高瑋寧 馬善濤 何勇軍 謝怡寧

摘要：近年來，顯微鏡自動成像技術(shù)被廣泛運(yùn)用到自動閱片領(lǐng)域。聚焦窗口選擇方法是顯微鏡自動聚焦算法中的關(guān)鍵技術(shù)，直接影響自動聚焦算法的性能。傳統(tǒng)聚焦窗口選擇方法選擇固定位置和固定大小區(qū)域計(jì)算清晰度評價函數(shù)，聚焦效率低且容易造成聚焦失敗。針對這一問題，提出了一種基于圖像灰度投影的聚焦窗口選擇方法。該方法采用灰度投影法和自適應(yīng)均值區(qū)間查找算法確定聚焦窗口。首先沿坐標(biāo)軸方向計(jì)算圖像的灰度投影，然后依據(jù)自適應(yīng)均值區(qū)間查找算法在灰度投影序列中合適的子區(qū)間，根據(jù)子區(qū)間在坐標(biāo)軸的位置構(gòu)建出位置和尺寸準(zhǔn)確聚焦窗口。實(shí)驗(yàn)表明灰度投影取窗法可以跟蹤偏離中心的主體區(qū)域，是一種具有自適應(yīng)性的聚焦窗口選擇方法，能顯著提高自動聚焦精確率和速度。

關(guān)鍵詞：自動聚焦;區(qū)域選擇算法;灰度投影;自適應(yīng)性;醫(yī)學(xué)圖像

DOI：10.15938/j.jhust.2021.05.008

中圖分類號：TP182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1007-2683（2021）05-0060-08

0 引言

近年來自動閱片技術(shù)發(fā)展迅速，并且逐漸取代傳統(tǒng)的人工閱片。該技術(shù)主要由計(jì)算機(jī)控制電機(jī)平臺[1]，利用工業(yè)相機(jī)采集清晰的細(xì)胞圖像，結(jié)合深度學(xué)習(xí)的方法對細(xì)胞圖像進(jìn)行分析，識別病變細(xì)胞。與傳統(tǒng)的人工閱片相比，該技術(shù)可有效地減輕醫(yī)生工作強(qiáng)度。

自動閱片采用自動聚焦的方式確保拍攝到清晰的圖像。目前自動聚焦可分為主動聚焦和被動聚焦兩大類[2]。主動聚焦通過測量待拍攝物體與鏡頭之間距離，將鏡頭移動到物體焦點(diǎn)位置達(dá)到聚焦目的。這種方法依賴高精度測距儀器，成本高、實(shí)現(xiàn)復(fù)雜。被動聚焦則通過顯微鏡下圖像的清晰度為反饋，自動控制鏡頭和載物臺相對移動，搜索焦點(diǎn)位置以拍攝到清晰圖片。相比主動聚焦，被動聚焦成本低，易于實(shí)現(xiàn)，目前被廣泛運(yùn)用于自動閱片領(lǐng)域[3]。其中關(guān)鍵技術(shù)在于清晰度評價函數(shù)和焦點(diǎn)搜索算法。

圖像清晰度評價函數(shù)分成3大類：頻域分析函數(shù)，灰度梯度函數(shù)，信息熵函數(shù)[4]。其中常見的清晰度評價函數(shù)有灰度差分絕對值之和算子（SMD）[5]，Tenengrad梯度函數(shù)[6]，Laplace梯度函數(shù)[7]，Roberts梯度函數(shù)和低灰度值統(tǒng)計(jì)函數(shù)[8]等。

SMD對每一個像素領(lǐng)域兩個灰度差相乘后再逐個像素累加。Tenengrad梯度函數(shù)使用Sobel算子提取水平和垂直方向的梯度值，求其平方和作為圖像的清晰度評價標(biāo)準(zhǔn)[9]。Laplace梯度函數(shù)使用La-place算子對圖像進(jìn)行模板卷積得到圖像的高頻分量，然后對圖像的高頻分量求和，用高頻分量和作為圖像的清晰度評價標(biāo)準(zhǔn)[10]。Roberts梯度函數(shù)計(jì)算方式類似SMD，區(qū)別是像素領(lǐng)域中對角線方向點(diǎn)差值再逐個像素累加。低灰度值統(tǒng)計(jì)函數(shù)通過設(shè)置閾值統(tǒng)計(jì)灰度值低于閾值的像素點(diǎn)個數(shù)作為圖像的清晰度評價標(biāo)準(zhǔn)[11]。

目前廣泛使用爬山搜索法。爬山法從初始位置移動，比較移動前后位置上圖像的清晰度并始終朝著清晰度增加的方向移動，即“爬山”，直到清晰度開始降低停止。清晰度最高的點(diǎn)被視為焦點(diǎn)位置即“山頂”。爬山搜索算法主要分為定步爬山法和變步爬山法[12]。

對于大多數(shù)實(shí)用場景，清晰度評價函數(shù)可以滿足聚焦要求。但在圖像內(nèi)容較少、噪聲影響較大的情況下，清晰度評價函數(shù)得到的清晰度曲線較為平坦并且存在較多的局部極值，最大值也不顯著，這往往會導(dǎo)致自動聚焦失敗[13]。針對此問題，有學(xué)者提出通過選取圖像中某一特定的區(qū)域作為聚焦窗口以提高自動聚焦成功率[14]。

聚焦窗口選擇算法可以減少數(shù)據(jù)計(jì)算量，消除背景像素與雜質(zhì)像素對清晰度評價函數(shù)的影響，進(jìn)而提高聚焦準(zhǔn)確率。聚焦窗口選擇方法分為靜態(tài)取窗法和動態(tài)取窗法。靜態(tài)取窗法包括中心取窗法[15]，多區(qū)域取窗法[16]等。動態(tài)取窗法包括一階矩取窗法[17]，差影取窗法[18]等。前者通常是選取圖像中某個固定區(qū)域作為固定窗口，后者對圖像內(nèi)容進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，選取一個最優(yōu)的區(qū)域作為聚焦窗口。

中心取窗法選取圖像中心區(qū)域作為聚焦窗口。中心取窗法認(rèn)為在拍攝時關(guān)注的主體部分通常在視場中央，只要圖像的中央?yún)^(qū)域處于聚焦?fàn)顟B(tài)，則認(rèn)為整張圖像達(dá)到了聚焦?fàn)顟B(tài)。多區(qū)域取窗法選取圖像中具有代表性的幾個區(qū)域作為聚焦窗口。中心取窗法和多區(qū)域取窗法構(gòu)建的聚焦窗口的位置和尺寸都缺乏自適應(yīng)性[19]。

一階矩取窗法通過計(jì)算圖像的灰度一階矩確定圖像的“質(zhì)心”，在“質(zhì)心”的周圍構(gòu)建聚焦窗口。差影取窗法的具體做法是原圖像與經(jīng)模糊化處理后的圖片對應(yīng)像素點(diǎn)的灰度值做減法得到前景圖像，做減法可以削弱圖像的相似部分，得到圖片之間的差異，凸顯圖像的主體部分。在實(shí)際應(yīng)用中，一階矩取窗法與差影取窗法計(jì)算得到聚焦窗口位置選取不準(zhǔn)確。而且一階矩取窗法與差影取窗法仍然未解決聚焦窗口尺寸固定的問題。

綜上所述，靜態(tài)取窗法假定主體景物是可以提前預(yù)知的，導(dǎo)致在聚焦窗口位置選取和聚焦窗口尺寸確定兩個方面都缺乏自適應(yīng)性，往往會造成聚焦失敗。動態(tài)取窗法雖然在聚焦窗口位置選取方面有所改善，但是仍然有聚焦位置選取不準(zhǔn)確，聚焦窗口尺寸固定等問題，尤其在小景深系統(tǒng)聚焦中（例如顯微鏡系統(tǒng)）效果欠佳。

為解決以上問題，提出一種基于細(xì)胞圖像灰度投影的聚焦窗口選擇方法。首先，對目標(biāo)細(xì)胞圖像進(jìn)行灰度值取反操作。然后沿坐標(biāo)軸方向計(jì)算圖像灰度投影，在得到的灰度投影序列中尋找灰度投影平均值最大的子區(qū)間。在尋找灰度投影平均值最大子區(qū)間時，又提出一種自適應(yīng)均值區(qū)間查找算法：在得到的灰度投影序列中尋找灰度投影平均值最大且長度合適的子區(qū)間，通過子區(qū)間在坐標(biāo)軸上的位置便可構(gòu)建出聚焦窗口。灰度投影取窗法解決了聚焦窗口位置和尺寸固定的問題，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在細(xì)胞圖像聚焦方面有著良好的效果。

1 灰度投影聚焦窗口選擇方法

1.1 灰度投影聚焦窗口方法原理介紹

對于細(xì)胞圖像來說，細(xì)胞密集區(qū)域邊緣信息豐富，細(xì)胞密集區(qū)域的像素點(diǎn)往往灰度梯度呈現(xiàn)顯著變化，這些特征有利于清晰度函數(shù)計(jì)算。從圖像信息嫡的角度來說，細(xì)胞圖像密集區(qū)域所包含的信息量更大，在聚焦中有更好的聚焦效果。細(xì)胞密集區(qū)域通常是灰度投影平均值高并且面積較大的區(qū)域。以灰度投影平均值高并且面積較大的區(qū)域作為聚焦窗口可以追蹤的密集區(qū)域。

灰度值投影聚焦窗口選擇法基于細(xì)胞圖像的分布特點(diǎn)，以圖像灰度投影在坐標(biāo)軸方向上分布的密集程度作為基準(zhǔn)確定圖像的主體部分。聚焦窗口選擇示意圖如圖1所示，其中陰影區(qū)域?yàn)榫劢勾翱??；叶韧队熬劢勾翱谶x擇方法流程圖如圖2所示。

1.2 灰度值取反

在進(jìn)行灰度投影和自適應(yīng)均值區(qū)間查找之前，要對目標(biāo)圖像進(jìn)行灰度值取反處理。

在細(xì)胞圖像中，細(xì)胞密集區(qū)域的灰度值比細(xì)胞稀疏區(qū)域的灰度值低。采取灰度值取反的目的是要在灰度投影序列中找灰度平均值最大的子區(qū)間?；叶戎等》从?jì)算方法如下。

f（x，y）=255-f（x，y）（1）其中f（x，y）是圖像第x行，第y列的像素灰度值。

1.3 灰度投影算法

灰度投影算法是一種圖像映射，把輸入的圖像二維灰度信息映射成兩個獨(dú)立的一維投影序列。采取灰度投影的目的是獲得坐標(biāo)軸方向上的灰度投影序列。

首先將目標(biāo)圖像進(jìn)行灰度值取反操作。計(jì)算水平灰度值投影和垂直灰度投影。灰度值投影計(jì)算方式如下：其中：G（x）是圖像第x行的灰度投影值;G（y）是圖像第y列的灰度投影值;f（x，y）是圖像第x行，第y列的像素灰度值。

1.4 自適應(yīng)均值區(qū)間查找算法

聚焦窗口選擇方法不僅要選取邊緣信息豐富的區(qū)域，而且要選取尺寸合適的區(qū)域。聚焦區(qū)域過小會造成圖像細(xì)節(jié)的缺失，聚焦區(qū)域過大會導(dǎo)致聚焦效果不顯著。所以對于不同密集程度的細(xì)胞圖像，算法應(yīng)該創(chuàng)建出不同尺寸的聚焦區(qū)域。越稀疏的細(xì)胞圖像聚焦窗口越大，越密集的細(xì)胞圖像聚焦窗口越小。為解決聚焦窗口尺寸難以確定的問題，提出一種自適應(yīng)均值區(qū)間查找算法。

首先計(jì)算圖像的平均灰度值（圖像已經(jīng)進(jìn)行灰度值取反），統(tǒng)計(jì)細(xì)胞圖像中像素值高于平均灰度值的像素點(diǎn)個數(shù)為m。平均灰度值的計(jì)算方法如下。其中f（x，y）是圖像第x行，第y列的像素灰度值;θ代表平均灰度值;M，N分別代表圖像的長度和寬度。

隨后在一個長度為n的灰度投影序列a中，尋找長度為m且區(qū)間平均值最大的子區(qū)間。我們采用二分法的思想設(shè)計(jì)算法。

設(shè)置二分查找的左右邊界為left和right。其中l(wèi)eft等于灰度投影序列中的最小值，right等于灰度投影序列中的最大值。令mid為左右邊界平均值，即mid等于（left+right）/2。然后判斷是否存在一個長度為m并且區(qū)間平均值大于等于mid的子區(qū)間。

若直接進(jìn)行判斷算法時間復(fù)雜度會很高，所以引入前綴和。設(shè)前綴和為sum，前i項(xiàng)的前綴和為sum[i]。

所以，若存在某個子區(qū)間[x，x+m]滿足sum[x+m]-sum[x]≥0，表明這個子區(qū)間均值大于此時的mid，則記錄本次查找到的子區(qū)間的左右邊界為[x，x+m]，將二分查找的左邊界left更新為mid，繼續(xù)進(jìn)行二分查找;若不存在這樣一個子區(qū)間，則將二分查找的右邊界right更新為mid，繼續(xù)進(jìn)行二分查找。直到二分查找結(jié)束，此時便找到平均值最大的子區(qū)間。

對兩個灰度投影序列使用自適應(yīng)均值查找算法確定兩個子區(qū)間，通過這兩個子區(qū)間在坐標(biāo)軸上的位置構(gòu)建出聚焦窗口。

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.1 實(shí)驗(yàn)環(huán)境介紹

實(shí)驗(yàn)基于實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的DNA倍體自動分析系統(tǒng)，系統(tǒng)如圖3所示。

DNA倍體自動聚焦分析系統(tǒng)的工作原理：首先，工業(yè)攝像機(jī)通過物鏡采集濾光片照射下玻片上的樣本圖像，采集信息傳輸?shù)接?jì)算機(jī)。然后通過編程計(jì)算圖像的清晰度，并使用焦點(diǎn)搜索算法將下一個焦點(diǎn)指令發(fā)送給控制盒。控制盒向控制垂直運(yùn)動的電機(jī)發(fā)送下步的指令，直至最終聚焦成功。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 取窗方法

1）中心取窗法

中心取窗法假定主體目標(biāo)在圖像中心，是早期自動聚焦中經(jīng)常使用的方法。中心取窗法選取的聚焦區(qū)域尺寸通常為圖像的1/16，計(jì)算量減少了93.8%。構(gòu)建窗口方法如下。其中f（x，y）代表圖像中第x行，第y列的像素點(diǎn);M，N分別代表圖像的長度和寬度。

2）一階矩取窗法

一階矩取窗法以數(shù)學(xué)中質(zhì)心的概念為基礎(chǔ)，該方法不再假定主體目標(biāo)在圖像中心。利用圖像的灰度一階矩計(jì)算得到圖像的“質(zhì)心”，以此為中心構(gòu)建聚焦窗口。該方法可以使聚焦窗口靠近主體部分。具體方法如下。其中f（x，y）代表圖像中第x行，第Y列的像素點(diǎn)的灰度值;（xc，yc）代表質(zhì)心位置;M，N分別代表圖像的長度和寬度。

3）差影取窗法

差影取窗法首先對原圖進(jìn)行高斯模糊處理，然后用原圖與模糊后的圖像進(jìn)行做差，突出圖像主體部分，然后用一階矩取窗的方法構(gòu)建窗口。流程圖如圖4所示。

圖4 差影取窗法流程圖

計(jì)算圖像質(zhì)心的方法是式（11）。差影圖像的計(jì)算方法如下，其中：f（x，y）代表原圖像中第x行，第y列的像素點(diǎn)的灰度值;g（x，y）代表模糊圖像中第x行，第y列的像素點(diǎn)的灰度值;F（x，y）代表差影圖像中第x行，第y列的像素點(diǎn)的灰度值。

F（x，y）=f（x，y）-g（x，y）（12）

2.2.2 清晰度評價函數(shù)

Laplace梯度函數(shù)采用Laplace算子與圖像各像素點(diǎn)的灰度值進(jìn)行卷積得到一個梯度矩陣記為G（x，y），取各點(diǎn)像素點(diǎn)梯度的平方和作為清晰度評價函數(shù)的輸出是F。具體公式如下。其中f（x，y）代表圖像中第x行，第y列的像素點(diǎn)的灰度值;*為卷積運(yùn)算符號;L為Laplace算子。

2.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為細(xì)胞圖像，使用實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)采集20張離焦-聚焦-再離焦的圖像序列作為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，圖像分辨率為2048×2048，其中第10張為清晰聚焦圖像。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖5所示。

選取細(xì)胞圖像序列中一張較為清晰的細(xì)胞圖像。圖6是3種取窗方法與灰度投影取窗法的取窗效果比較。

4種方法取窗效果由圖6所示，目標(biāo)細(xì)胞圖像中邊緣信息較豐富的區(qū)域并未處于圖像中心。其中灰度投影取窗法較為準(zhǔn)確地在細(xì)胞密集的區(qū)域構(gòu)建出了聚焦窗口?？梢娀叶韧队叭〈胺梢宰粉櫰x細(xì)胞圖像中心的主體部分。而中心取窗法，一階矩取窗法和圖像差影取窗法的取窗效果接近，均未定位到圖像主體部分。

首先，為了比較4種取窗方法選取細(xì)胞密集區(qū)域的能力，實(shí)驗(yàn)選取20張離焦-聚焦-再離焦的細(xì)胞圖像序列，計(jì)算四種取窗方法構(gòu)建的聚焦窗口中細(xì)胞前景像素面積占比曲線。其結(jié)果如圖7所展示的細(xì)胞前景像素面積占比曲線。可以看出灰度投影取窗法構(gòu)建的聚焦窗口中細(xì)胞前景像素的面積占比高于另外3種取窗法的面積占比。實(shí)驗(yàn)表明灰度投影取窗法選取的聚焦區(qū)域有較高的細(xì)胞密集度。

根據(jù)細(xì)胞圖像像素分類理論，細(xì)胞圖像中的像素分為背景像素，內(nèi)容像素與雜質(zhì)像素[17，20]。因?yàn)閮?nèi)容像素的灰度梯度變化率較高，所以在聚焦窗口中的平均灰度梯度變化率越高意味著內(nèi)容像素比例越高，越有利于清晰度評價函數(shù)的計(jì)算。

接下來，實(shí)驗(yàn)選取20張離焦-聚焦-再離焦的細(xì)胞圖像序列，通過比較4種取窗方法取得的聚焦窗口中像素的灰度梯度變化率，評估四種取窗方法對內(nèi)容像素的選取能力。其結(jié)果如圖8所展示的灰度梯度變化率曲線。從圖中可以看出，灰度投影取窗法的灰度梯度變化率高于另外3種方法。實(shí)驗(yàn)表明灰度投影取窗法可以精確地構(gòu)建出包含較多內(nèi)容像素的聚焦窗口。

為了確定4種取窗方法對清晰度曲線的影響，實(shí)驗(yàn)選取20張離焦-聚焦-再離焦的細(xì)胞圖像序列，其中第10張為清晰聚焦圖像。對比4種取窗法方法得到的清晰度評價曲線（統(tǒng)一使用Laplace清晰度評價函數(shù)）。其結(jié)果如圖9所展示的清晰度評價曲線。理想的清晰度評價函數(shù)應(yīng)具有單峰性和靈敏性的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)分別從這兩個方面驗(yàn)證灰度投影聚焦窗口選擇方法。從圖中可以看出，4種取窗方法得到的清晰度曲線均有單峰性，但是灰度投影取窗法的單峰位置最接近準(zhǔn)確聚焦位置，在實(shí)際的聚焦任務(wù)中可以準(zhǔn)確地找到焦點(diǎn)位置。中心取窗法，一階矩取窗法和差影取窗法得到的清晰評價曲線的敏銳性比灰度投影方法得到的清晰度評價曲線的敏銳性差，并且有更多的局部極值。實(shí)驗(yàn)表明灰度投影取窗方法可以使清晰度評價曲線具有高靈敏性和良好的單峰性。

為了比較4種取窗方法的計(jì)算效率，統(tǒng)計(jì)各取窗方法計(jì)算20張圖片的平均清晰度和平均聚焦時間。其結(jié)果如表1所展示。在清晰度方面，灰度投影取窗法的平均清晰度高于其它3種取窗方法。在聚焦時間方面，由于中心取窗方法是靜態(tài)取窗的，所以在計(jì)算時間上有絕對的優(yōu)勢。而灰度投影取窗法比一階矩取窗法和差影取窗法計(jì)算量小，所以聚焦所用時間少。實(shí)驗(yàn)表明灰度投影取窗法有良好的計(jì)算效率。

圖10是灰度投影取窗法針對不同細(xì)胞圖像的取窗效果?；叶韧队叭〈胺ㄡ槍Σ煌募?xì)胞圖像，構(gòu)建了不同尺寸的聚焦窗口，有良好的自適應(yīng)性。

最后，為了測試自適應(yīng)性窗口尺寸對灰度投影取窗法的影響。實(shí)驗(yàn)選取20張離焦-聚焦-再離焦的細(xì)胞圖像序列，其中第10張為清晰聚焦圖像。比較自適應(yīng)性窗口尺寸灰度投影取窗法和非自適應(yīng)性窗口尺寸灰度投影取窗法得到的清晰度評價曲線（統(tǒng)一使用Laplace清晰度評價函數(shù)）。其結(jié)果如圖11所展示的兩種取窗方法的清晰度評價曲線。由于自適應(yīng)性窗口尺寸灰度投影取窗法可以選擇合適尺寸的聚焦窗口，避免聚焦窗口尺寸過大或過小帶來的誤差，清晰度評價曲線的靈敏性更好。

3 結(jié)論

中心取窗法等靜態(tài)區(qū)域選擇方法利用單點(diǎn)或多點(diǎn)固定區(qū)域，選擇圖像中央?yún)^(qū)域少量像素集合，顯然很難保證目標(biāo)圖像位于所選擇的區(qū)域中。一階矩取窗法不再簡單地認(rèn)為圖像主體部分位于圖像中央，采用以圖像灰度分布和邊緣為基準(zhǔn)，對圖像的主體部分進(jìn)行追蹤，比中心取窗法效果略好，但仍有選取主體部分不準(zhǔn)確和計(jì)算量大等缺點(diǎn)。差影取窗法因計(jì)算量大并且取窗位置不準(zhǔn)確，在聚焦表現(xiàn)中效果較差。灰度投影取窗法因受圖像灰度梯度變化率和細(xì)胞形態(tài)分布的影響，以灰度投影的分布作為構(gòu)建聚焦窗口的基準(zhǔn)，對圖像主體內(nèi)容部分和內(nèi)容像素體現(xiàn)出良好的跟蹤效果，又因其聚焦窗口的尺寸對于不同的細(xì)胞圖像有著較強(qiáng)的自適應(yīng)性，在聚焦中顯示出良好的效果。

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（編輯：溫澤宇）

收稿日期：2020-04-29

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（61673142）;黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（F2017013）;黑龍江省自然科學(xué)基金杰出青年項(xiàng)目（JJ2019JQ0013）;哈爾濱市杰出青年人才基金（2017RAYXJ013）;黑龍江省普通本科高等學(xué)校青年創(chuàng)新人才項(xiàng)目（UNPYSCT-2016034）;黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（12511096）;哈爾濱理工大學(xué)青年拔尖創(chuàng)新人才（20152）;中國博士后基金（20132303120003）.

作者簡介：高瑋寧（1997-），男，碩士研究生;

馬善濤（1996-），男，碩士研究生.

通信作者：謝怡寧（1979-），女，博士，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：xieyining@hrbust.edu.cn.