范茁，吳振強(qiáng)

華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州510006

心血管疾病是威脅中老年人身體健康的主要疾病，發(fā)病率隨年齡增長而提高。心肌肥大是高血壓、心肌缺血等心血管疾病發(fā)展過程中的病理狀態(tài)，持續(xù)的心血管壓力、容積過載會(huì)誘發(fā)心肌細(xì)胞多種信號分子的改變，引起心肌纖維化，舒縮功能損傷，最終導(dǎo)致心衰死亡。心肌肥大的一個(gè)重要臨床表現(xiàn)是心率失常，觸發(fā)了一系列細(xì)胞因子及生化分子的改變［1-4］，嚴(yán)重心率失常會(huì)誘發(fā)猝死，心率失常在單細(xì)胞電生理水平上則表現(xiàn)為動(dòng)作電位時(shí)程和跨膜離子電流的改變。瞬時(shí)外向鉀離子電流（Ito）存在于多種哺乳動(dòng)物心肌組織，其構(gòu)成成分有Kv4.2、Kv4.3、Kv1.4等，KChIP作為輔助亞基可以調(diào)節(jié)Kv通道的表達(dá)、激活和失活等動(dòng)力學(xué)特性。大鼠等嚙齒類動(dòng)物心肌細(xì)胞Ito主要由Kv4.2和Kv4.3組成，受KChIP2亞基調(diào)節(jié)。Ito可影響心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的早期復(fù)極化的形態(tài)，決定動(dòng)作電位的時(shí)程［5-11］。2020年3—11月，我們觀察了大鼠肥大心肌細(xì)胞動(dòng)作電位、Ito變化，并探討其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及溶液 配制溶液鹽類、ISO購自美國Sigma公司；Ⅱ型膠原酶和蛋白酶購自美國Wrothington公司；肝素鈉和戊巴比妥鈉購自阿拉丁試劑公司；RT-PCR試劑盒購自日本Takara公司。

1.2 大鼠肥大心肌細(xì)胞模型制備 ①心肌細(xì)胞分離：采用酶解法急性分離大鼠心室肌細(xì)胞，具體方法如下：取1只成年雄性SD大鼠，腹腔注射肝素鈉（1 000 U/kg），戊巴比妥鈉（0.2 mg/100 g）注射麻醉，腹部向上平放于托盤上，用剪刀減去胸部被毛，之后用75%的酒精消毒胸部皮膚，用滅菌剪刀剪開胸部皮膚組織，露出劍突，用止血鉗夾緊并掀開劍突，用消毒小剪刀剪開胸部隔膜，露出心臟，迅速剪斷心臟主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈及周圍組織，將心臟放于預(yù)冷無鈣臺式液（Tyrodes）中，輕輕擠壓排出血液，之后將心臟懸掛于灌流裝置上，灌流無鈣臺式液3 min，用0.8 mg/mLⅡ型膠原酶和50μmol/L Ca2+的臺式液繼續(xù)灌流消化2 min，接著用含0.8 mg/mLⅡ型膠原酶、0.1 mg/mL蛋白酶和200μmol/L Ca2+的臺式液循環(huán)灌流消化30 min，至心臟軟榻時(shí)剪下心室，在含有0.8 mg/mLⅡ型膠原酶和600μmol/L Ca2+的臺式液中剪碎并振蕩消化3 min。過濾后于500 r/min離心1 min，最后將所得細(xì)胞在M199培養(yǎng)基中重懸并分置于培養(yǎng)皿待用。②肥大心肌細(xì)胞模型制備及鑒定：通過異丙腎上腺素孵育法在體外誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，具體方法如下：將上述酶解急性分離方法得到的心肌細(xì)胞分置于10個(gè)左右35 mm的小培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿數(shù)量由急性分離得到的細(xì)胞濃度決定，每次試驗(yàn)略有差異。將細(xì)胞分為兩組，其中一組加入5μmol/L的異丙腎上腺素（觀察組），另一組則加入同等體積的去離子水作為對照（對照組），在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)24 h后可用于做電生理實(shí)驗(yàn)或分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。肥大心肌細(xì)胞模型通過細(xì)胞形態(tài)觀察和檢測細(xì)胞肥大標(biāo)志因子ANP和BNPmRNA表達(dá)兩種方法進(jìn)行鑒定。我們使用奧林巴斯顯微鏡獲得細(xì)胞圖片，之后用圖像分析處理軟件Image Pro Plu 6.0對觀察組和對照組的細(xì)胞面積進(jìn)行計(jì)算。隨機(jī)選取視野內(nèi)100個(gè)細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析顯示觀察組細(xì)胞面積為（2 084.5±186.9）μm2，對照組為（1 694.7±103.5）μm2，觀察組細(xì)胞面積較對照組有顯著增大（P<0.05）。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）檢測測定細(xì)胞肥大標(biāo)志因子ANP、BNP mRNA。首先用Takara RNAiso plus試劑盒提取心肌細(xì)胞總RNA，之后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒去除基因組DNA，設(shè)置好反應(yīng)程序，將樣品放入RT-PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。GAPDH為內(nèi)參基因，用于對表達(dá)量進(jìn)行校正，校正后mRNA表達(dá)量與對照組做比值得到相對表達(dá)量。觀察組ANP、BNPmRNA相對表達(dá)量分別增加至對照組的（1.6±0.1）倍和（2.8±0.08）倍。上述結(jié)果表明，成功誘導(dǎo)了體外肥大心肌細(xì)胞模型。

1.3 大鼠肥大心肌細(xì)胞動(dòng)作電位及Ito檢測 動(dòng)作電位檢測：采用膜片鉗的電流鉗記錄模式，由時(shí)長5 ms，幅度900 pA的刺激脈沖電流誘發(fā)，動(dòng)作電位時(shí)程取復(fù)極化90%的時(shí)間（APD90）。膜片鉗系統(tǒng)使用HEKA EPC10放大器，Patch-Master記錄軟件。所有數(shù)據(jù)使用Origin8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Ito檢測：采用膜片鉗的電壓鉗記錄模式，鉗制電壓為－80 mV。刺激電壓為-40～+50 mV、梯度為10 mV的脈沖電壓，持續(xù)時(shí)間300 ms。細(xì)胞內(nèi)外液成分如下：外液（單位mmol/L）：NaCl 138，KCl 4，MgCl21，CaCl22，NaH2PO40.33，HEPES10，Glucose 10，CdCl20.3（pH 7.4）。內(nèi)液（單位mmol/L）KCl 130，MgCl21，Mg-ATP 5，EGTA 10，HEPES5（pH 7.2）。

1.4 大鼠肥大心肌細(xì)胞Kv4.2、Kv4.3、KChIP2 mRNA檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測肥大心肌細(xì) 胞Kv4.2、Kv4.3、KChIP2 mRNA，具體 方法 同“1.2”檢測步驟。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Origin8.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程比較 觀察組和對照組動(dòng)作電位時(shí)程（APD90值）分別為（68.2±4.1）、（52.0±5.9）ms，兩組比較，P<0.05。

2.2 兩組心肌細(xì)胞Ito幅度、電流密度比較 觀察組和對照組在+50 mV刺激電壓下的電流幅度分別為543、1 116.1 pA，在+50 mV刺激電壓下的電流密度分別為（2.4±0.5）、（5.0±1.0）pA/pF，兩組比較，P均<0.05。

2.3 兩組心肌細(xì)胞Kv4.2、Kv4.3、KChIP2 mRNA相對表達(dá)量比較 觀察組和對照組Kv4.2 mRNA相對表達(dá)量分別為56.2±6.9、100±24.8，Kv4.3 mRNA相對表達(dá)量分別為58.5±8.4、100.0±11.1，KChIP2 mRNA相對表達(dá)量分別為32.3±7.8、100.0±15.9，兩組比較，P均<0.05。

3 討論

心血管疾病一直是威脅中老年人身體健康的主要疾病，發(fā)病率隨年齡增長而提高，未得到有效治療往往會(huì)因心力衰竭致死。心肌肥大是高血壓、心肌缺血等心血管疾病發(fā)展過程中的病理特征，臨床上表現(xiàn)為心室壁增厚和心肌重量增加。心肌肥厚在開始階段屬于壓力容積過載情況下的適應(yīng)性反應(yīng)，此階段心肌能維持正常的輸出功能，心肌肥厚的狀態(tài)可逆轉(zhuǎn)，長時(shí)間高負(fù)荷會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)部生理生化因子發(fā)生不可逆的變化，造成成纖維細(xì)胞的聚集和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的過量沉積，這些將導(dǎo)致心室肌細(xì)胞硬化和輸縮功能障礙，最終引起心力衰竭而死亡［12-14］。在心肌肥大早期給予藥物治療，可有效改善心肌肥大狀態(tài)，避免向不可逆的心衰階段發(fā)展，降低患者的病死率。心肌細(xì)胞肥大過程涉及到多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如分裂原激活蛋白激酶通路、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路等，包含內(nèi)胞內(nèi)外多種蛋白和信號分子的變化，如血管緊張素、β腎上腺素能受體、G蛋白耦聯(lián)受體、活性氧（ROS）、胞內(nèi)Ca2+等［15-18］。β腎上腺素能受體可被血管緊張素激活，是肥大心肌細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的上游分子。

心肌肥大的一個(gè)重要臨床表現(xiàn)是心率失常，嚴(yán)重的心率失常往往會(huì)導(dǎo)致猝死，在心肌肥大階段研究心率不齊的根本原因及分子機(jī)制，通過藥物改善心率不齊的現(xiàn)象，也是一有效的治療方法。宏觀的心率不齊在單細(xì)胞電生理水平表現(xiàn)為細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程的改變，及構(gòu)成跨膜電位的離子通道電流變化。本文結(jié)果表明，觀察組心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程比對照組顯著延長，肥大心肌細(xì)胞在+50 mV電壓脈沖刺激下的Ito電流密度較對照組下降。動(dòng)作電位和Ito的變化是肥大心肌細(xì)胞在單細(xì)胞電生理水平上呈現(xiàn)的物理特征，還需要研究影響肥大心肌細(xì)胞電生理特性變化的分子機(jī)制，以闡明改變其電生理特征的內(nèi)在影響因子，并進(jìn)一步為臨床治療提供可能的參考靶點(diǎn)。

心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的形成取決于不同階段離子電流的變化。Ito存在于多種哺乳動(dòng)物心肌組織，其構(gòu)成成分有Kv4.2、Kv4.3、Kv1.4等［19-20］。Ito的觸發(fā)時(shí)間位于動(dòng)作電位峰值后的迅速復(fù)極階段，其電流幅度大小直接影響動(dòng)作電位的時(shí)程［21］。構(gòu)成大鼠心肌細(xì)胞Ito的主要離子通道為Kv4.2、Kv4.3及其輔助亞基KChIP2，這些通道基因表達(dá)量發(fā)生變化或者受胞內(nèi)生理生化因子的功能調(diào)控都將影響Ito的大?。?2-24］。本 研 究 表 明，觀 察 組Kv4.2、Kv4.3、KChIP2 mRNA相對表達(dá)量較對照組低，這一結(jié)果和Ito的變化是一致的。然而mRNA表達(dá)水平不能完全反應(yīng)細(xì)胞膜蛋白表達(dá)量的變化，要在分子機(jī)制上得到確切結(jié)論，還需結(jié)合Western Blot方法檢測3種蛋白的表達(dá)量。此外，通道蛋白功能是否受到胞內(nèi)信號分子調(diào)控也有待進(jìn)一步研究。

總之，大鼠肥大心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程顯著延長，Ito顯著下降，分子機(jī)制可能與Kv4.2、Kv4.3、KChIP2等相關(guān)離子通道蛋白表達(dá)降低有關(guān)。本研究是對心肌肥大發(fā)展過程中的病理生理機(jī)制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的適當(dāng)補(bǔ)充，對臨床藥物研發(fā)和藥理分析有一定的參考意義。研究仍存在一些不足之處，盡管我們在細(xì)胞電生理角度研究了肥大心肌細(xì)胞動(dòng)作電位、Ito等電生理特征的變化，揭示其分子機(jī)制為Kv4.3、Kv4.3、KChIP2等相關(guān)離子通道表達(dá)水平的改變，然而引起Kv4.3、Kv4.3、KChIP2等相關(guān)基因表達(dá)改變的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究，特別是這些離子通道基因調(diào)控和已知心肌肥大信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否有關(guān)聯(lián)；腎上腺素能受體如何通過G蛋白、PKA磷酸激酶等信號分子作用并調(diào)控離子通道基因的表達(dá)，其上下游關(guān)系如何仍有待闡明。