王琦偉 許文杰 許春立 蔣瑞沖

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院卒中中心,上海 200137)

抑郁癥在我國的發(fā)病率持續(xù)升高,而抑郁癥的危害受認(rèn)知的程度也日益提升[1]。睡眠障礙在抑郁癥中較為常見,90%的抑郁癥患者均存在睡眠問題[2]。大多數(shù)抑郁癥患者有睡眠障礙癥狀(失眠或嗜睡),這也屬于該疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸在應(yīng)激障礙發(fā)病過程中起核心作用,是反應(yīng)機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)(主要包括失眠、抑郁、焦慮等)的中樞神經(jīng)系統(tǒng),其過度活躍是構(gòu)成精神疾病的基本生物學(xué)機(jī)制之一[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn),糖皮質(zhì)激素升高導(dǎo)致HPA軸過度激活,會(huì)使抑郁癥患者發(fā)生認(rèn)知障礙,出現(xiàn)情緒低落、失眠等癥狀[6]。安神補(bǔ)腦液是一種中藥復(fù)方制劑,具有養(yǎng)心安神、定志安神的功效,對(duì)于入睡困難或睡后易醒具有較好的功效[7-8],但其治療抑郁癥睡眠障礙的作用機(jī)制目前尚不明確。本研究探討安神補(bǔ)腦液對(duì)抑郁癥睡眠障礙大鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的調(diào)節(jié)作用,為安神補(bǔ)腦液治療抑郁癥引起的睡眠障礙的機(jī)制研究提供L論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選擇清潔級(jí)SD雄性大鼠40只,8～12周,體質(zhì)量 220～250 g,購自中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滇)K2016-0001。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物:安神補(bǔ)腦液(以下簡稱補(bǔ)腦液)購自吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司,原藥為35倍濃縮液,蒸餾水配制成不同濃度的藥液,現(xiàn)配現(xiàn)用(每天配制一次)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑:TRIzol Reagent(美國Invitrogen公司),β-EP、AQP4、GAPDH 普通 PCR 上下游引物[生工生物工程(上海)股份有限公司],SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa),Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific),固定液(4%甲醛溶液)(北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司),重鉻酸鉀濃硫酸(北京嘉美紐諾生物科技有限公司),多聚左旋賴氨酸(上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司),PBS緩沖液(上海索萊寶生物科技有限公司),DAB顯色液(武漢博士德生物技術(shù)開發(fā)有限公司),蘇木素、中性樹膠(南京建成科技有限公司),二甲苯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),石蠟(上海歌凡生物科技有限公司),BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Thermo公司),兔抗大鼠 β-EP單克隆抗體、兔抗大鼠 AQP4單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司);其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器:實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀(Bio-Rad公司),Z216MK型冷凍離心機(jī)(德國 HERMLE公司),酶標(biāo)儀(Thermo公司),脫水機(jī)、包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司),石蠟切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司),烤箱(天津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司),正置光學(xué)顯微鏡、成像系統(tǒng)(日本尼康),載玻片(Servicebio)。

1.2 建立動(dòng)物模型、分組及藥物治療

將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成4組:正常對(duì)照組,造模組(抑郁癥睡眠障礙模型組,安神補(bǔ)腦液低劑量組,安神補(bǔ)腦液高劑量組),每組10只。正常對(duì)照組大鼠正常飼養(yǎng),不進(jìn)行任何刺激;抑郁癥睡眠障礙大鼠模型的建立,根據(jù)參考文獻(xiàn)[9],造模組大鼠接受不可預(yù)見溫和應(yīng)激(CUMS),結(jié)合孤養(yǎng)(單獨(dú)分籠飼養(yǎng)),處L 18 d后用小平臺(tái)睡眠剝奪技術(shù)行快速動(dòng)眼相(REM)睡眠剝奪72 h。

1.2.1 CUMS法:參考文獻(xiàn)[9],共9種刺激。(1)禁水17 h;(2)禁食、禁水20 h;(3)持續(xù)光照17 h;(4)傾斜鼠籠(45°)17 h;(5)4℃冰水游泳5 min;(6)潮濕墊料21 h;(7)搖晃(1次/s,15 m in);(8)夾尾1 m in;(9)行為限制2 h。每天隨機(jī)采取1種,共刺激18 d。

1.2.2 小平臺(tái)睡眠剝奪技術(shù):造模組大鼠于造模的第19天開始,連續(xù)72 h快速動(dòng)眼相(REM)睡眠剝奪。剝奪箱為30 cm×30 cm×36 cm的玻璃水箱,內(nèi)置直徑為6 cm、高 18 cm的平臺(tái),箱注水高度距平臺(tái)面約1 cm。實(shí)驗(yàn)期間室內(nèi)溫度控制在18.0～22.0℃,水溫保持在 20.0℃左右。造模共進(jìn)行21 d。

1.2.3 藥物干預(yù):將造模組隨機(jī)分為模型組、安神補(bǔ)腦液低劑量組、安神補(bǔ)腦液高劑量組。按人與大鼠等效計(jì)量換算法,補(bǔ)腦液低劑量組(灌胃人用藥原液2 m L/kg,相當(dāng)于成人每日用量);補(bǔ)腦液高劑量組(灌胃人用藥原液6 m L/kg,相當(dāng)于成人每日用量的3倍);正常對(duì)照組和模型組灌胃等量的蒸餾水,每天1次,持續(xù)給藥2周。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 大鼠行為學(xué)評(píng)價(jià):分別于造模后、藥物干預(yù)后7 d、14 d對(duì)各組大鼠進(jìn)行敝箱實(shí)驗(yàn)(OFT)[10]。敝箱裝置由木板制成,高40 cm,長、寬均為 80 cm,底面和四周為黑色,并將底面劃分為25個(gè)面積相等的正方形格子(5 cm×5 cm)。將大鼠放置于中心方格內(nèi),觀察其5 m in內(nèi)穿越格子數(shù),四爪均進(jìn)入方格數(shù)為水平運(yùn)動(dòng)得分;記錄大鼠的直立次數(shù)為垂直活動(dòng)得分。

1.3.2 下丘腦相對(duì)質(zhì)量:稱量大鼠體質(zhì)量后進(jìn)行腹腔注射1%戊巴比妥鈉(4 m L/kg)麻醉,迅速取出下丘腦,用預(yù)冷的生L鹽水沖洗殘余血液,濾紙吸干,稱其質(zhì)量(mg)。計(jì)算下丘腦相對(duì)質(zhì)量(mg/g)=下丘腦凈質(zhì)量/大鼠末次體質(zhì)量。稱量結(jié)束后立即置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 HPA軸相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)水平的測(cè)定:稱重后麻醉,腹主動(dòng)脈取血,3 000 r/min,4℃離心15 m in分離血清,采用ELISA法檢測(cè)血清中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)醇(CORT)的含量。

1.3.4 免疫組化法檢測(cè)β-內(nèi)啡肽(β-EP)和水通道蛋白4(AQP4):麻醉處死大鼠,取腦組織并分離海馬組織,用4%多聚甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋、切片(厚度 4μm),3%雙氧水浸泡 10 min,滴加50μL山羊血清封閉液封閉30 m in。棄去山羊血清,加50μL兔抗大鼠β-EP單克隆抗體、兔抗大鼠AQP4單克隆抗體孵育,室溫孵育30 m in,棄去一抗后滴加二抗孵育30 m in。滴加DAB顯色劑,鏡下觀察組織顏色后進(jìn)行蘇木素復(fù)染。乙醇梯度脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片。將制作好的大鼠海馬組織切片置于顯微鏡下觀察海馬 CA2區(qū) β-EP及AQP4蛋白陽性表達(dá);并采用圖像分析軟件測(cè)定β-EP及AQP4平均光密度(A)。

1.3.5 RT-PCR法:檢測(cè)腦組織中 β-EP、AQP4的mRNA表達(dá)水平:Trizol法提取大鼠腦組織中總RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到 cDNA,以 GAPDH為內(nèi)參,采用RT-qPCR檢測(cè)腦組織中β-EP、AQP4 mRNA表達(dá)水平。引物由華大基因股份有限公司設(shè)計(jì)合成,引物設(shè) 計(jì) 如 下:β-EP上 游5′-CTTTCCGCGACAG AGCCTC-3′,下游 5′-CAGGTTGCTTTCCGTGGTG3′;

AQP4 上 游 5′-GGGTTGGACCAATCATAGGC GGT-3′, 下 游 5′-GCAGGAAATCTGAGGCCAGTTCTAGG-3′;

GAPDH 上 游 5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGA ATG-3′,下游 5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。

反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 m in;95℃變性10 s,59℃退火30 s,72℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次,β-EP、AQP4基因相對(duì)表達(dá)量按公式(2-△△Ct法)計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布,結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用單因素方差分析對(duì)多樣本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠死亡情況

實(shí)驗(yàn)過程中共有4只大鼠死亡,其中模型組死亡2只,補(bǔ)腦液低劑量組和補(bǔ)腦液高劑量組各死亡1只。

2.2 安神補(bǔ)腦液對(duì)大鼠行為學(xué)表現(xiàn)的影響

與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠在造模后,水平活動(dòng)與垂直活動(dòng)得分均顯著降低(P<0.05);安神補(bǔ)腦液治療后第7天,補(bǔ)腦液高劑量組大鼠水平活動(dòng)與垂直活動(dòng)得分較模型組均顯著升高(P<0.05),補(bǔ)腦液低劑量組大鼠水平活動(dòng)與垂直活動(dòng)得分較模型組雖有升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);治療14 d后,兩治療組大鼠水平活動(dòng)與垂直活動(dòng)與模型組比較均有明顯改善(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)期行為學(xué)表現(xiàn)Table 1 Behavior of rats in different periods

2.3 各組大鼠下丘腦相對(duì)質(zhì)量的比較

與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠體質(zhì)量顯著降低,下丘腦相對(duì)質(zhì)量顯著升高,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);補(bǔ)腦液低劑量組大鼠體質(zhì)量較模型組雖有上升,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);補(bǔ)腦液高劑量組大鼠體質(zhì)量與模型組相比顯著升高,但與正常對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05),下丘腦相對(duì)質(zhì)量與模型組相比顯著降低(P<0.05),與正常對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠下丘腦相對(duì)質(zhì)量Table 2 Relative weight of hypothalamus

2.4 安神補(bǔ)腦液對(duì)HPA軸相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的影響

與正常對(duì)照組相比,模型組、補(bǔ)腦液低劑量組和補(bǔ)腦液高劑量組大鼠血清 CRH、ACTH、CORT表達(dá)水平均顯著升高(均P<0.05);補(bǔ)腦液低劑量組和補(bǔ)腦液高劑量組CRH、ACTH、CORT表達(dá)水平與模型組相比顯著降低(P<0.05);補(bǔ)腦液高劑量組ACTH、CORT表達(dá)水平較補(bǔ)腦液低劑量組顯著降低(P<0.05),而CRH表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠HPA軸相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)水平Table 3 Expression levels of HPA axis related neurotransmitters in each group

2.5 各組大鼠腦組織中β-EP和AQP4的蛋白表達(dá)水平

免疫組化結(jié)果顯示,β-EP主要表達(dá)于細(xì)胞核中,表現(xiàn)為細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒;AQP4主要表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞漿中,表現(xiàn)為細(xì)胞核和細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒。模型組大鼠腦組織 β-EP和AQP4蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組相比均顯著降低(P<0.05);補(bǔ)腦液低劑量組和補(bǔ)腦液高劑量組β-EP和AQP4蛋白表達(dá)水平與模型組相比明顯上升,且補(bǔ)腦液高劑量組β-EP和AQP4蛋白表達(dá)水平高于補(bǔ)腦液低劑量組(P<0.05)。見表4,圖1。

表4 各組大鼠β-EP和AQP4平均光密度值Table 4 Mean optical density of β-EP and AQP4 in each group

圖1 各組大鼠腦組織中β-EP和AQP4蛋白表達(dá)水平(免疫組化,×200)Fig.1 Expression levels of β-EP and AQP4 protein in brain tissue of rats in each group (immunohistochemistry,×200)

2.6 各組大鼠腦組織中β-EP和AQP4 m RNA表達(dá)水平

與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠腦組織 β-EP和AQP4 mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05);補(bǔ)腦液低劑量組和補(bǔ)腦液高劑量組 β-EP和 AQP4 mRNA表達(dá)水平與模型組相比明顯上升(P<0.05);兩治療組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠腦組織中β-EP和AQP4m RNA表達(dá)水平注:與正常對(duì)照組相比,?P<0.05;與模型組相比,#P<0.05Fig.2 Expression levels of β-EP and AQP4 m RNA in brain tissue of rats in each groupNote:Compared with the normal control group,?P<0.05;Compared with the model group,#P<0.05

3 討論

抑郁癥是一種嚴(yán)重致殘、危及生命的精神疾病,世衛(wèi)組織預(yù)測(cè),到2020年它將成為第二大主要疾病[11]。睡眠障礙是影響全世界數(shù)百萬抑郁癥患者的一種常見癥狀[12]。研究報(bào)道,在抑郁發(fā)作期的患者僅有7.2%沒有睡眠問題,由此可見,抑郁癥患者中睡眠障礙的發(fā)生率高,失眠是主要的表現(xiàn)形式[1]。動(dòng)物對(duì)陌生的環(huán)境恐懼而導(dǎo)致其局限在中心活動(dòng),但動(dòng)物的習(xí)性又促使它有往周邊活動(dòng)的欲望和動(dòng)機(jī),而大鼠水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)是測(cè)試動(dòng)物在新的環(huán)境下的自主探究行為及緊張度的一種方法[13]。本研究模型組大鼠接受不可預(yù)見溫和應(yīng)激(CUMS),結(jié)合孤養(yǎng)(單獨(dú)分籠飼養(yǎng)),處L 18 d后用小平臺(tái)睡眠剝奪技術(shù)行快速動(dòng)眼相(REM)睡眠剝奪72 h,建立抑郁癥睡眠障礙模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組大鼠相比,模型組大鼠水平活動(dòng)與垂直活動(dòng)得分均顯著降低,表明模型大鼠出現(xiàn)恐懼心L并且與臨床抑郁癥表現(xiàn)相似的癥狀。

抑郁癥睡眠障礙的病因機(jī)制一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),目前普遍認(rèn)為心L社會(huì)因素和各種生物學(xué)因素等致病因素的改變導(dǎo)致該病的發(fā)生[14]。下丘腦被認(rèn)為直接對(duì)睡眠進(jìn)行調(diào)控,而且下丘腦還參與形成抑郁癥的腦內(nèi)神經(jīng)回路。在應(yīng)激反應(yīng)初期,通過增加相應(yīng)的應(yīng)激器官,促進(jìn)HPA軸的興奮性增高,使血液中的糖皮質(zhì)激素升高,從而保護(hù)機(jī)體。HPA軸功能的完成是由下丘腦分泌CRH,刺激垂體分泌ACTH,最后刺激腎上腺分泌糖皮質(zhì)激素(GC)[15-16]。近年研究表明,HPA軸可與神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)相互作用共同影響抑郁癥的發(fā)生分展,其功能亢進(jìn)不僅是抑郁癥重要的生L變化之一,而且還是可能的重要發(fā)病機(jī)制之一[17-18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組大鼠體質(zhì)量減輕,下丘腦相對(duì)質(zhì)量顯著升高,且血清中CRH、ACTH、CORT表達(dá)水平均顯著升高,提示模型組大鼠HPA軸持續(xù)功能亢進(jìn),導(dǎo)致大鼠睡眠障礙,并可能通過影響食欲引起大鼠體質(zhì)量下降。表明HPA軸的功能亢進(jìn)可能是抑郁癥睡眠障礙的發(fā)生發(fā)展重要的生L變化之一。β-EP是一種活力較強(qiáng)的神經(jīng)肽,具有止痛、抗抑郁、緩解壓力等作用,主要存在與下丘腦弓狀核和垂體中,起到抑制HPA軸功能紊亂的作用。當(dāng)機(jī)體持續(xù)受到外界刺激后,HPA軸表現(xiàn)為功能亢進(jìn),導(dǎo)致β-EP分泌和釋放也受到影響[19]。有研究發(fā)現(xiàn)[20],圍絕經(jīng)期抑郁癥模型大鼠血清中β-EP含量顯著降低。水通道蛋白4(AQP4)在腦組織中含量最為豐富,主要分布于下丘腦中,主要參與血漿滲透壓的調(diào)節(jié)和垂體加壓素的分泌。王宇紅等[21]研究報(bào)道,糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠AQP4表達(dá)減少,中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被破壞。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組大鼠腦組織β-EP、AQP4的表達(dá)水平較正常對(duì)照組均顯著降低,提示抑郁癥睡眠障礙引起的HPA軸功能紊亂可能是通過抑制β-EP和AQP4的分泌實(shí)現(xiàn)。

HPA軸和抑郁癥有重要的調(diào)控關(guān)系,因此尋找一種安全有效的抗抑郁癥藥物可有效改善患者睡眠質(zhì)量,對(duì)治療抑郁癥患者的睡眠障礙具有重要意義。安神補(bǔ)腦液主要組成成分有甘草、鹿茸、淫羊藿、大棗、干姜等,全方諸藥相合,具有氣血雙補(bǔ)、安神益智之功,能促進(jìn)腦部血液循環(huán),改善睡眠和食欲,緩解機(jī)體疲勞,改善患者精神狀態(tài)[7]。張海晶等[22]對(duì)大鼠長期連續(xù)灌胃安神補(bǔ)腦液(2.5、5、10 m L/kg)觀察其對(duì)大鼠產(chǎn)生的毒性反應(yīng)、嚴(yán)重程度、可能的毒作用靶器官及損害的可逆程度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)安神補(bǔ)腦液長期用藥對(duì)大鼠未見明確的毒性反應(yīng),停藥后也無延遲性毒性反應(yīng)。本研究采用安神補(bǔ)腦液治療抑郁癥睡眠障礙大鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療后,大鼠水平活動(dòng)與垂直活動(dòng)得分較模型組均顯著升高;下丘腦相對(duì)質(zhì)量及血清中 CRH、ACTH、CORT表達(dá)水平均顯著降低,而腦組織β-EP、AQP4的表達(dá)水平升高,提示安神補(bǔ)腦液可通過提高 β-EP、AQP4的表達(dá)水平,抑制HPA軸功能的紊亂。

綜上所述,安神補(bǔ)腦液可明顯抑制血清中CRH、ACTH、CORT的表達(dá)水平并提高腦組織β-EP、AQP4的含量,對(duì)抑郁癥睡眠障礙模型大鼠HPA軸具有較好的調(diào)節(jié)作用,為臨床治療抑郁癥睡眠障礙患者提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而安神補(bǔ)腦液中何種中藥成分起主要作用以及服用多少劑量安神補(bǔ)腦液的治療效果最好仍有待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。