曹留炳， 仲愛芳

(聯(lián)勤保障部隊(duì)第九O四醫(yī)院常州醫(yī)療區(qū)檢驗(yàn)病理科， 江蘇 常州 213003)

胸腹水為進(jìn)展期惡性腫瘤最為常見臨床表現(xiàn)，胸腹水細(xì)胞檢查由于具有損傷小、方法簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，普遍應(yīng)用于進(jìn)展期惡性腫瘤臨床診斷和治療中[1]，而近年來(lái)隨著分子生物學(xué)研究地日益廣泛，分子生物學(xué)檢測(cè)及臨床靶向用藥為腫瘤患者提供新的治療方向，表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor ，EGFR)是一種有絡(luò)氨酸激酶活性的重要跨膜受體，EGFR信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及分化等生理過(guò)程密切相關(guān)[2]。進(jìn)展期腫瘤患者多已失去手術(shù)治療時(shí)機(jī)，近年來(lái)EGFR的分子靶向用藥逐漸應(yīng)用于進(jìn)展期惡性腫瘤患者治療中，EGFR分子靶向藥物進(jìn)入體內(nèi)會(huì)特異地選擇致癌位點(diǎn)并與之相結(jié)合發(fā)生作用，使腫瘤細(xì)胞特異性死亡，但研究表明僅有33.3%患者對(duì)EGFR為靶點(diǎn)的分子靶向藥物敏感[3]?；诖吮尘埃疚耐ㄟ^(guò)探討EGFR基因在胸腹水細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義，以期為腫瘤患者分子靶向用藥提供參考，具體結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1一般資料：收集2018年6月至2019年6月本院存檔的72例胸腹水細(xì)胞蠟塊標(biāo)本。①納入標(biāo)準(zhǔn)：患者臨床資料和病歷資料完整；標(biāo)本采集前未接受相關(guān)治療。②排除標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)本經(jīng)鏡下觀察顯示腫瘤細(xì)胞量<200個(gè)。72例患者，男45例、女27例，年齡22～70，平均(59.07±6.11)歲。其中惡性腫瘤53例(肺癌29例、乳腺癌12例、原發(fā)性肝癌8例、其他4例)、良性病變19例(細(xì)菌性肺炎11例、結(jié)核性胸膜炎5例、肝硬化3例)；惡性腫瘤患者，男性32例，女性21例，年齡22～69歲，平均(58.94±6.08)歲；良性病變患者，男性13例，女性6例，年齡23～70歲，平均(59.71±6.15)歲，惡性腫瘤、良性病變患者性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病例患者均經(jīng)組織病理檢查確診，隨訪結(jié)果顯示惡性腫瘤經(jīng)病理組織學(xué)檢查EGFR基因突變2例。

1.2方法:主要儀器和試劑：EGFR鼠單克隆抗體由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司提供，全自動(dòng)免疫組化儀器由羅氏公司提供，顯微鏡由奧林巴斯公司提供；EGFR基因序列、qRT-PCR試劑盒由廣州銳博生物科技有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀來(lái)源于美國(guó)ABI公司，RNA提取試劑盒源自凱杰公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由BIOMIGA公司提供。免疫組化：①樣本處理，抽取的胸水樣本輕微搖勻后分別放置在離心管(50mL)中，常規(guī)離心(2500r/min)5min后，其中一管送至細(xì)胞室涂片以初步評(píng)估細(xì)胞學(xué)病理情況。另一管丟棄上清液，隨后吸取全部細(xì)胞層至干凈的離心管中，以獲得胸水細(xì)胞的懸液。常規(guī)離心(2500r/min)3min后，丟棄上清液，獲取胸水細(xì)胞沉淀物，并檢測(cè)EGFR基因突變情況。②胸腹水細(xì)胞蠟塊標(biāo)本處理，前3步與上述相同，在胸水沉淀物中加適量95%乙醇，混勻后室溫靜置35min，常規(guī)離心(3500r/min)離心3min，棄上清液，取出沉淀物置于無(wú)塵紙上，包好放置在包埋盒中，常規(guī)脫水-浸蠟包埋成蠟塊-切片-免疫組化染色。③免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定：以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒定義為陽(yáng)性染色，同時(shí)半定量分析染色結(jié)果，在高倍鏡下觀察五個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞不高于4%=0分，5%～24%=1分，25%～49%=2分，50%～74%=3分，≥75%=4分；根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)估：無(wú)色、淡黃、棕黃、棕褐色分別對(duì)應(yīng)0分、1分、2分、3分；兩項(xiàng)計(jì)分的乘積=0分視為陰性，1～2分為弱陽(yáng)性，3～4分記為中等陽(yáng)性，>4分記為強(qiáng)陽(yáng)性，其中弱陽(yáng)性、中等陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性歸為陽(yáng)性。(3)EGFR基因表達(dá)量檢測(cè)：采用Real-Time PCR法檢測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量，具體操作步驟：RNA提取-逆轉(zhuǎn)錄合成cRNA-引物設(shè)計(jì)-三步法擴(kuò)增-結(jié)果分析[以管家基因β-Actin為內(nèi)參照基因，每個(gè)樣本測(cè)3次取平均Ct值(相差0.5個(gè)Ct值則舍棄)，相對(duì)定量采用2-ΔΔCt法，其中ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(管家基因)，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組ΔCt-對(duì)照組ΔCt]。(4)EGFR基因位點(diǎn)檢測(cè)：應(yīng)用突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)法和EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(實(shí)時(shí)熒光PCR法)，按照試劑盒說(shuō)明書提取DNA后采用突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)法檢測(cè)EGFR基因突變情況，每批次實(shí)驗(yàn)均選用陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

1.3觀察指標(biāo)：①胸腹水細(xì)胞蠟塊中EGFR基因的免疫組化染色情況分析。②胸腹水細(xì)胞中EGFR基因的相對(duì)表達(dá)情況分析。③胸腹水細(xì)胞中EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果分析，其中EGFR基因無(wú)突變?yōu)橐吧?，而存在任意類型的突變?yōu)橥蛔冃汀＂軔盒圆∽冃馗顾?xì)胞中EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果與組織病理結(jié)果對(duì)照分析。

2 結(jié) 果

2.1胸腹水細(xì)胞蠟塊中EGFR基因的免疫組化染色情況分析：免疫組化結(jié)果顯示EGFR基因在良性胸腹水細(xì)胞中呈陰性、弱陽(yáng)性表達(dá)，而惡性胸腹水細(xì)胞中呈不同強(qiáng)度陽(yáng)性表達(dá)，并且惡性病變胸腹水細(xì)胞的EGFR陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于良性病變胸腹水細(xì)胞(P<0.05)，見表1和圖1。

表1 胸腹水細(xì)胞蠟塊中EGFR基因的免疫組化染色情況分析

圖1 a：肺癌胸腹水細(xì)胞石蠟塊免疫組化染色(×100)；b：肝硬化胸腹水細(xì)胞石蠟塊免疫組化染色(×100)

圖1a提示惡性病變胸腹水細(xì)胞中EGFR基因呈陽(yáng)性表達(dá)，如圖中箭頭所示(染色強(qiáng)度為棕褐色，且陽(yáng)性細(xì)胞占比高)；而圖1b提示良性病變胸腹水細(xì)胞中EGFR基因呈陰性表達(dá)，如圖中箭頭所示(染色強(qiáng)度為淡黃色，但不高于4%)。

表2 胸腹水細(xì)胞中EGFR基因的相對(duì)表達(dá)量分析

2.2胸腹水細(xì)胞中EGFR基因的相對(duì)表達(dá)量分析：惡性病變胸腹水細(xì)胞中EGFR基因的相對(duì)表達(dá)量較良性病變胸腹水細(xì)胞中EGFR基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3胸腹水細(xì)胞中EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果分析：53例惡性病變胸腹水細(xì)胞中EGFR基因突變1例，其中EGFR基因第19外顯子被證實(shí)存在缺失突變(E746-A750 DEL)；而EGFR基因第18，20，21外顯子未發(fā)現(xiàn)突變和SNP位點(diǎn)。

2.4惡性病變胸腹水細(xì)胞中EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果與組織病理結(jié)果對(duì)照分析：惡性病變胸腹水細(xì)胞中EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果與組織病理結(jié)果的一致性較好，Kappa值=0.658，檢測(cè)的準(zhǔn)確率為98.08%，見表3。

表3 惡性病變胸腹水細(xì)胞中EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果與組織病理結(jié)果對(duì)照分析(n)

3 討 論

EGFR抑制劑靶向用藥是進(jìn)展期腫瘤患者有效治療手段，但臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)在EGFR抑制劑應(yīng)用后不可避免地出現(xiàn)耐藥情況，主要原因與EGFR基因突變所致耐藥突變有關(guān)，為提高進(jìn)展期腫瘤患者的靶向用藥有效性，進(jìn)一步積極探尋動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)基因突變的方法至為重要[4]。胸腹水細(xì)胞檢查是病理學(xué)診斷的重要手段之一，然而常規(guī)胸腹水涂片上所富集的腫瘤細(xì)胞量少，較難精確地提供組織學(xué)來(lái)源，無(wú)法適用于免疫組化的鑒別診斷，目前隨著胸腹水細(xì)胞蠟塊技術(shù)逐漸應(yīng)用于病理學(xué)鑒別診斷中，胸腹水細(xì)胞蠟塊不僅可多次取材且可富集腫瘤細(xì)胞。HE細(xì)胞不存在皺縮及變性，明顯提高了細(xì)胞病理學(xué)診斷的準(zhǔn)確性，與手術(shù)標(biāo)本及穿刺標(biāo)本在病理診斷和基因檢測(cè)等方面相比較，胸腹水細(xì)胞蠟塊檢查有創(chuàng)傷小、實(shí)時(shí)檢測(cè)耐藥基因或探尋其他藥物敏感基因等明顯的優(yōu)勢(shì)[5]。

研究表明無(wú)法獲取組織活檢的晚期非小細(xì)胞肺癌患者，胸腹水細(xì)胞蠟塊技術(shù)檢測(cè)患者EGFR基因突變狀態(tài)較血液標(biāo)本更具優(yōu)勢(shì)，且可取代組織學(xué)標(biāo)本檢測(cè)，另一項(xiàng)研究報(bào)告則指出外周血ctDNA中EGFR基因突變型患者的客觀緩解率和疾病控制率明顯高于野生型患者，且中位無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間較野生型患者的長(zhǎng)[6]。本結(jié)果顯示EGFR基因在良性胸腹水細(xì)胞石蠟塊標(biāo)本中呈陰性、弱陽(yáng)性表達(dá)，惡性胸腹水細(xì)胞石蠟塊標(biāo)本中呈不同強(qiáng)度的陽(yáng)性表達(dá)，惡性病變胸腹水細(xì)胞中EGFR基因的相對(duì)表達(dá)量較良性病變胸腹水細(xì)胞中EGFR基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高，初步表明EGFR基因在進(jìn)展期惡性腫瘤中呈明顯上調(diào)趨勢(shì)。EGFR屬于一種抑制細(xì)胞凋亡的跨膜蛋白，研究表明其在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及分化中起著重要作用，故而推測(cè)EGFR基因或參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[7]。

早期文獻(xiàn)報(bào)道非小細(xì)胞肺癌患者中檢測(cè)EGFR基因的突變狀態(tài)是決定患者是否采用EGFR-絡(luò)氨酸激酶抑制劑治療的首要條件[8]。另一項(xiàng)研究則指出EGFR-絡(luò)氨酸激酶抑制劑可明顯延長(zhǎng)EGFR基因突變陽(yáng)性非小細(xì)胞肺癌患者的總生存期和無(wú)病生存期[9]?；?9外顯子缺失突變和21外顯子L85 8 R位點(diǎn)的突變可提高其結(jié)合抑制劑的能力。而本結(jié)果顯示53例惡性病變胸腹水細(xì)胞石蠟塊中EGFR基因突變1例，其中EGFR基因第19外顯子被證實(shí)存在缺失突變，突變位點(diǎn)為E746-A750 DEL，而EGFR基因第18，20，21外顯子未發(fā)現(xiàn)突變和SNP位點(diǎn)，與上述研究證實(shí)的21外顯子L85 8 R位點(diǎn)的突變?cè)黾铀幬锩舾行缘挠^點(diǎn)存在一定差異，提示EGFR基因突變位點(diǎn)為E746-A750 DEL可能對(duì)EGFR-絡(luò)氨酸激酶抑制劑類藥物敏感，對(duì)于存在E746-A750 DEL位點(diǎn)基因突變的腫瘤患者可推薦應(yīng)用EGFR-絡(luò)氨酸激酶抑制劑類藥，利于患者病情的有效控制，同時(shí)臨床過(guò)程中需動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤患者EGFR基因突變情況以及時(shí)掌握用藥情況。此外，本結(jié)果還證實(shí)了惡性病變胸腹水細(xì)胞中EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果與組織病理結(jié)果的一致性較好，說(shuō)明惡性病變胸腹水細(xì)胞中EGFR基因突變的檢測(cè)可作為腫瘤患者個(gè)體化治療方案的制定提供參考。

綜上所述，EGFR基因在胸腹水細(xì)胞中的表達(dá)呈明顯上調(diào)趨勢(shì)，且胸腹水細(xì)胞中可用于惡性腫瘤患者驅(qū)動(dòng)基因檢測(cè)的有效依據(jù)，EGFR基因在胸腹水細(xì)胞中的檢測(cè)有助于臨床篩選靶向用藥適用患者，有望為患者制定個(gè)體化治療方案提供參考。