金帆

二十一世紀(jì)臨床遺傳學(xué)最顯著的進(jìn)展無(wú)疑是高通量全基因組檢測(cè)技術(shù)在遺傳性疾病診斷中的大規(guī)模應(yīng)用和推廣[1]。以比較基因組雜交芯片（array comparative genomic hybridization，a-CGH）和單核苷酸多態(tài)芯片（single nucleotide polymorphism array，SNP array）為代表性的染色體芯片（chromosome array，CMA）[2]以及基于新一代 DNA 測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）的染色體拷貝數(shù)變異測(cè)序（chromosomal copy number variation sequencing，CNV-seq）[3]均可以診斷各類(lèi)常染色體非整倍體及不平衡的染色體結(jié)構(gòu)重排。這些方法不僅沒(méi)有染色體核型分析對(duì)受檢材料活性的苛刻要求和制備分析的繁雜過(guò)程，而且能夠精準(zhǔn)檢測(cè)核型分析無(wú)法檢出的各類(lèi)染色體微缺失、微重復(fù)綜合征，其中SNP array和高深度CNV-seq還可用于以雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）為特征的單親二倍體的檢測(cè)。高通量全基因組檢測(cè)技術(shù)具有快速、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為篩查智力低下、生長(zhǎng)遲緩、結(jié)構(gòu)畸形等出生缺陷兒遺傳學(xué)病因的重要方法。因檢測(cè)不再依賴細(xì)胞增殖活性，故各類(lèi)流產(chǎn)、引產(chǎn)或病故患兒組織均可用于檢測(cè)，各類(lèi)染色體微小片段缺失和重復(fù)構(gòu)成的致病性拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）不斷被發(fā)現(xiàn)，多種長(zhǎng)期原因不明的出生缺陷被確認(rèn)為染色體微缺失、微重復(fù)或單親二倍體基因印記性疾病[4]。我國(guó)許多產(chǎn)前診斷中心已將SNP array和CNV-seq作為胎兒遺傳學(xué)診斷的常規(guī)選項(xiàng)，歐美部分發(fā)達(dá)國(guó)家已將SNP-array作為胎兒細(xì)胞遺傳學(xué)診斷金標(biāo)準(zhǔn)。

基因病是指一類(lèi)因致病基因DNA單個(gè)堿基變異、一個(gè)或數(shù)個(gè)堿基缺失或插入導(dǎo)致的疾病。單基因病種類(lèi)眾多，目前已知有4 000余種，部分單基因病的致病基因非常龐大，如進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良致病基因DMD全長(zhǎng)可達(dá)百萬(wàn)堿基對(duì)；部分單基因病的發(fā)生可由不同基因突變所引起，如遺傳性多囊腎候選致病基因有PKD1、PKD2、PKHD等。傳統(tǒng)經(jīng)典的DNA測(cè)序采用雙脫氧核苷酸末端終止法，又稱Sanger四色熒光鏈終止法測(cè)序，雖然準(zhǔn)確性高，但單次DNA測(cè)序長(zhǎng)度通常在150堿基對(duì)以內(nèi)，測(cè)速慢，篩查確定單基因病突變效率低，曾長(zhǎng)期制約單基因病的DNA突變確定及其再生育防止。

NGS又稱高通量測(cè)序技術(shù)，包括模板制備、序列檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析等過(guò)程。NGS包括多個(gè)技術(shù)平臺(tái)，如大規(guī)模平行測(cè)序、焦磷酸測(cè)序、合成測(cè)序、鏈接測(cè)序、離子半導(dǎo)體測(cè)序、DNA納米球測(cè)序、基因組擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄子測(cè)序等。各技術(shù)平臺(tái)測(cè)序原理盡管各有不同，但其共同點(diǎn)是能同步進(jìn)行幾十至幾百萬(wàn)條短DNA分子大規(guī)模平行測(cè)序，獲得海量的序列信息，并利用強(qiáng)大的生物信息學(xué)工具進(jìn)行分析。通過(guò)疾病相關(guān)基因DNA片段單核苷酸變異、插入缺失、CNV等分析，既可經(jīng)目標(biāo)序列捕獲測(cè)序快速完成臨床診斷，明確單基因病致病基因全外顯子和（或）全序列的突變檢測(cè)[5]；又可依據(jù)臨床癥狀，實(shí)施癥候群所有疾病候選基因（基因套餐）[6]、全外顯子組（外顯子組測(cè)序，whole exome sequencing，WES）[7-8]，乃至全基因組DNA（全基因組測(cè)序，whole genome sequencing，WGS）[9]的突變檢測(cè)，篩出致病突變，經(jīng)傳統(tǒng)測(cè)序確定，反向完成疾病的臨床診斷。NGS的應(yīng)用大幅降低了單基因病家系突變篩查的難度，使多種單基因病的精準(zhǔn)基因的診斷和產(chǎn)前診斷技術(shù)得以快速普及。

多基因病是由多個(gè)基因與環(huán)境因素交互作用后發(fā)病的。上世紀(jì)八九十年代，人們?cè)噲D使用Sanger測(cè)序等傳統(tǒng)方法分析糖尿病等遺傳度較高的多基因病的遺傳因素，但均未獲得確切結(jié)論。但自大規(guī)模組學(xué)技術(shù)涉入該領(lǐng)域工作后，人們發(fā)現(xiàn)部分多基因病實(shí)為表現(xiàn)度較低或外顯不全的單基因病，部分為染色體微缺失、微重復(fù)，或某些染色體片段LOH。這些具有明確染色體拷貝數(shù)和DNA序列改變的患者可采用SNP-array或DNA突變檢測(cè)完成診斷和產(chǎn)前診斷，從而降低此類(lèi)遺傳學(xué)出生缺陷兒的再出生風(fēng)險(xiǎn)。NGS結(jié)合功能基因組分析還揭示了多種常見(jiàn)疾病的致病相關(guān)基因，闡明了這些基因相互作用導(dǎo)致缺陷兒出生的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，為相關(guān)遺傳病的產(chǎn)前診斷提供了可能[4]。

建立在體外受精-胚胎移植（in-vitro fertilization and embryo-transfer，IVF-ET）技術(shù)之上的植入前遺傳學(xué)檢測(cè)（preimplantation genetic testing，PGT）可將遺傳學(xué)檢測(cè)提前到胚胎植入子宮內(nèi)膜前，可預(yù)防遺傳性疾病妊娠的發(fā)生。但受限于植入前胚胎活檢材料的有限性（1～數(shù)個(gè)細(xì)胞），PGT-非正倍體篩查（PGT for aneuploidy screening，PGT-A）和 PGT-染色體結(jié)構(gòu)重排檢測(cè)（PGT for structural rearrangement，PGT-SR）長(zhǎng)期依賴熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH），后者一次只能檢測(cè)數(shù)個(gè)位點(diǎn)，提供極其有限的染色體異常信息，使胚胎宮內(nèi)移植后著床率偏低?，F(xiàn)活檢材料先行全基因組擴(kuò)增（whole genomic amplification，WGA），后續(xù)行CMA或CNV-seq全染色體組檢測(cè)，顯著改變了PGT-A和PGT-SR治療周期的臨床結(jié)局[10]。

PGT活檢材料僅含一個(gè)或數(shù)個(gè)靶基因模板，因此等位基因脫扣（allele drop-out，ADO）一直是影響單基因病PGD（PGT for monogenic disorder，PGT-M）成功的技術(shù)瓶頸。現(xiàn)通過(guò)家系突變基因連鎖SNP單倍體型分析，活檢材料經(jīng)WGA后，應(yīng)用NGS完成10～20個(gè)以上SNP位點(diǎn)的同步檢測(cè)分析，可將PGT-M的診斷準(zhǔn)確率提高到99.5%以上。加上WGA產(chǎn)物的同步CNV-seq拷貝數(shù)分析，同時(shí)剔除染色體檢測(cè)異常胚胎，PGT-M檢測(cè)胚胎移植后妊娠率、健康嬰兒出生率均有大幅提升。應(yīng)用NGS檢測(cè)第5天囊胚腔液或胚胎培養(yǎng)液的游離DNA，進(jìn)行微創(chuàng)/無(wú)創(chuàng)PGD成功的報(bào)道[11]也已發(fā)表。

探索開(kāi)展母親外周血中胎兒源性細(xì)胞或DNA的非宮內(nèi)侵入性胎兒遺傳學(xué)診斷技術(shù)是產(chǎn)前診斷工作者數(shù)十余年來(lái)不懈的追求。如今應(yīng)用NGS檢測(cè)血清中游離DNA，分析胎兒源性占比，已可非常高效地檢測(cè)21-三體綜合征，對(duì)13、18-三體綜合征也有很好的檢出率。由此無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)（non-invasive prenatal testing，NIPT）進(jìn)入臨床應(yīng)用階段[12]。按國(guó)家衛(wèi)健委的技術(shù)規(guī)范，目前NIPT仍為局限于胎兒13、18、21-三體綜合征篩查的產(chǎn)前篩查技術(shù)。但實(shí)際應(yīng)用中，NIPT檢測(cè)其他染色體非整倍體和部分不平衡結(jié)構(gòu)異常也有許多成功的報(bào)道。通過(guò)測(cè)序密度調(diào)整，可以篩查所有染色體數(shù)目異常、常見(jiàn)染色體不平衡結(jié)構(gòu)異常和數(shù)種微缺失綜合征的NIPT-plus試劑盒已經(jīng)開(kāi)發(fā)，并正在臨床推廣驗(yàn)證。目前NIPT/NIPT-plus仍然不能替代產(chǎn)前宮內(nèi)侵入性診斷，但比較傳統(tǒng)的母親血清生化二聯(lián)/三聯(lián)染色體非整倍體篩查，NIPT/NIPT-plus的篩查效率是極為高效的，相信通過(guò)進(jìn)一步的技術(shù)完善和成本降低，最終將會(huì)取代母親血清生化篩查。

雖然NIPT應(yīng)用于單基因病的診斷已見(jiàn)報(bào)道，但此項(xiàng)技術(shù)對(duì)家系突變明確、后代出生患兒高風(fēng)險(xiǎn)家系是否必要存有很大責(zé)疑。不過(guò)，將其應(yīng)用于單基因病產(chǎn)前（胎兒）篩查的前景卻是現(xiàn)實(shí)可行的。目前已有部分生物基因公司正在開(kāi)發(fā)適用于部分地區(qū)相對(duì)高發(fā)單基因病的產(chǎn)前篩查NIPT試劑盒，若開(kāi)發(fā)成功，則產(chǎn)前胎兒篩查僅限染色體非整倍體的歷史將宣告結(jié)束，取而代之的將是產(chǎn)前非整倍體和單基因病篩查技術(shù)的同步開(kāi)展[13]。

相對(duì)于目前仍處于技術(shù)探索階段的單基因病NIPT技術(shù)，通過(guò)基因套餐、WES或WGS篩查夫婦單基因病突變攜帶，發(fā)現(xiàn)同一常染色體隱性疾病基因突變攜帶的夫婦或X-連鎖隱性基因突變攜帶的女性[14]，后續(xù)產(chǎn)前或著床前單基因病基因診斷[15]，已成為目前國(guó)內(nèi)外部分產(chǎn)前診斷中心和輔助生殖中心推薦的孕前或產(chǎn)前檢測(cè)項(xiàng)目，目前該技術(shù)實(shí)際已具臨床應(yīng)用的可行性。

任何技術(shù)的發(fā)展均具有兩面性，以SNP-array和NGS為代表的現(xiàn)代基因組學(xué)診斷技術(shù)在快速推進(jìn)出生缺陷遺傳學(xué)病因診斷及再出生防止工作進(jìn)步的同時(shí)，也產(chǎn)生了許多新的問(wèn)題和挑戰(zhàn)。首先是檢出CNV和基因DNA變異的致病性和良性變異的確認(rèn)。人類(lèi)能夠真正閱讀自己整個(gè)基因組堿基序列還不到20年，我們對(duì)如宇宙一樣浩瀚的基因組DNA信息的認(rèn)識(shí)才剛剛開(kāi)始，已經(jīng)報(bào)道并在各基因網(wǎng)站登記的許多致病性/非致病性的位點(diǎn)仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證，對(duì)不斷增加的意義未明的變異/突變位點(diǎn)的解讀已成為目前進(jìn)行臨床遺傳學(xué)診斷的重大難題，亟需大規(guī)模數(shù)據(jù)整合、人群調(diào)查、功能驗(yàn)證，以提供同時(shí)反映基因外顯率、表現(xiàn)度、表型差異等影響因素的綜合信息，以更有效地指導(dǎo)和實(shí)施臨床診斷和再出生預(yù)防。在大規(guī)模基因組學(xué)技術(shù)推廣應(yīng)用的今天，仍有部分遺傳性疾病無(wú)法檢出明確的致病基因，結(jié)合以基因修飾、基因表達(dá)調(diào)節(jié)為目標(biāo)的表觀基因組學(xué)和功能基因組學(xué)，最終闡明疾病的基因組學(xué)改變，是遺傳學(xué)工作者的另一重大科學(xué)任務(wù)。

目前NIPT才起步不久，無(wú)創(chuàng)PGD仍處于幼兒期，由于兩者檢測(cè)的胎兒/胚胎游離DNA來(lái)源于絨毛/胚胎退行脫落凋亡的細(xì)胞，此類(lèi)細(xì)胞為非正倍體嵌合細(xì)胞的可能性會(huì)顯著高于正常生長(zhǎng)的胎兒/胚胎細(xì)胞，其檢測(cè)假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)可能增高。同時(shí)NIPT診斷范圍和診斷致病性仍然局限[15]，進(jìn)一步積累數(shù)據(jù)，調(diào)整測(cè)序密度和深度，實(shí)現(xiàn)NIPT的全染色體組檢測(cè)無(wú)疑將成為產(chǎn)前診斷的真正革命。

上世紀(jì)80年代提出，90年代開(kāi)始實(shí)施的人類(lèi)基因組計(jì)劃，聯(lián)合了美國(guó)、英國(guó)、日本、德國(guó)和中國(guó)的科學(xué)家，歷時(shí)15年，耗資30億美元，完成了人類(lèi)第一張基因組DNA序列的草圖[16]。2007年，人們用了200萬(wàn)美金，完成了DNA雙螺旋發(fā)現(xiàn)者之一Waston博士的全基因組測(cè)序。今天，如果你想完成這樣一次自身全基因組檢測(cè)可能只需1萬(wàn)元人民幣左右，快至數(shù)周即可收到檢測(cè)報(bào)告。北大三院課題組依據(jù)極體活檢，已經(jīng)成功完成一個(gè)卵母細(xì)胞的全基因測(cè)序工作[17]，這標(biāo)志著人類(lèi)已能夠從卵子和受精胚胎誕生之日起，就了解自己的遺傳物質(zhì)的組成，不僅能防止遺傳性疾病的發(fā)生，而且可用于遲發(fā)性、成年性疾病的易感性分析，進(jìn)行個(gè)體基因型和表現(xiàn)型的選擇。全基因組檢測(cè)技術(shù)在倫理學(xué)方面的挑戰(zhàn)同樣是巨大的，建立和完善相應(yīng)的法律規(guī)范顯然也是出生缺陷兒遺傳學(xué)診斷和再出生防治的任務(wù)之一[18]。

（本文由浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)推薦）