鐘宇辰 王詩(shī)淳 趙 峰 張婷婷 陳 萌 施 萍 龐希寧

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,沈陽(yáng) 110122)(2.沈陽(yáng)艾米奧生物工程技術(shù)研發(fā)中心有限公司,沈陽(yáng) 110015)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)作為一種常見(jiàn)的多因素老年骨關(guān)節(jié)慢性退行性病變,其主要的病L過(guò)程包括關(guān)節(jié)軟骨破壞,滑膜炎癥,軟骨下骨破壞和骨贅形成,由其產(chǎn)生的功能障礙和疼痛,嚴(yán)重影響了中老年人的健康與生活質(zhì)量。有研究顯示,80%～90%的65歲以上老年人都會(huì)存在骨關(guān)節(jié)炎樣軟骨改變[1]。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示[2],美國(guó)大于60歲的老年人群中,有癥狀的OA患者大約占總?cè)巳簲?shù)的10%,成為美國(guó)老年人群中最多發(fā)的骨關(guān)節(jié)疾病。隨著我國(guó)人口老齡化[3]與肥胖率[4]的不斷提高,OA患病率將會(huì)逐步升高。

由于損壞的膝關(guān)節(jié)軟骨本身血管稀少,再生能力弱[5],導(dǎo)致非手術(shù)治療主要目的在于控制疼痛和保護(hù)僅剩的關(guān)節(jié)功能,等到疾病晚期,外科手術(shù)關(guān)節(jié)置換成為唯一的治療方法,而對(duì)于引導(dǎo)膝關(guān)節(jié)修復(fù)的治療還未開(kāi)展,有很大的研究前景[6]。利用哺乳動(dòng)物的制作骨關(guān)節(jié)炎模型的方法已經(jīng)相對(duì)成熟,如大鼠的Hulth法,碘乙酸(monoiodoacetic acid,M IA)注射,單純前交叉韌帶切斷法等[7]。由于這些方法主要是通過(guò)機(jī)械磨損的方法獲得OA模型,其造模時(shí)間就相對(duì)較長(zhǎng),并且還存在術(shù)后感染、手術(shù)創(chuàng)傷等易影響模型生化代謝的因素。M IA作為3-磷酸脫氫酶抑制劑,可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞迅速死亡,因此MIA注射作為大鼠骨關(guān)節(jié)造模的快速方法,廣泛應(yīng)用于大鼠骨關(guān)節(jié)炎疼痛方面的研究[8],但尚缺少在小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。為更好地研究OA的病L生L過(guò)程,為臨床治療OA給予參考。本實(shí)驗(yàn)初步探討了通過(guò)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA建立小鼠OA模型的可能性,并對(duì)不同劑量的MIA構(gòu)建的小鼠OA模型進(jìn)行比較研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫L委員會(huì)審批。所有實(shí)驗(yàn)操作根據(jù)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處L操作進(jìn)行。自遼寧長(zhǎng)生生物有限公司購(gòu)買(mǎi)6～8周齡雄性 C57BL/6小鼠 52只(合格證號(hào)211002300041841),體質(zhì)量(20±1.1)g,SPF 級(jí)動(dòng)物房室溫飼養(yǎng),晝夜規(guī)律交替(12 h/12 h),給予充足水,食物,給予自由活動(dòng)空間。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行OA造模。

使用試劑:MIA、戊巴比妥鈉、HE染色試劑盒、番紅O-固綠染色試劑盒、75%酒精、10%多聚甲醛。

1.2 方法

C57BL/6小鼠隨機(jī)分為 4組,每組 13只:①0.025 mg/0.05 mg組;②0.1 mg/PBS組;③0.2 mg/空白組;④0.5 mg/空白組[9]。戊巴比妥鈉麻醉后應(yīng)用眼科剪剔除膝關(guān)節(jié)處毛發(fā),行關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射術(shù),注射前用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠初始膝關(guān)節(jié)寬度。將不同質(zhì)量MIA溶于10μL的 PBS中注入膝關(guān)節(jié),在右側(cè)外方髕韌帶與髕骨旁韌帶中間縫隙處進(jìn)針,直至針頭碰到股骨內(nèi)上髁?xí)r,回退2 mm,然后注入MIA溶液,PBS對(duì)照組注入10μL PBS,空白對(duì)照組將針刺入關(guān)節(jié)腔內(nèi)不做注射。注射完畢后,確保麻醉蘇醒和動(dòng)物存活的情況下將小鼠放回籠內(nèi),保證充足食物飲水和活動(dòng)空間。

1.3 組織取樣與數(shù)據(jù)測(cè)量

分別于膝關(guān)節(jié)注射后1 d、4 d、1周、2周和 4周測(cè)量小鼠膝關(guān)節(jié)寬度,并于1周、2周、4周測(cè)量各組小鼠質(zhì)量,同時(shí)每組各取3只小鼠,脫頸致死,解剖膝關(guān)節(jié)進(jìn)行大體觀察評(píng)分(表1)[9]。評(píng)分時(shí)脛骨內(nèi)外側(cè)髁狀突均進(jìn)行評(píng)分,取兩側(cè)中分?jǐn)?shù)高者作為此關(guān)節(jié)的大體評(píng)分。

表1 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Scoring Standard

1.4 組織學(xué)測(cè)量

取出膝關(guān)節(jié)后,剔除多余肌肉組織,4%多聚甲醛固定后14%EDTA脫鈣21 d,每4 d換液一次,30%蔗糖溶液脫水24 h,然后進(jìn)行OCT膠包埋冰凍切片,行矢狀位切片后HE染色與番紅O-固綠染色,番紅O-固綠染色切片請(qǐng)2位實(shí)驗(yàn)員分開(kāi)采用國(guó)際OA研究學(xué)會(huì)(Osteoarthritis Research Society Internation,OARSI)分級(jí)制度評(píng)分(表2)[10]

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行兩組實(shí)驗(yàn)資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,進(jìn)行t檢驗(yàn),P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 OARSI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 OARSI Scoring Standard

2 結(jié)果

2.1 造模后小鼠的基本情況

經(jīng)過(guò)注射后0.5～1 h后,所有小鼠均蘇醒,能自由在籠內(nèi)活動(dòng)、飲食。小鼠平均體質(zhì)量從注射前(22.079±1.50)g增加為 28 d之后的(22.713±1.50)g(表3)。 28 d后小鼠均存活,活動(dòng)基本正常,無(wú)特殊體態(tài)。

表3 小鼠平均體質(zhì)量Table 3 Average w eight of m ice

2.2 膝關(guān)節(jié)寬度

經(jīng)過(guò)注射后,各組的膝關(guān)節(jié)均有腫脹,膝關(guān)節(jié)寬度測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表4所列。其中較大劑量組(≥0.1 mg)膝關(guān)節(jié)與較小劑量組(<0.1 mg)相比腫脹明顯(P<0.05),1 d后關(guān)節(jié)腫脹開(kāi)始消退,直到1周后除0.5 mg組以外其余各組差異不顯著。給藥后1 d,0.5 mg組關(guān)節(jié)寬度顯著高于0.1 mg組與0.2 mg組(P<0.05);給藥2周后,各組之間膝關(guān)節(jié)寬度差異不顯著(P>0.05)。給藥4周后,較小劑量組(<0.1 mg)也分別有所上升,但并不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,可能與小鼠本身發(fā)育增長(zhǎng)有關(guān)。

表4 膝關(guān)節(jié)寬度Table 4 Knee joint width

2.3 大體觀察評(píng)分

注射MIA 1周、2周、4周之后,獲取小鼠膝關(guān)節(jié)進(jìn)行拍照并對(duì)其大體評(píng)分進(jìn)行分析,由圖1可知,破壞主要居中在靠中心位置的骨關(guān)節(jié)面上,以小的軟骨缺損為主。由表5可知,除PBS組外各組的評(píng)分都有所增加,1周時(shí)0.2 mg組與0.5 mg組大體破壞較大(P<0.05),2周時(shí)0.1 mg組也出現(xiàn)了較大的損傷(P<0.05),4周時(shí)0.05 mg組也出現(xiàn)較大損傷(P<0.05),從變化趨勢(shì)來(lái)看,各組初始1周時(shí)評(píng)分差距大,2周之后各組的破壞程度差異明顯縮小,組間差異不明顯(P>0.05),但總體變化趨勢(shì)為2周大體損傷最大,4周之后大體損傷放緩。

表5 膝關(guān)節(jié)大體評(píng)分Table 5 Knee joint score

2.4 組織學(xué)觀察評(píng)分

圖1 膝關(guān)節(jié)損壞照片F(xiàn)ig.1 Photos of the knee joint dam age

注射MIA 1周、2周、4周后,獲取小鼠的膝關(guān)節(jié)切片進(jìn)行HE染色和番紅O-固綠染色(表6、圖2和圖3)。較小劑量組(<0.1 mg)MIA在1周與2周時(shí)主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)面的粗糙和連續(xù)性中斷,而較大劑量組(≥0.1 mg)MIA對(duì)于關(guān)節(jié)面的破壞主要表現(xiàn)為軟骨的缺失和破碎。相較于PBS組的關(guān)節(jié)面,MIA注射后關(guān)節(jié)面軟骨細(xì)胞明顯紊亂、分布不均,番紅無(wú)法染色。從組織學(xué)評(píng)分來(lái)看(表6),0.5 mg組在1周時(shí)即表現(xiàn)出明顯破損,而0.2 mg組與0.1 mg組也在2周時(shí)表現(xiàn)出明顯損傷?？傮w看來(lái),早期各個(gè)劑量之間損傷變化差異不大,但在4周之后劑量較小組(<0.1 mg)與較大劑量組(≥0.1 mg)差異明顯(P<0.05),同時(shí),2～4周中較大劑量組(≥0.1 mg)在評(píng)分上差異不大,而較小劑量組(<0.1 mg)與PBS組的差距開(kāi)始顯現(xiàn)(P<0.05)。

表6 膝關(guān)節(jié)切片組織學(xué)評(píng)分Table 6 Histological score of knee joint section

圖2 膝關(guān)節(jié)HE染色關(guān)節(jié)破壞Fig.2 Knee joint destruction with HE staining

圖3 膝關(guān)節(jié)番紅O-固綠染色關(guān)節(jié)破壞Fig.3 Knee joint destruction with safranin O-fixation green staining

3 討論

3.1 M IA對(duì)于膝關(guān)節(jié)軟骨的損傷特點(diǎn)

MIA的作用為抑制骨關(guān)節(jié)細(xì)胞中3-磷酸脫氫酶,切斷抑制細(xì)胞的三羧酸循環(huán),使蛋白質(zhì)和多糖合成減少,最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死,從而模擬 OA時(shí)的過(guò)程[11]。有文獻(xiàn)表示此方法無(wú)法造成臨床OA樣的損傷,推薦將此方法用于OA疼痛模型的建立[12],但也有文獻(xiàn)選擇將MIA用于OA破壞模型的建立[13-14],本文更傾向于MIA可以形成OA樣損傷而非僅造成疼痛。與此同時(shí),M IA具有自身獨(dú)特優(yōu)勢(shì),相較于傳統(tǒng)的 Hulth法、單純前交叉韌帶切斷法,MIA建立OA模型的方法速度較快,在1～2周內(nèi)即可觀察到骨關(guān)節(jié)的損害。此外,相較于手術(shù)方法,注射的過(guò)程對(duì)于膝關(guān)節(jié)的損傷較小,不易產(chǎn)生感染和周?chē)浗M織損傷與結(jié)構(gòu)性破壞。而韌帶切斷術(shù)后由于膝關(guān)節(jié)不再穩(wěn)定,手術(shù)后小鼠的日常的攀爬動(dòng)作和懸吊動(dòng)作,小鼠的搬運(yùn)都有可能造成的關(guān)節(jié)異?；顒?dòng),從而對(duì)膝關(guān)節(jié)炎進(jìn)程產(chǎn)生影響,增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果異常的風(fēng)險(xiǎn)。

從大體和組織結(jié)果看來(lái),MIA造成的膝關(guān)節(jié)破壞主要聚集在注射區(qū)域周?chē)?在注射過(guò)程中,可控性較差,手術(shù)法獲得的組織損傷,多體現(xiàn)為關(guān)節(jié)力學(xué)軸線的破壞,關(guān)節(jié)最大承重面從外側(cè)脛骨平臺(tái)變?yōu)閮?nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)和股骨內(nèi)上髁,破壞范圍較為確定可控[15]。

3.2 M IA劑量的選擇

3.2.1 膝關(guān)節(jié)寬度與MIA劑量的關(guān)系:從膝關(guān)節(jié)寬度研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),第1周是關(guān)節(jié)寬度變化最大的時(shí)期,較大劑量組(≥0.1 mg)明顯更加嚴(yán)重,由此可知這是由于膝關(guān)節(jié)周?chē)浗M織受MIA不同劑量刺激可產(chǎn)生不同程度的炎癥腫脹。0.5 mg組在第1天時(shí)腫脹明顯,在7 d時(shí)明顯回落,在下降后與PBS組相比差異仍然顯著(P<0.05),0.1 mg與0.2 mg也在4～7 d時(shí)迅速下降,0.05 mg與0.025 mg組本身腫脹在4 d時(shí)才顯現(xiàn),但于1周時(shí)也開(kāi)始下降,各個(gè)組的寬度變化在3周內(nèi)不再明顯,這說(shuō)明周?chē)浗M織水腫和消退與時(shí)間和劑量相關(guān),雖然高劑量MIA對(duì)組織刺激更大,但機(jī)體的反應(yīng)速度也更加迅速,而當(dāng)其到達(dá)一個(gè)相對(duì)“平臺(tái)期”后,變化不再明顯。由此可知,在一定劑量范圍內(nèi)注射M IA引起的OA滑膜炎可以在1周左右到達(dá)平臺(tái)期,而在平臺(tái)期之前,較大的劑量產(chǎn)生的滑膜炎也更加嚴(yán)重。

而在2周之后,PBS組、0.05 mg組與0.025 mg組出現(xiàn)了膝關(guān)節(jié)寬度上升,考慮到小鼠本身的體質(zhì)量與體型的變化,可以暫時(shí)把這些程度較小的寬度增加歸因于機(jī)體的生長(zhǎng)。

3.2.2 大體評(píng)分與MIA劑量的關(guān)系:在大體觀察中可以發(fā)現(xiàn),PBS組評(píng)分均為0～1分,而注射 MIA的脛骨平臺(tái)均出現(xiàn)細(xì)小的凹陷,這表明即使是少量的MIA也可在無(wú)骨組織結(jié)構(gòu)破壞的情況下產(chǎn)生軟骨退變,這與OA早期病L過(guò)程相似,可以通過(guò)細(xì)化低劑量M IA來(lái)開(kāi)發(fā)更貼近慢性O(shè)A的動(dòng)物模型。

在2周之前,除PBS組以外各組均出現(xiàn)評(píng)分的上升,2周時(shí)1～2分處有 0.1 mg組,0.05 mg組與0.2 mg組,而當(dāng) 4周 后0.2 mg組平均分達(dá)到2.5分,而 0.1 mg組,0.05 mg組平均分仍為1～2分。0.5 mg組在2周和4周均達(dá)到了2分以上的平均分。從評(píng)分的標(biāo)準(zhǔn)可以看出,2分以上的破壞存在片狀的軟骨損害,而非細(xì)小空洞,說(shuō)明軟骨損傷更為明顯,但若需要通過(guò)MIA注射產(chǎn)生軟骨較大面積損害,應(yīng)選擇 0.2 mg以上的劑量。若需要模擬晚期OA產(chǎn)生的骨質(zhì)破壞,還需更高劑量的MIA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)認(rèn)證。

3.2.3 組織學(xué)分析:OARSI評(píng)分在0.5 mg注射4周后達(dá)到最大值6分[10],而本實(shí)驗(yàn)0.5 mg組在4周時(shí)最高僅達(dá)到4分,這應(yīng)該與小鼠品種和體質(zhì)量不同有關(guān)。達(dá)4分之后,小鼠開(kāi)始出現(xiàn)骨組織損傷,不宜再用軟骨損傷評(píng)估來(lái)評(píng)價(jià)OA嚴(yán)重程度,故本實(shí)驗(yàn)推薦在大于4周以上通過(guò)組織學(xué)評(píng)價(jià)評(píng)估OA損傷的實(shí)驗(yàn)中MIA劑量小于0.5 mg。

通過(guò)觀察各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的組織學(xué)評(píng)分不難發(fā)現(xiàn),在1周之后較大劑量組(≥0.1 mg)評(píng)分出現(xiàn)了一個(gè)急劇的上升,而較小劑量組(<0.1 mg)上升較為平緩,0.025 mg組幾乎與PBS組相同,這說(shuō)明較大劑量組(≥0.1 mg)MIA對(duì)于骨組織的損傷更加明顯,更適合用于短期內(nèi)獲得滿意軟骨組織的損傷。而其中0.1 mg、0.2 mg、0.5 mg三組之間差距不大,沒(méi)有太大的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn),注射MIA產(chǎn)生的小鼠膝關(guān)節(jié)損傷與時(shí)間和劑量有關(guān),較大劑量組(≥0.1 mg)的表現(xiàn)為短時(shí)間內(nèi)的軟骨組織的破壞和劇烈的炎癥反應(yīng),較小劑量組(<0.1 mg)表現(xiàn)出輕度軟骨組織的破壞和可逆性炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)推薦0.1 mg劑量作為較大劑量組的代表劑量,0.05 mg劑量為較小計(jì)量組的代表劑量,但在大體觀察中可以發(fā)現(xiàn)0.2 mg組癥狀優(yōu)于0.1 mg組,故在OA模型特定研究中,應(yīng)詳細(xì)考慮MIA的劑量和作用時(shí)間,以滿足實(shí)驗(yàn)行為學(xué)和組織學(xué)需要。與此同時(shí),仍然需要更為細(xì)化的濃度實(shí)驗(yàn)和長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)來(lái)研究較大劑量組和較小劑量組的組內(nèi)差異。選擇合適的MIA劑量來(lái)快速構(gòu)建小鼠OA模型,對(duì)于之后的骨關(guān)節(jié)治療研究大有裨益。