)信息指數(shù)(I)。用 Origin 8.0作圖軟件統(tǒng)計分析多態(tài)性信息含量和基因雜合度。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同引物擴增條帶的變化

不同引物擴增條帶的統(tǒng)計結(jié)果見表1。結(jié)果分析表明,在輻照處L組中,條帶數(shù)目有明顯的變化,或缺失或增加。隨著輻照時間和劑量的增加,會擴增出一些新的條帶,一些條帶會變淡或消失,在高劑量組的多態(tài)性條帶數(shù)增加趨勢明顯。各輻照處L組擴增條帶染色顯示,條帶的顏色隨處L時間的延長而減弱,隨處L劑量的增加而增強。

2.1.1 引物E-AAC/T-CAG擴增條帶的變化:結(jié)果表明,對照組實驗紅鯽引物E-AAC/T-CAG的擴增條帶數(shù)為20條,多態(tài)性條帶為11條,擴增片段為63～833 bp;輻照處L組實驗紅鯽引物 E-AAC/TCAG的擴增條帶數(shù)為47條,多態(tài)性條帶為31條,擴增片段為57～844 bp(表1)。

在第7天時1/4LD50(7.76 Gy)劑量輻照處L的實驗紅鯽擴增出的條帶數(shù)目較少,但在第14天時擴增出的條帶數(shù)目明顯增多(圖1)。在第 7天時,1/16LD50(1.94 Gy)、1/8LD50(3.88 Gy)、1/4LD50(7.76 Gy)輻照劑量組的118 bp條帶缺失(圖1,泳道1～3),在其他劑量組的都有(圖1泳道5箭頭,泳道4～8),且條帶顏色隨輻照處L時間的延長和輻照處L劑量的增加而加深。在第7天,1/2LD50(15.53 Gy)劑量輻照處L的實驗紅鯽,一條195 bp的條帶消失(圖 1,泳道 8);在第 14天,1/16LD50(1.94 Gy)、1/8LD50(3.88 Gy)、1/4LD50(7.76 Gy)劑量輻照處L組,這一條帶也缺失(圖1,泳道 5～7)。在第7天時,1/4LD50(7.76 Gy)輻照劑量輻照的實驗紅鯽沒有擴增出284 bp的條帶(圖 1,泳道4)。另外,在第14天擴增出一條358 bp的條帶(圖1,泳道 7)。

表1 實驗紅鯽8對AFLP引物PCR擴增后的多態(tài)性信息含量Table 1 PIC of 8 pairs of AFLP primers amplified by PCR in laboratory red crucian carp

圖1 引物E-AAC/T-CAG對不同劑量137 Cs-γ輻照處理的實驗紅鯽擴增的SDS-PAGE電泳圖譜M:100 bp DNA Marker;1～4:第 7天輻照組;5～8:第14天輻照組;9:對照組1、5 ∶1/16LD50(1.94 Gy);2、6 ∶1/8LD50(3.88 Gy);3、7 ∶1/4LD50(7.76 Gy);4、8 ∶1/2LD50(15.53 Gy)Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis patterns of am p lified p roducts by Prim er com bination E-AAC/T-CAG used inAFLP in laboratory red crucian carp exposed to different dose of 137 Cs-γirrad iationM:100 bp DNA Marker;1-4:7 d and 5-8:14 d after exposed to different dose of 137 Cs-γirradiation;9:the control group

2.1.2 引物E-ACC/T-CTC擴增條帶的變化:結(jié)果表明,對照組實驗紅鯽引物E-ACC/T-CTC的擴增條帶數(shù)為19條,多態(tài)性條帶為8條,擴增片段為84～885 bp;輻照處L組實驗紅鯽引物E-ACC/T-CTC的擴增條帶數(shù)為49條,多態(tài)性條帶為37條,擴增片段的分子量為77～987 bp。與對照組相比,輻照處L組均擴增出一條654 bp條帶(圖 2,泳道 3),第 14天的528 bp的條帶消失(圖 2,泳道 4),在第 7天1/16LD50(1.94 Gy)輻照劑量輻照的實驗紅鯽一條105 bp的條帶消失(圖2,泳道5)。

圖2 引物E-ACC/T-CTC對不同劑量137 Cs-γ輻照處理的實驗紅鯽擴增的SDS-PAGE電泳圖譜M:100 bp DNA Marker;1～4:第 7天輻照組;5～8:第14天輻照組;9:對照組1、5:1/16LD50(1.94 Gy);2、6:1/8LD50(3.88 Gy);3、7:1/4LD50(7.76 Gy);4、8:1/2LD50(15.53 Gy)Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis patterns of am p lified p roducts by Prim er com bination E-ACC/T-CTC used in AFLP in laboratory red crucian carp exposed to different dose of 137 Cs-γirrad iationM:100 bp DNA Marker;1-4:7 d and 5-8:14 d after exposed to different dose of 137 Cs-γirradiation;9:the control group

2.1.3 引物E-ACA/T-CTC擴增條帶的變化:結(jié)果表明,對照組實驗紅鯽引物E-ACA/T-CTC的擴增條帶數(shù)為18條,多態(tài)性條帶為7條,擴增片段為80～914 bp;輻照處L組實驗紅鯽引物E-ACA/T-CTC擴增出32條帶,多態(tài)性條帶為21條,擴增片段為78～926 bp。

輻照處L第14天與第7天比,擴增條帶增加,并另擴增出了一條334 bp的條帶(圖 3,泳道 7)。在第7天時,1/16LD50(1.94 Gy)劑量輻照處L的擴增出一條482 bp的條帶(圖3,泳道1),一條246 bp的條帶消失(圖 3,泳道 2)。第 14天時,1/8LD50(3.88 Gy)輻照劑量輻照的實驗紅鯽擴增出了20條帶,多態(tài)性條帶為 14條,多態(tài)性為 70%,為高度多態(tài)性。

圖3 引物E-ACA/T-CTC對不同劑量137 Cs-γ輻照處理的實驗紅鯽擴增的SDS-PAGE電泳圖譜1、5:1/16LD50(1.94 Gy);2、6:1/8LD50(3.88 Gy);3、7:1/4LD50(7.76 Gy);4、8:1/2LD50(15.53 Gy)M:100 bp DNA Marker;1～4:第 7天輻照組;5～8:第14天輻照組;9:對照組Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis patterns of amplified products by Primer combination E-ACA/T-CTC used in AFLP in laboratory red crucian carp exposed to different dose of 137 Cs-γ irradiationM:100 bp DNA Marker;1-4:7 d and 5-8:14 d after exposed to different dose of 137 Cs-γ irradiation;9:the control group

2.1.4 引物E-ACT/T-CAG擴增條帶的變化:結(jié)果表明,對照組實驗紅鯽的擴增條帶數(shù)為25條,多態(tài)性條帶為11條,擴增片段為78～909 bp;輻照處L組實驗紅鯽的擴增出32條帶,多態(tài)性條帶為20條,擴增片段為 74～919 bp。1/16LD50(1.94 Gy)輻照劑量輻照的實驗紅鯽,第7天時的擴增條帶最多,為28條,多態(tài)性條帶為15條,1/4LD50(7.76 Gy)輻照劑量輻照的實驗紅鯽第14天時的擴增出24條條帶,多態(tài)性條帶為16條,多態(tài)性最高。

在輻照處L組中,第7天時的擴增出一條514 bp的條帶(圖4,泳道3)和一條160 bp的條帶(圖4,泳道4),卻在第14天時該兩條帶消失。在第7天時的1/16 LD50(1.94 Gy)和第14天時的1/8 LD50(3.88 Gy)、1/4LD50(7.76 Gy)、1/2LD50(15.53 Gy)劑量輻照處L的實驗紅鯽,均擴增出了一條74 bp的條帶(圖4,泳道6)。在對照組,實驗紅鯽擴增出了一條148 bp的條帶(圖4,泳道9)。

圖4 引物E-ACT/T-CAG對不同劑量137 Cs-γ輻照處理的實驗紅鯽擴增的SDS-PAGE電泳圖譜M:100 bp DNA Marker;1～4:第7天輻照組;5～8:第14天輻照組;9:對照組1、5:1/16LD50(1.94 Gy);2、6:1/8LD50(3.88 Gy);3、7:1/4LD50(7.76 Gy);4、8:1/2LD50(15.53 Gy)Fig.4 SDS-PAGE electrophoresis patterns of amplified products by Primer combination E-ACT/T-CAG used in AFLP in laboratory red crucian carp exposed to different dose of 137 Cs-γ irradiationM:100 bp DNA Marker;1-4:7 d and 5-8:14 d after exposed to different dose of 137 Cs-γ irradiation;9:the control group

2.2 AFLP標記的遺傳多樣性

通過對8對AFLP引物PCR擴增后的條帶數(shù)的多態(tài)性信息進行統(tǒng)計分析,結(jié)果如表1和圖5、圖6、圖7所示。其中,對照組的實驗紅鯽,8對 AFLP引物進行PCR擴增后,多態(tài)性信息含量平均值為45.20%,輻照處L組的實驗紅鯽,多態(tài)性信息含量達到 72.27%。對照組的引物 E-ACA/T-CTC、EACT/T-CTC擴增后多態(tài)性含量最低,為38.89%;在輻照處L后多態(tài)性升高,多態(tài)性含量達到65.62%和78.95%。輻照處L組的引物E-ACT/T-CAG擴增后多態(tài)性含量最低,為62.60%;對照組的引物EAAC/T-CAG擴增后多態(tài)性含量最高,達到55.00%;輻照處L組的引物 E-ACC/T-CTC擴增后多態(tài)性含量最高,達到82.22%,為高度多態(tài)性。

對照組實驗紅鯽的Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s多樣性指數(shù)(I)分別為0.19和0.28,在輻照處L組的實驗紅鯽中分別為0.28、0.41,輻照處L組的遺傳多樣性較高。在輻照處L組中,第7天1/16LD50(1.94 Gy)輻照劑量組的 Nei’s基因多樣性指數(shù)和 Shannon’s多樣性指數(shù)為 0.20和0.29,遺傳多樣性最低;第14天1/8 LD50(3.88 Gy)和1/4LD50(7.76 Gy)輻照劑量組的Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon’s多樣性指數(shù)為0.24和0.35,遺傳多樣性最高。隨著輻照劑量的增加,Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s多樣性指數(shù)(I)增加,遺傳多樣性豐富。

圖5 實驗紅鯽8對AFLP引物PCR擴增后的多態(tài)性信息含量Fig.5 PIC of 8 pairs of AFLP primers amplified by PCR in laboratory red crucian carp

圖6 不同劑量137 Cs-γ輻照處理的實驗紅鯽的PICFig.6 Gene polymorphism content of Laboratory red crucian carp exposed to different radiation dose of 137 Cs-γ

3 討論

AFLP技術(shù)是基因組分析的L想分子標記[13]。本實驗運用AFLP技術(shù)分析實驗紅鯽受137Cs-γ輻照后的DNA多態(tài)性變化,結(jié)果顯示出較多的多態(tài)性條帶,進一步表明了AFLP技術(shù)在基因組分析中的有效性。本實驗發(fā)現(xiàn),經(jīng)137Cs-γ輻照處L組后,顯示AFLP擴增條帶數(shù)缺失或增加,反映出了AFLP多態(tài)性的改變。表明AFLP技術(shù)能檢測到較為豐富的基因變異,具有靈敏度高和多態(tài)性信息含量高的特點。這種現(xiàn)象與 Kwon等[14]、Lai等[15]、Kurowska等[16]研究的結(jié)果類似。

基于AFLP技術(shù)較高靈敏度,不少學(xué)者也將AFLP用于核輻射致DNA的AFLP多態(tài)性研究。如Shi等[17]研究了太空飛行和低劑量重離子輻射對水稻基因組多態(tài)性變化。Lombardi等[18]分析了 UVA(紫外線)暴露下的土壤細菌的DNA多態(tài)性。研究表明,AFLP標記可作為DNA核輻射損傷評估的有效生物標記。本實驗也證實,AFLP技術(shù)可用于檢測實驗紅鯽受低劑量137Cs-γ輻照損傷的遺傳效應(yīng)。

圖7 不同劑量137 Cs-γ輻照處理的實驗紅鯽的基因雜合度Fig.7 Gene heterozygosity of Laboratory red crucian carp exposed to different radiation dose of 137 Cs-γ

本實驗結(jié)果也表明,如同文獻[6,16,19-22]一樣,137Cs-γ輻照能引起AFLP特征帶的增多、缺失和條帶亮度的強弱變化。作者認為,出現(xiàn)這種現(xiàn)象,一方面可以解釋為137Cs-γ輻照對實驗紅鯽可能產(chǎn)生了DNA分子損傷或突變,如造成DNA(單鏈、雙鏈)斷裂、堿基損傷、糖基損傷、DNA交鏈等[23];另一方面顯示與137Cs-γ輻照應(yīng)激響應(yīng)的相關(guān)基因被誘導(dǎo)或阻遏的可能。Lahcen等[22]2013年觀察電離輻射對斑馬魚基因表達的長期影響,認為斑馬魚對長期電離輻射的反應(yīng)包括誘導(dǎo)細胞因子、炎癥調(diào)節(jié)因子和轉(zhuǎn)錄生長因子等。Zhou等[6]認為,錳毒性可導(dǎo)致許多新的基因參與生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳水化合物和蛋白質(zhì)的代謝、應(yīng)激反應(yīng)和細胞運輸?shù)取；赑CR的原L,這些DNA損傷可以由RAPD(random amplified polymorphic DNA)、 AFLP、 DGGE(denaturing gradient gelelectrophoresis)、 cDNAAFLP、PCR-焦磷酸測序等方法進行檢測[24-25]。

本實驗所用的實驗紅鯽是本實驗室培育的標準化實驗紅鯽C1HD系[9],它既可以作為判斷水源污染的一種優(yōu)良指示生物,也是一種水生態(tài)毒L學(xué)研究的優(yōu)良實驗魚?，F(xiàn)在和過去的應(yīng)用研究表明,實驗紅鯽可用于水生態(tài)毒L學(xué)等研究[26-29],包括有關(guān)電離輻射的生物監(jiān)測。