范 濤 武衛(wèi)國 馮 賓 劉佐民 柳全明

(中國食品藥品檢定研究院,北京 102629)

剖腹產(chǎn)凈化是實驗動物常用生物凈化手段之一。對于封閉群品系,剖腹產(chǎn)凈化會產(chǎn)生“奠基者”效應(yīng)而影響群體的遺傳特性[1]。通過人為選擇,群體中僅有部分個體進(jìn)入到了下個階段的繁育體系中,從而降低群體的多態(tài)性,同時,群體有效含量的減少,會加速近交系數(shù)上升速率,降低群體雜合度。然而,種群的凈化又是維持微生物等級(SPF級)必不可少的環(huán)節(jié),因此,在每次凈化建群后,必須對遺傳質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測。

微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)具有基因組分布廣、多態(tài)性高、重復(fù)性好等優(yōu)點,用于實驗動物遺傳檢測的研究已開展多年[2-6]。近幾年,實驗大、小鼠微衛(wèi)星DNA遺傳檢測方法正在制定相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn),以彌補(bǔ)我國實驗動物分子遺傳檢測方面的空白[7]。豚鼠是常用的實驗動物之一,大量研究表明[8-13],微衛(wèi)星DNA方法同樣適用于封閉群豚鼠的遺傳質(zhì)量評價。本實驗旨在通過剖腹產(chǎn)凈化獲得SPF級Harley豚鼠種群,通過遺傳檢測,了解凈化后種群的遺傳質(zhì)量,為日后該種群的管L與應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 豚鼠剖腹產(chǎn)凈化

1.1.1 種鼠選擇:原生產(chǎn)群采用4組循環(huán)交配方案,每組包含15～20個繁殖單元,每個繁殖單元雌雄比例1∶5。分別從各組選擇7～8個繁殖單元,挑選其中的雌、雄個體(共計30個繁殖單元)作為種鼠(雄鼠確認(rèn)可育,雌鼠為經(jīng)產(chǎn)個體),按1∶1合籠一周后,雌、雄分開飼養(yǎng)。

1.1.2 剖腹產(chǎn)手術(shù):從合籠開始計算,于65～70 d,用“綜合判斷法”(恥骨測量法+觀察法)[14]對受孕母鼠進(jìn)行臨產(chǎn)期判斷,對臨產(chǎn)的孕鼠進(jìn)行剖腹產(chǎn)手術(shù)。手術(shù)過程:孕鼠全身藥浴,CO2安樂死,仰臥保定,術(shù)部75%酒精消毒,蓋創(chuàng)巾,依次剪開孕鼠皮膚和腹壁,暴露子宮,用剪刀、鑷子分離子宮,止血鉗封閉雙側(cè)子宮角與宮頸,剪斷,將整個子宮摘下,通過渡槽傳入無菌隔離器中,在隔離器內(nèi),剪開子宮壁,暴露胎兒。胎兒取出后迅速擦拭口鼻,促進(jìn)其自主呼吸,隨后剪斷臍帶,從剖腹產(chǎn)到仔鼠取出,控制在3 m in內(nèi)完成。成活仔鼠在隔離器內(nèi)分籠飼養(yǎng),編號,溫度控制在28～30℃,用人工乳飼喂3～4次/d,飼喂至7日齡,隨后逐步改喂全價顆粒飼料。

育成的個體作為種鼠,分為 4組,按照 GB 14923—2010中封閉群循環(huán)交配方法進(jìn)行組合,交配繁殖,獲得F1代。

1.2 豚鼠微衛(wèi)星遺傳檢測

根據(jù)文獻(xiàn)[10-11],選擇豚鼠基因組中18個具有較高多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(表1),合成引物,引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成并進(jìn)行熒光標(biāo)記。已建立的SPF豚鼠群中,選取不同繁殖單元的25只個體,采集耳郭組織樣本,酚/氯仿法提取全基因組DNA,稀釋至50～100 ng/μL,分別對每個樣本進(jìn)行18個位點的PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物進(jìn)行微衛(wèi)星STR掃描。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析:使用Gene Marker 2.2讀取STR掃描結(jié)果,判斷等位基因大小,通過 PopGene 1.32計算各位點觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon信息指數(shù)、觀測雜合度、期待雜合度等指標(biāo),用PIC_CALC分析計算每個位點多態(tài)性信息含量(PIC)。對各位點進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(P值)。

表1 18個豚鼠微衛(wèi)星位點相關(guān)信息Table 1 Characteristics of 18 microsatellite loci from guinea pig

2 結(jié)果

2.1 剖腹產(chǎn)結(jié)果

通過剖腹產(chǎn),共獲得仔鼠85只,成活56只,離乳 47只(23雄、24雌),成活率 65.9%,離乳率83.9%(表 2)。

表2 豚鼠剖腹產(chǎn)結(jié)果Table 2 The results of cesarean section of guinea pigs

2.2 微衛(wèi)星遺傳檢測結(jié)果

實驗結(jié)果中,除1個樣本未擴(kuò)增出的位點較多,未納入統(tǒng)計(實際統(tǒng)計24個樣本),其余樣本在18個位點上均得到擴(kuò)增產(chǎn)物,經(jīng)STR掃描后,確定產(chǎn)物大小并進(jìn)行分型,計算等位基因數(shù)、雜合度、多態(tài)信息含量等參數(shù)(表3)。

本豚鼠群共檢測到 81個等位基因,平均 4.5個,平均觀測雜合度 0.5694,平均期望雜合度0.5869,平均雜合度0.5747,該群具備較L想雜合度。多態(tài)性信息含量是表示位點多態(tài)性高低的一個指標(biāo),18個微衛(wèi)星位點中,12個位點呈高度多態(tài)性(PIC>0.5),4個位點呈中度多態(tài)性(0.25

根據(jù) Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測結(jié)果(表4),18個位點中有14個位點符合H-W遺傳平衡,位點 HZ086呈現(xiàn)純合狀態(tài),HZ074、Cpo13、Cpo6 3個位點顯著偏離H-W遺傳平衡(P<0.05)。

表3 Har tley豚鼠封閉群在18個微衛(wèi)星位點上的遺傳多樣性Table 3 Genetic variation for 18 microsatellite loci in Hartley outbred colony

表4 Hartley豚鼠封閉群Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗Table 4 Exact test probability of Hardy-Weinberg genetic equilibrium of Hartley outbred colony

對比2014年相同遺傳位點檢測數(shù)據(jù)[11](表5),剖腹產(chǎn)前、后的群體,分別檢測到 85個(平均4.7個)和81個(平均4.5個)等位基因,平均觀測雜合度為 0.5077和0.5694,平均期望雜合度為0.5875和0.5869;平均多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.526和0.522,剖腹產(chǎn)前、后群體均具備較L想的雜合度,維持著高度多態(tài)性。Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測結(jié)果對比,原種群在18個位點中有4個顯著偏離H-W遺傳平衡,而凈化后的群體有3個位點顯著偏離,1個位點呈現(xiàn)純合狀態(tài)(位點HZ086)。

表5 凈化前群體遺傳多樣性與H-W平衡檢驗Table 5 Genetic diversity and HWE test of the colony beforedecontamination

3 討論

豚鼠孕期較長,妊娠期60～70 d,剖腹產(chǎn)手術(shù)實施越接近臨產(chǎn)期成功率越高,同時,手術(shù)操作過程也是影響成活率的主要因素之一。本次實驗采取觀察與恥骨測量相結(jié)合來的方法綜合判斷臨產(chǎn)期,剖腹產(chǎn)成活率達(dá)為65.9%,低于有關(guān)文獻(xiàn)報道[14-15],這可能與經(jīng)驗積累與技術(shù)熟練程度有關(guān)。在本實驗過程中還發(fā)現(xiàn),頭胎母鼠剖產(chǎn)得到的仔鼠活力較低,很難有自主呼吸,而使用經(jīng)產(chǎn)母鼠,后代活力有較大改善,這也是影響剖腹產(chǎn)成活率的又一因素,具體差異還需進(jìn)一步研究。

Hartley豚鼠屬于封閉群實驗動物。封閉群是指不從外部引入新個體的條件下,以非近交方式繁殖生產(chǎn)的實驗動物種群。對于封閉群動物遺傳質(zhì)量控制,主要表現(xiàn)在保持其遺傳組成具有較高的雜合性,同時所有基因的相對頻率保持穩(wěn)定。影響群體遺傳多樣性評價可靠性主要有兩個方面,一個是選擇的樣本對總體的代表性,另一個是遺傳標(biāo)記對基因組的代表性。朱亮等[8]應(yīng)用8個微衛(wèi)星位點對群體中72個個體進(jìn)行遺傳,以評價其封閉群遺傳質(zhì)量;李芳芳等[11]通過25個微衛(wèi)星位點檢測比較了兩個封閉群豚鼠間的遺傳差異;劉迪文等[13]應(yīng)用45個微衛(wèi)星位點評估了三個遠(yuǎn)交系豚鼠的遺傳結(jié)構(gòu),同時篩選出性狀基因定位有關(guān)位點,為豚鼠育種提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本實驗從群體中每個繁殖單元都選取了動物個體(共25只),同時通過文獻(xiàn)選擇了18個多態(tài)性較高的微衛(wèi)星位點,用于反應(yīng)群體的遺傳概況,較為合L。通過與剖腹產(chǎn)前種群遺傳檢測結(jié)果進(jìn)行對比,種群遺傳多樣性保持較好,但隨著代次的增加,部分位點已出現(xiàn)純合狀態(tài),這提示出飼養(yǎng)過程仍存在未實現(xiàn)隨機(jī)交配與近交的狀況發(fā)生,這是封閉群經(jīng)常出現(xiàn)的問題。封閉群實驗動物在保種繁殖的過程中,為了避免近交系數(shù)上升過快,要維持足夠的有效群體含量,而保證群體有效含量的方法就是在封閉群中各家系內(nèi)廣泛選留種用個體。剖腹產(chǎn)凈化建群的過程,即一次留種過程,選種需要在原群體中廣泛選育,才能盡可能地保持原群體的遺傳多樣性,同時,定期的遺傳監(jiān)測與嚴(yán)格的避免近交操作在封閉群飼養(yǎng)管L中是必要的。根據(jù)遺傳檢測結(jié)果,此次凈化后的豚鼠種群在遺傳上符合封閉群實驗動物遺傳特征。