黎家敏 馬佳麗 楊 春 鄧 林 馬文靜 榮祖元

(四川省食品藥品檢驗檢測院,成都 611731)

組胺、緩激肽一類的物質因具有血管擴張作用,在注入機體后易引起血壓快速下降[1]。由動植物或微生物發(fā)酵物提取的藥品中可能混入使血管擴張而降低血壓的活性物質(包括組胺、緩激肽等組胺類物質),中藥中的復雜成分也含有大量降低血壓的已知或未知物質,靜脈微量注射該類物質即有急性降低血壓作用,發(fā)生嚴重的心血管系統(tǒng)不良反應。因此,降壓物質檢查在化學藥品(尤其是生化藥)和中藥注射劑的安全性評價中發(fā)揮著重要作用,對控制藥品質量、保障用藥安全也具有重要意義。

降壓物質檢查法早已收錄于中國藥典和歐洲藥典等國內外著名藥典的附錄中,是藥品檢驗和安全性評價研究的法定標準。國內外藥典也均采用貓作為降壓物質檢查的實驗對象。然而,由于目前國內缺乏標準化實驗動物貓生產供應,長期以來降壓物質檢查試驗中所用的貓絕大多數是從商販或收購型飼養(yǎng)場購買,貓的來源、遺傳背景、年齡、健康狀況、微生物和寄生蟲等攜帶狀況等均不清楚,實驗結果存在未知因素的干擾,嚴重影響試驗結果和檢驗報告的科學性與公信力,也可能給實驗人員的健康安全埋下隱患。因此,在標準化實驗貓的來源尚未得到解決之前,尋找實驗貓的替代動物或降壓物質檢查的替代方法已成為可選途徑。

本研究擬將與貓體型大小、遺傳背景比較清楚、易于實驗操作和價格比較低廉的常用實驗兔作為研究對象,通過比較實驗兔和貓在降壓物質檢查中的靈敏度和重現(xiàn)性,以探索實驗兔在降壓檢查中應用是否具有可行性,從而為盡快解決目前降壓物質檢查中實驗用貓的合法性問題或推動實驗用貓的實驗動物標準化、產業(yè)化以及相關降壓作用機L研究提供一定的L論基礎和參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通級新西蘭兔、日本大耳白兔和青紫藍兔各6只,雌雄均各半,購自邳州市東方養(yǎng)殖有限公司,實驗動物生產許可證號:SCXK(蘇)2017-0002。貓6只,雌雄各半,購自成都達碩實驗動物有限公司,實驗動物生產許可證號:SCXK(川)2019-031。實驗兔和貓均飼養(yǎng)于四川省食品藥品檢驗檢測院安全評價中心普通級動物房,實驗動物使用許可證號:SYXK(川)2015-127,溫度:18～22℃,相對濕度:40%～70%,自由飲食,光照周期為12 h/12 h。

1.2 藥品與試劑

磷酸組胺標準品,批號:150510-201313,規(guī)格:約20 mg,來源:中國食品藥品檢定研究院提供;戊巴比妥鈉,批號:130315,規(guī)格:25 g/瓶,德國默克公司生產;肝素鈉注射液,批號:151710086 A,規(guī)格:2 m L/12 500單位,常州千紅生化制藥股份有限公司生產;0.9%氯化鈉注射液,批號:G118021804,規(guī)格:100 m L/0.9 g,四川科倫藥業(yè)股份有限公司生產;生脈注射液,批號:19030102001,規(guī)格:20 mL/支,華潤三九(雅安)藥業(yè)有限公司生產。

1.3 儀器

RM 6280C多道生L信號采集處L系統(tǒng),成都儀器廠;CPA225D電子天平,賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;MW-6電子臺秤,賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 3種不同品種實驗兔對組胺和生脈注射液降壓試驗的比較:參照《中國藥典》降壓物質檢查法[2],取健康合格的普通級日本大耳白兔、新西蘭兔和青紫藍兔各6只,先給予50 mg/kg戊巴比妥鈉經耳緣靜脈緩慢注射進行麻醉后,固定于恒溫手術臺上,進行手術操作分離一側頸動脈,插入連接生L信號采集處L系統(tǒng)的動脈插管,管內充滿約750 U/m L肝素鈉溶液作為抗凝劑,記錄動物血壓;普通級日本大耳白兔、新西蘭兔采用耳緣靜脈,青紫藍兔采用另一側頸靜脈,依次給予0.05μg/kg、0.1μg/kg和 0.15μg/kg組胺對照品溶液作為一個給藥組,每只家兔分別重復上述給藥組3次,然后再繼續(xù)給予0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、3μg/kg、4μg/kg、5μg/kg組胺對照品以及 0.5 m L/kg和1 m L/kg生脈注射液,比較各品種實驗兔對組胺物質降壓反應的敏感性、重現(xiàn)性和血壓穩(wěn)定性等,同時考察其組胺靈敏度試驗結果是否符合《中國藥典》的要求和對生脈注射液的降壓反應情況。

1.4.2 貓對組胺和生脈注射液降壓試驗:取健康合格的貓6只,按45 mg/kg給藥劑量,經腹腔注射戊巴比妥鈉溶液進行麻醉后,固定于恒溫手術臺上,進行手術操作分離一側頸動脈,插入連接生L信號采集處L系統(tǒng)的動脈插管,管內充滿約750 U/m L肝素鈉溶液作為抗凝劑,記錄動物血壓;經另一側股靜脈依次注射藥液。參照《中國藥典》降壓物質檢查法[2],依 次 給 予 0.05μg/kg、 0.1μg/kg 和0.15μg/kg組胺對照品溶液作為一個給藥組,每只貓分別重復上述給藥組3次,然后再繼續(xù)給予0.5μg/kg、1μg/kg組胺對照品以及0.5 m L/kg和1 m L/kg生脈注射液,考察其組胺靈敏度試驗是否符合要求和對生脈注射液的降壓反應情況,并將它們與實驗兔的降壓反應結果進行比較分析。

1.4.3 靈敏度符合要求的判定依據:《中國藥典》(2015年版)中“1145降壓物質檢查法”要求進行降壓物質檢查時,要先進行實驗動物的靈敏度檢查試驗,即自靜脈依次注入組胺對照品溶液,劑量分別為0.05μg/kg、0.1μg/kg和 0.15μg/kg,重復 2～3次,如 0.1μg/kg組胺所致的血壓下降值均不小于2.67 kPa,同時各劑量所致反應的均值有差別,方可認為該動物的靈敏度符合要求。

1.5 統(tǒng)計方法

先利用RM 6280C系列多道生L信號采集處L系統(tǒng)軟件對采集圖譜計算血壓的下降值,再采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料以平均值±標準差(±s)表示。

2 結果

2.1 3種實驗兔對組胺和生脈注射液降壓試驗的比較

2.1.1 3種實驗兔基礎血壓比較:3個不同品種實驗兔基礎血壓值有一定的差異,新西蘭兔基礎血壓值與日本大耳白兔、青紫藍兔相比,均無統(tǒng)計學差異,但日本大耳白兔的基礎血壓值顯著大于青紫藍兔的基礎血壓值(P<0.05),見表1。

表1 3個不同品種實驗兔之間基礎血壓值及其均值的比較Table 1 Comparison of basic blood pressure values and its mean among three different laboratory rabbits

2.1.2 3種實驗兔對組胺敏感性的比較:比較不同品種實驗兔依次給予0.05μg/kg、0.1μg/kg和0.15μg/kg組胺對照品溶液進行靈敏度試驗,每只家兔分別進行 3次,以及按 0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、3μg/kg、4μg/kg和5μg/kg給予組胺對照品后的降壓程度。結果表明,在 0.05μg/kg～5.0μg/kg的組胺劑量之間,新西蘭兔、日本大耳白兔和青紫藍兔三者之間對組胺的降壓反應程度均無統(tǒng)計學差異(P>0.05),見表2。

表2 3個不同品種實驗兔對不同劑量組胺降壓反應的比較Table 2 Comparison of depressor response of among three different laboratory rabbits to different doses of histamine

2.1.3 3種實驗兔對組胺耐受性的比較:3種不同品種實驗兔依次給予0.05μg/kg、0.1μg/kg和0.15μg/kg組胺對照品溶液進行靈敏度試驗,每只家兔分別進行 3次,以及按 0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、3μg/kg、4μg/kg和5μg/kg給予組胺對照品后,動物對組胺的降壓反應并沒有隨著給藥劑量和次數的增加而明顯降低或無降壓反應的現(xiàn)象,且三者之間的降壓反應趨勢基本一致,說明不同品種實驗兔對組胺的耐受性和反應均比較一致,見圖1。

2.1.4 3種實驗兔血壓穩(wěn)定性的比較:比較了新西蘭兔、日本大耳白兔和青紫藍兔3個不同品種實驗兔在組胺降壓試驗過程中血壓的波動性,總體來看,新西蘭兔的血壓波動相對較少,而其他兩個品種,尤其是青紫藍兔個別動物的血壓波動尤為明顯,結果見圖 2～圖 4。

2.1.5 3種實驗兔手術操作便利性的比較:新西蘭兔、日本大耳白兔均為白色動物,其耳緣靜脈血管肉眼清晰可見,便于直接經耳緣靜脈注射給藥,無需采取頸靜脈或股靜脈手術操作給藥,而青紫藍兔為灰黑色動物,其耳緣靜脈肉眼很難辨別,不便于直接進行靜脈注射給藥,需采取手術剖離頸靜脈進行注射給藥,增加手術傷口和費時等。

圖1 3個不同品種實驗兔對組胺的反應趨勢Fig.1 The trend of depressor effects of histamine in three different laboratory rabbits

圖2 新西蘭兔試驗過程中血壓波動情況Fig.2 Blood pressure fluctuation in New Zealand rabbit during the experiment

圖3 日本大耳白兔試驗過程中血壓波動情況Fig.3 Blood pressure fluctuation in Japanese white rabbit during the experiment

圖4 青紫藍兔試驗過程中血壓波動情況Fig.4 Blood pressure fluctuation in the Chinchilla rabbit during the experiment

2.2 實驗兔和貓對組胺靈敏度試驗結果的比較

2.2.1 實驗兔和貓對組胺反應敏感性(降壓反應)的比較:結果表明,在0.05～1.0μg/kg組胺劑量范圍內,貓的降壓反應均顯著性大于3種實驗兔(P<0.01),相同組胺劑量下貓的降壓反應約為實驗兔的8倍,見表3。從圖5也可知,貓對很小的組胺劑量(0.5μg/kg)的降壓反應都遠遠大于較大劑量的組胺(5μg/kg)對兔的降壓作用,說明3種實驗兔對組胺的降壓反應極不敏感,貓和實驗兔對組胺的降壓反應存在較大的差異性。

表3 實驗兔和貓對不同劑量組胺降壓作用的比較Table 3 Comparison of depressor responses of laboratory rabbits and cats to different doses of histamine

圖5 不同劑量組胺對實驗兔和貓降壓作用趨勢Fig.5 The trend of depressor effects of different doses of histamine in laboratory rabbits and cats

2.2.2 實驗兔和貓對組胺靈敏度試驗的比較:由表4和圖6可知,所有實驗兔對0.05μg/kg、0.1μg/kg和0.15μg/kg組胺劑量的降壓反應均值雖有差異但并不明顯,且血壓下降值均不到1 kPa,遠遠小于靈敏度試驗要求最低的下降值2.67 kPa。即使提高組胺劑量至5μg/kg(約為靈敏度試驗劑量0.1μg/kg的50倍),實驗兔的降壓作用也僅約為1.6 kPa。 而 貓 對 0.05μg/kg、 0.1μg/kg和0.15μg/kg組胺劑量的降壓反應均值均大于2.67 kPa,不同劑量間降壓均值的差異也較明顯。結果表明,實驗兔的靈敏度試驗是不符合要求的,暫時無法用于降壓物質檢查。

圖6 不同劑量組胺對實驗兔和貓降壓作用趨勢Fig.6 The trend of depressor effects of different doses of histamine in laboratory rabbits and cats

表4 實驗兔和貓對不同劑量組胺靈敏度試驗結果Table 4 The sensitivity test of laboratory rabbits and cats to different dose of histamine

2.2.3 實驗兔和貓對組胺和生脈注射液降壓反應的比較:通過分別給予貓和實驗兔0.5 m L/kg和1.0 m L/kg的生脈注射液,比較不同動物對生脈注射液的降壓反應以及組胺與生脈注射液對貓和實驗兔的降壓作用。由表5可知,貓對組胺的降壓反應約為實驗兔的8倍,而對生脈注射液的反應約為實驗兔的1.5倍。因此,貓和兔對組胺的敏感性區(qū)別很大,但對生脈注射液的降壓反應區(qū)別不大。兔雖然對組胺的敏感性不高,但對生脈注射液的降壓反應卻比較敏感,說明組胺對動物的降壓作用存在明顯的種屬選擇性和差異性。

表5 實驗兔和貓對不同劑量組胺與生脈注射液降壓反應值Table 5 The depressor response values of different doses of histamine and Shengmai Injection in laboratory rabbits and cats kPa

3 討論

目前,臨床不良反應中降壓休克等類過敏反應較多,可能與包括組胺在內的降壓物質有關[3]。來自動植物或微生物發(fā)酵提取物及生產過程中有可能混入組胺類或類組胺類物質的原料和注射劑(靜脈)應建立降壓物質檢查項,如抗生素、中藥注射劑、氨基酸和多肽類[1,4]。中藥含有大量降低血壓的未知和已知雜質成分,靜脈注射微量該類物質即有急性降血壓作用,發(fā)生嚴重的心血管系統(tǒng)不良反應[3]。因此,降壓物質檢查對控制藥品質量、保障用藥安全具有重要意義。

現(xiàn)行主要的國內外藥典包括中國藥典(2015版)、歐洲藥典、英國藥典、印度藥典和國際藥典均收載有降壓物質檢查的方法[2,5-8]。此外,貓由于體循環(huán)系統(tǒng)發(fā)達,血壓穩(wěn)定,特別是在麻醉狀態(tài)下,能保持正常血壓,血管壁堅韌,耐受麻醉和手術,對藥物反應靈敏,較大鼠、家兔等小動物更接近于人體,心搏力強,能描繪出完好的血壓曲線等優(yōu)點[9-10],特別是在神經學、藥L學和心血管系統(tǒng)等研究方面,貓具有其他實驗動物無法比擬的優(yōu)勢[11]。當前國內外藥典收錄降壓物質檢查法也均選擇貓作為降壓物質檢查唯一的實驗動物對象。

然而,當前我國未建立實驗貓的繁殖、培育和質量檢測相關國家標準,實驗所用的貓為非標準化實驗動物,大多從商販或收購型飼養(yǎng)場購買,其遺傳、年齡、微生物和寄生蟲等攜帶狀況不清,個體差異不可控制,健康狀況無法保證,對實驗結果以及實驗人員的健康安全均產生嚴重的威脅和影響[3,12-16]。 嵇揚等[17]研究表明,按藥典規(guī)定的組胺劑量,比格犬的血壓下降值達不到20 mmHg以上,即比格狗的靈敏度不符合實驗要求;而貓的血壓下降值均在20 mmHg以上,即貓的靈敏度符合實驗要求。貓還對組胺降壓作用表現(xiàn)了較好的重現(xiàn)性。目前,尚未發(fā)現(xiàn)有利用兔進行降壓物質檢查的相關研究,因此本研究通過以已標準化的實驗兔為研究對象,探索其在降壓物質檢查中應用的可能性。

本研究結果表明,新西蘭兔、日本大耳白兔和青紫藍兔3種常規(guī)實驗兔對組胺降壓反應的敏感性和耐受性是基本一致的,無品種間的差異性,但新西蘭兔的血壓相對穩(wěn)定和操作較便利,認為新西蘭兔作為降壓試驗動物較為L想。此外,還發(fā)現(xiàn)3個品種實驗兔對《中國藥典》規(guī)定的組胺劑量(0.05μg/kg、0.1μg/kg和 0.15μg/kg)的降壓反應值差異不大且均很低,不到1 kPa,遠遠小于靈敏度試驗要求最低的限值2.67 kPa,其靈敏度試驗結果是不符合要求的,也說明了實驗兔暫時無法用于降壓物質檢查。而貓對很小的組胺劑量(0.5μg/kg)的降壓反應值均遠大于較大劑量的組胺(5μg/kg)對兔的降壓作用,說明3種實驗兔對組胺的降壓反應是極不敏感的,貓和實驗兔對組胺的降壓反應存在很大的差異。但是通過分別比較貓和實驗兔對生脈注射液的降壓反應卻發(fā)現(xiàn)實驗兔具有明顯的降壓反應。在相同給藥劑量下,貓對組胺的降壓反應約為實驗兔的8倍,而對生脈注射液的降壓反應僅約為實驗兔的1.5倍,說明組胺對動物的降壓作用機制存在明顯的種屬選擇性和差異性。其原因可能是由于不同動物參與血壓調節(jié)的組胺受體作用機制不同[18-19]。其中,貓的H1和H2組胺受體均參與組胺的降壓作用,但兔參與降壓作用組胺受體存在雙向調節(jié)作用即只有H2組胺受體參與降壓作用而H1是參與升壓作用[20-22],具體的原因有待于進一步深入研究。

總之,本研究雖然不能實現(xiàn)將實驗兔應用于藥品降壓物質檢查的目標,但卻發(fā)現(xiàn)組胺對實驗兔的降壓作用具有明顯的動物種屬選擇性和差異性。此外,實驗兔對生脈注射液具有明顯的降壓反應,可用于一些中藥注射劑的降壓作用研究。因此,本研究為推動加快實驗用貓的實驗動物標準化、產業(yè)化和降壓反應敏感性相關動物模型的構建以及進一步研究組胺對不同動物的降壓作用機制的研究均提供了一定的L論基礎和參考依據。