沙門氏菌噬菌體LPST144尾纖維gp38的序列分析及其結(jié)合活性

楊其樂，丁一峰，張 宇，聶若男，李亞萌，王 佳，王小紅

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

沙門氏菌是導(dǎo)致食源性疾病的主要病原菌，在全球范圍內(nèi)，每年約造成9 380萬 例腸胃炎疾病，以及15.5萬 人死亡[1]。沙門氏菌是一類革蘭氏陰性短桿菌，需氧或兼性厭氧，腸桿菌科沙門氏菌屬，由腸炎沙門氏菌種和邦戈沙門氏菌種組成[2-3]。沙門氏菌分布廣泛，菌型繁多，目前使用標(biāo)準(zhǔn)Kauffman-White方案已鑒定超過2 600 種血清型，而大多數(shù)血清型能夠在包括人類在內(nèi)的多種動(dòng)物宿主中寄生，其中腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌是導(dǎo)致人畜共患病的兩種主要血清型[4]。近年來，抗生素的大量使用導(dǎo)致了耐藥性沙門氏菌的出現(xiàn)，耐藥沙門氏菌的強(qiáng)毒力、高死亡率引起了廣泛關(guān)注[5]。因此，為預(yù)防沙門氏菌對(duì)人類健康以及經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成重大危害，對(duì)其進(jìn)行有效的安全監(jiān)控和監(jiān)督、建立快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法具有重要意義。

噬菌體作為一種細(xì)菌病毒，能夠特異性吸附、侵染細(xì)菌并完成自我復(fù)制[6]，最早發(fā)現(xiàn)于一個(gè)世紀(jì)以前，用于對(duì)分子生物學(xué)基本原理的探究[7]。在自然環(huán)境中，噬菌體幾乎無處不在，海洋、土壤、深海噴口以及飲用水、食物中都存在噬菌體。同時(shí)，噬菌體也是地球上數(shù)量最多的生物體，其數(shù)目約為1030～1031，且具有多樣性[8]。噬菌體侵染細(xì)菌，完成其生命周期的第一步是特異性識(shí)別并結(jié)合細(xì)菌表面受體，其主要識(shí)別的細(xì)菌表面受體為脂多糖和細(xì)菌表面蛋白上特定的殘基[9]，噬菌體顆粒中承擔(dān)這一重要功能的蛋白被稱為受體結(jié)合蛋白（receptor binding proteins，RBPs），存在于噬菌體尾纖維或者尾刺的末端[10-12]。由于RBPs介導(dǎo)的宿主識(shí)別是高度特異性的，因此，可以利用RBPs作為分子識(shí)別元件進(jìn)行宿主菌的特異性檢測(cè)技術(shù)研究[13-14]。

目前報(bào)道較多的噬菌體RBPs有：T4 gp37、gp12；T2 gp38；P22 gp9和T7 gp17[15-16]。一般而言，RBPs具有如下特點(diǎn)：具有模塊化性質(zhì)，N端連接噬菌體粒子主體，序列同源性較高，C端為受體識(shí)別區(qū)決定宿主范圍，序列相似度較低；許多已知的RBPs受體識(shí)別區(qū)富含β結(jié)構(gòu)，通常會(huì)形成三聚體且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[16-17]；許多尾刺蛋白還具有水解活性，目前已知的具有水解活性的尾刺蛋白已被鑒定有215 個(gè)，這些RBPs能夠降解脂多糖、磷壁酸等生物聚合物，為噬菌體進(jìn)入細(xì)胞膜注入DNA掃清道路[17]；一個(gè)噬菌體可以有多個(gè)RBPs，例如T4噬菌體具有短尾纖維（gp12）和長(zhǎng)尾纖維（gp37）[18]，且在吸附過程中承擔(dān)著不同的功能，T4噬菌體與宿主菌靠近后，長(zhǎng)尾纖維（gp37）識(shí)別連接細(xì)菌表面一級(jí)受體，此時(shí)的結(jié)合可逆，隨后T4噬菌體在細(xì)菌表面依靠長(zhǎng)尾纖維移動(dòng)，當(dāng)周圍有2～3 個(gè)一級(jí)受體并與之相連后，信號(hào)傳遞導(dǎo)致底板構(gòu)象改變，釋放短尾纖維（gp12），其不可逆地結(jié)合宿主二級(jí)受體，最后尾部收縮，注入噬菌體DNA[19]。由于RBPs具有以上特點(diǎn)，將其用作檢測(cè)探針有以下優(yōu)點(diǎn)：易于大量獲得；RBPs具有模塊化的性質(zhì)，可將受體結(jié)合區(qū)分離，改造優(yōu)化，可將具有不同宿主范圍的RBPs融合表達(dá)，擴(kuò)大宿主范圍[20-21]；與易發(fā)生重組和突變的完整噬菌體粒子相反，克隆原性在生產(chǎn)過程中保持不變，性質(zhì)穩(wěn)定，更適于商業(yè)化[16,22]。同時(shí)RBPs的一些性質(zhì)也導(dǎo)致了研究的困難：首先，RBPs序列多樣性大，受體識(shí)別區(qū)序列相似性低，且一種噬菌體可能同時(shí)具有一種或者一種以上的RBPs[23]，這些特點(diǎn)導(dǎo)致生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)的困難[24]；其次，了解噬菌體RBPs的結(jié)構(gòu)能極大促進(jìn)噬菌體識(shí)別機(jī)制理論的發(fā)展，而尾纖維的柔性結(jié)構(gòu)導(dǎo)致結(jié)晶困難，因此對(duì)結(jié)構(gòu)研究和識(shí)別機(jī)制理論的揭示和發(fā)展造成了巨大的挑戰(zhàn)[25]。

本研究分析實(shí)驗(yàn)室前期分離得到的1 株沙門氏菌噬菌體LPST144尾纖維gp38的理化性質(zhì)、遺傳進(jìn)化關(guān)系和二級(jí)結(jié)構(gòu)，旨在完成尾纖維基因orf38異源表達(dá)純化以及其特異性結(jié)合活性的驗(yàn)證，為后續(xù)開發(fā)基于噬菌體RBPs為分子探針建立沙門氏菌檢測(cè)方法奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

噬菌體LPST144由實(shí)驗(yàn)室前期分離保存，為1 株鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimuriumATCC13311）烈性噬菌體，短尾科，T7類噬菌體；已完成其基因組測(cè)序，GenBank登錄號(hào)為MN252582；鼠傷寒沙門氏菌ATCC13311（S. typhimuriumATCC13311）、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028（S. typhimuriumATCC14028）、鼠傷寒沙門氏菌ST-8（S. typhimuriumST-8）、鼠傷寒沙門氏菌UK-1（S. typhimuriumUK-1）、腸炎沙門氏菌SJTUF10978（S. enteritidisSJTUF10978）、腸炎沙門氏菌SJTUF10984（S. enteritidisSJTUF10984）、腸炎沙門氏菌10960（S. enteritidis10960）、金黃色葡萄球菌6538（Staphylococcus aureus6538）和大腸桿菌T10（Escherichia coliT10）為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種；沙門氏菌外膜蛋白Ompc為實(shí)驗(yàn)室異源表達(dá)純化得到。

根據(jù)噬菌體LPST144基因組注釋結(jié)果，設(shè)計(jì)上下游引物擴(kuò)增orf38基因序列，引物序列如下：orf38F：5’-CGGGATCCCGATGGCACTTAAATT-3’，orf38R：5’-CCGCTCGAGCGGATAGAAGTAGTGAAT-3’（下劃線分別代表BamH I和XhoI酶切位點(diǎn)），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、聚會(huì)酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物回收試劑盒 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；質(zhì)粒pSmart-I、E.coliBL21 美國(guó)Addgene公司；HisPur Ni-NTA Resin蛋白純化樹脂 美國(guó)Thermo Fisher公司；BCA蛋白定量試劑盒 默克生命科學(xué)；鼠抗組氨酸抗體、山羊抗鼠抗體 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；脫脂奶粉 美國(guó)BD-Difco公司；9018型酶標(biāo)板 美國(guó)康寧公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5417R小型臺(tái)式冷凍離心機(jī) 貝克曼庫爾特公司；BSO-130011A2超凈臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HNY-2102C全溫振蕩培養(yǎng)箱 武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；M200 PRO酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 噬菌體LPST144 gp38序列理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和遺傳進(jìn)化分析

通過在線工具ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)gp38序列的理化性質(zhì)，包括等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)和親水系數(shù)；使用軟件DNAMAN作多序列比對(duì)；使用NCBI CDD和Pfam數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)序列保守結(jié)構(gòu)域；通過在線工具PredictProtein（https://www.predictprotein.org/）預(yù)測(cè)gp38序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用NCBI BLAST工具查找GenBank數(shù)據(jù)庫中與gp38具有相似性的序列，并使用MEGA7繪制進(jìn)化樹（Tree method：Maximum likelihood；Max Seq Difference：0.85；Distance：Grishin）。實(shí)驗(yàn)涉及到的尾纖維同源序列包括：LPST144（QEP53513）；BP12A（YP_009303689）；phiSG-JL2（YP_001949790）；SH2（YP_009289339）；SH1（YP_009289339）；phiIBBPF7A（YP_004306354）；Pf-10（YP_009145638）；Ebrios（AVJ51925）；Kvp1（YP_002308420）；Patroon（QBQ72909）；fPS-21（SOO46777）；fPS-9（SOL37536）；fPS-19（SOO46422）；fPS-89（SOO46625）；vB_KpnP_NahiliMali（QEG13382.1）；fPS-10（SOO46575.1）；vB_KpnP_Sibilus（QEG12954.1）；fPS-59（SOO46827）；vB_KpnP_Emp27（QEG11854.1）；E-2（YP_009226215）；2050H2（ASZ79018）；phiYeO3-12（NP_052117）；T7（AAM43539）；13a（YP_002003979）；YpsP-G（AFK13534）；T3（NP_523342）；phiA1122（NP_848304）。

1.3.2 尾纖維基因orf38的克隆以及重組表達(dá)載體的構(gòu)建

以噬菌體LPST144的基因組為模板，設(shè)計(jì)引物orf38F（5’-CGGGATCCCGATGGCACTTAAATT-3’）、orf38R（5’-CCGCTCGAGCGGATAGA-AGTAGTGAAT-3’）（下劃線分別代表BamH I和XhoI酶切位點(diǎn)）擴(kuò)增目的基因orf38。使用限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI酶切擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pSmart-I，參照TaKaRa公司的BamH I和XhoI說明書，配制酶切體系并選擇最佳酶切條件。按照QIAquick Gel Extraction Kit操作說明書對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收，根據(jù)T4 DNA連接酶的說明書，將目的基因與質(zhì)粒pSmart-I的雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒后用EcoR I和XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定，將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送至公司測(cè)序。

1.3.3 重組蛋白的表達(dá)和純化

挑取陽性單克隆接種于含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)。取1 mL轉(zhuǎn)接于100 mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600nm值為0.6～0.8左右。吸取1 mL未經(jīng)誘導(dǎo)的菌液作為陰性對(duì)照，在剩余的菌液中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）（終濃度1 mmol/L）誘導(dǎo)，將加入IPTG后的菌液分別按下列條件進(jìn)行培養(yǎng)：16 ℃培養(yǎng)12 h，37 ℃培養(yǎng)12 h，16 ℃培養(yǎng)4 h以及37 ℃培養(yǎng)4 h。收集不同表達(dá)條件的樣品，12 000 r/min離心15 min收集菌體。用10 mL的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）重懸菌體，超聲破碎細(xì)胞（功率200 W），超聲時(shí)間2 s，間隔2 s，總計(jì)40 min，之后12 000 r/min離心10 min收集上清液。分別取10 μL樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）驗(yàn)證表達(dá)情況。

取上述最佳表達(dá)條件下的上清液樣品，采用HisPur Ni-NTA樹脂親和層析純化目的蛋白，取1 mL親和樹脂裝柱，鎳柱用PBS平衡后，加入破碎后的上清樣品過柱，分別使用含有50、300 mmol/L咪唑的PBS洗去雜蛋白，并洗脫目的蛋白。純化后的目的蛋白透析處理，在0.01 mol/L PBS中，4 ℃過夜去除咪唑。將透析后的蛋白樣品利用10 kDa超濾管濃縮，4 000 r/min低溫離心30 min，棄去濾出液。將最終截留的蛋白樣品分裝置于-20 ℃保存，取5 μL進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。采用BCA蛋白定量試劑盒繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的蛋白濃度。

1.3.4 重組蛋白的活性檢測(cè)

將宿主鼠傷寒沙門氏菌ATCC13311培養(yǎng)至OD600nm值為0.8～1.2，平板計(jì)數(shù)，離心收集菌體，用1 mL無菌PBS將菌體懸浮于離心管，終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的甲醛滅活，4 ℃過夜；將滅活后的菌體用無菌PBS洗滌4 次，并以無菌PBS調(diào)整菌濃度至107CFU/mL，取100 μL宿主菌和其他6 株不同血清型的沙門氏菌（鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、鼠傷寒沙門氏菌ST-8、鼠傷寒沙門氏菌UK-1、腸炎沙門氏菌SJTUF10978、腸炎沙門氏菌SJTUF10984、腸炎沙門氏菌10960）包被于96 孔板，同時(shí)包被100 μL 5 μg/mL沙門氏菌外膜蛋白、100 μL 107CFU/mL滅活后的金黃色葡萄球菌6538和大腸桿菌T10以及100 μL PBS對(duì)照，4 ℃過夜；加入300 μL 3%脫脂牛奶于37 ℃封阻2 h，用PBST（含0.05%吐溫20的PBS）洗滌5 次后每孔加入100 μL 0.05 mg/mL的gp38蛋白（加100 μL PBS作為對(duì)照），37 ℃孵育1 h，再依次加入50 μL 0.2 μg/mL鼠抗組氨酸抗體（一抗）、50 μL 0.2 μg/mL山羊抗鼠抗體（二抗），每一步之間用PBST洗滌5 次。然后加入底物3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺在37 ℃顯色15 min，最后加入50 μL 2 mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)，并在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每次設(shè)3 個(gè)平行。運(yùn)用GraphPad Prism軟件進(jìn)行繪圖和分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用ANOVA進(jìn)行Duncan差異分析（P＜0.05，差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 尾纖維蛋白gp38基本理化性質(zhì)分析

利用ProtParam工具對(duì)gp38序列理化性質(zhì)進(jìn)行分析，gp38由646 個(gè)氨基酸組成，等電點(diǎn)為5.94。不穩(wěn)定系數(shù)為22.37，親水系數(shù)為-0.368。一般而言，不穩(wěn)定系數(shù)小于40表明該蛋白較為穩(wěn)定，親水系數(shù)為負(fù)值表明該蛋白具有一定的親水性。從圖1可見，gp38的氨基酸中含量最高的是丙氨酸（A），占全部氨基酸的11.5%，甘氨酸（G）、蘇氨酸（T）、纈氨酸（V）、精氨酸（R）和天冬酰胺（N）含量較高，占比在6.5%～9.4%之間，含量最低的是半胱氨酸（C），占全部氨基酸的0.5%。非極性氨基酸占比為39.8%，極性氨基酸的占比較高為60.2%，其中帶正電荷的極性氨基酸（K+R+H）有82 個(gè)，占12.7%，帶負(fù)電的極性氨基酸（D+E）有74 個(gè)，占11.4%，其余的極性氨基酸為233 個(gè)，占36.1%。

圖1 噬菌體LPST144尾纖維gp38氨基酸組成Fig. 1 Amino acid compositions of phage LPST144 tail fiber gp38

2.2 尾絲蛋白gp38的遺傳進(jìn)化分析

將噬菌體LPST144 gp38的氨基酸序列與NCBI nr數(shù)據(jù)庫做BLAST比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，選擇相似度較高的序列用于后續(xù)的進(jìn)化分析。如圖2所示，噬菌體LPST144與噬菌體BP12A單獨(dú)聚為一簇，相似度最高、親緣關(guān)系最近，而與其他噬菌體T7、T3等親緣關(guān)系明顯較遠(yuǎn)，表明噬菌體LPST144和BP12A的尾纖維在序列上與nr數(shù)據(jù)庫中其他噬菌體的尾纖維具有明顯的差異。

圖2 噬菌體LPST144尾纖維gp38的遺傳進(jìn)化分析Fig. 2 Genetic evolution analysis of phage LPST144 tail fiber gp38

根據(jù)圖2結(jié)果，選擇親緣關(guān)系不同的8 種噬菌體尾纖維（表1）進(jìn)一步比對(duì)分析。如圖3A所示，序列比對(duì)結(jié)果顯示N端保守性較好，同時(shí)在該區(qū)域預(yù)測(cè)到兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別是：1～261位尾纖維蛋白，CDD數(shù)據(jù)庫索引號(hào)為cl28018；279～331位噬菌體尾部領(lǐng)狀區(qū)域，Pfam數(shù)據(jù)庫索引號(hào)為pfam07484；而C端序列變異度較大。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，噬菌體尾纖維的N端通常與噬菌體主體連接，C端負(fù)責(zé)結(jié)合宿主菌，宿主菌表面受體的多樣性導(dǎo)致C端序列的多樣性[26]。前期工作中鑒定了T7與LPST144同屬于Teseptimavirus屬，T7噬菌體的尾纖維gp17與噬菌體LPST144的尾纖維gp38的氨基酸序列相似度為41%，覆蓋率為54.21%。Garcia-Doval等[27]于2012年對(duì)T7噬菌體尾纖維gp17 C端377～533位進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析，結(jié)果表明T7噬菌體gp17最后84 個(gè)氨基酸（470～553位）由8 個(gè)β-折疊結(jié)構(gòu)（B～I(xiàn)）和無規(guī)卷曲組成，形成4 個(gè)主要環(huán)狀結(jié)構(gòu)（BC、DE、FG和HI環(huán)），構(gòu)成T7噬菌體尾纖維尖端結(jié)構(gòu)域的一個(gè)單體，是識(shí)別和結(jié)合宿主菌受體的關(guān)鍵序列。因此將這一部分區(qū)域進(jìn)一步比對(duì)分析，結(jié)果如圖3B所示，總體來看，LPST144與BP12A尾纖維序列匹配非常好，在這一區(qū)間內(nèi)僅有兩個(gè)堿基的差異，而與phiSGJL2、SH1、SH2和T7、YpsP-G、T3、phiA1122，分為3 組，組內(nèi)各自匹配度較好，驗(yàn)證了圖2進(jìn)化分析的結(jié)果，另一方面，由于各組之間序列差異大，未找到整體的核心保守區(qū)。

表1 噬菌體LPST144尾纖維gp38的同源性分析Table 1 Homology analysis of phage LPST144 tail fiber gp38

噬菌體T7 gp17的C末端富含β-折疊的區(qū)域是受體識(shí)別結(jié)合關(guān)鍵區(qū)，目前已知其520位的天冬氨酸（D）突變?yōu)楣劝彼幔‥）后可裂解E. coliB，544位的纈氨酸（V）突變?yōu)楸彼幔ˋ）后可裂解E. coliK12[28]，高同源性噬菌體phiA1122尾纖維523位亮氨酸（L）突變?yōu)榻z氨酸（S）后，其宿主譜也發(fā)生了改變[29]（圖3B下劃線標(biāo)記處）。通過分析比較LPST144 gp38 C末端的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)同樣存在大量的β-折疊結(jié)構(gòu)，推測(cè)這些富含β-折疊的區(qū)域可能與宿主表面受體的識(shí)別和結(jié)合有關(guān)。不同的是T7 gp17的金字塔結(jié)構(gòu)和頂端結(jié)構(gòu)之間由1 個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)連接，頂端結(jié)構(gòu)由8 個(gè)β-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)組成，gp38的C末端由12 個(gè)β-折疊（a～n）結(jié)構(gòu)組成，緊接的是1 個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)（o）。T7 gp17具有2 個(gè)半胱氨酸（C），不形成二硫鍵，gp38具有3 個(gè)半胱氨酸（C），預(yù)測(cè)結(jié)果顯示同樣未形成二硫鍵。另一方面，前期工作中已經(jīng)鑒定了LPST144與BP12A屬于兩個(gè)不同的物種（未發(fā)表），理論上兩者的宿主范圍會(huì)有一定的差異，其gp38 C末端與噬菌體BP12A尾纖維C末端高度相似，僅有2 個(gè)氨基酸（533位和612位）的差異（圖3B方框標(biāo)記位點(diǎn)），推測(cè)這2 個(gè)位點(diǎn)可能是受體識(shí)別和結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。

圖3 噬菌體LPST144尾纖維gp38序列比對(duì)分析Fig. 3 Amino acid sequence alignment analysis of phage LPST144 tail fiber gp38

2.3 尾纖維基因orf38的克隆以及重組表達(dá)載體pSmart-I-gp38的構(gòu)建

圖4 重組質(zhì)粒pSmart-I-gp38雙酶切電泳圖Fig. 4 Electrophoresis profile of recombinant plasmid pSmart-I-gp38 after double enzyme digestion

以噬菌體LPST144的基因組序列為模板，設(shè)計(jì)上下游引物擴(kuò)增目的基因，使用限制酶BamH I和Xho I酶切擴(kuò)增產(chǎn)物和pSmart-I空質(zhì)粒，使用T4連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pSmart-I-gp38。采用Xho I和EcoR I對(duì)重組表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖4所示，酶切產(chǎn)物中包括目的條帶（約2 100 bp）和載體條帶（約5 400 bp）。同時(shí)根據(jù)重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果，表明基因orf38正確插入載體pSmart-I中，重組表達(dá)載體pSmart-I-gp38構(gòu)建成功。

2.4 重組蛋白的表達(dá)和純化

重組表達(dá)載體pSmart-I-gp38轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21后，使用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并探究在不同誘導(dǎo)條件下的表達(dá)效果。從圖5A可知，在80 kDa左右出現(xiàn)預(yù)期目的條帶，目的蛋白為82.89 kDa。另外，37 ℃誘導(dǎo)4 h上清蛋白表達(dá)效果最佳，目的條帶明顯，雜帶淺，因此確定選擇37 ℃誘導(dǎo)4 h，并選擇上清蛋白作為目的蛋白源進(jìn)行純化。重組蛋白純化結(jié)果如圖5B所示，可知在75～100 kDa之間出現(xiàn)目標(biāo)條帶，經(jīng)BCA試劑盒定量測(cè)定其質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。

圖5 gp38蛋白的表達(dá)與純化Fig. 5 SDS-PAGE profiles of expressed and purified gp38 protein

2.5 重組蛋白gp38的活性

將宿主沙門氏菌ATCC13311加入酶標(biāo)板過夜，使其附著在酶標(biāo)板上；脫脂牛奶封阻后加入gp38蛋白進(jìn)行孵育；然后依次加入一抗、二抗和底物進(jìn)行顯色，加入濃硫酸終止反應(yīng)，檢測(cè)重組蛋白的結(jié)合活性。結(jié)果表明（圖6），實(shí)驗(yàn)組（加gp38蛋白）的吸光度為0.94±0.02，極顯著高于陰性對(duì)照（PBS代替gp38蛋白）的吸光度0.17±0.01，表明gp38蛋白具有受體結(jié)合活性。為進(jìn)一步驗(yàn)證gp38蛋白的結(jié)合特異性，分別用大腸桿菌T10、沙門氏菌外膜蛋白、金黃色葡萄球菌6538和PBS代替宿主沙門氏菌ATCC13311作為對(duì)照組，并測(cè)試其他6 株不同血清型的沙門氏菌。如圖7所示，對(duì)照組吸光度分別為0.58±0.03、0.56±0.01、0.59±0.03、0.53±0.005，實(shí)驗(yàn)組（包括宿主在內(nèi)的7 株沙門氏菌組）的吸光度較各對(duì)照組明顯更高，且gp38蛋白與大腸桿菌T10、金黃色葡萄球菌6538和外膜蛋白的結(jié)合較PBS無明顯差異，表明LPST144尾纖維gp38具有特異的受體結(jié)合活性。

圖6 重組蛋白gp38對(duì)宿主菌的結(jié)合活性Fig. 6 Binding activity of recombinant protein gp38 to host cells

圖7 重組蛋白gp38的特異性結(jié)合活性Fig. 7 Specific binding activity of recombinant protein gp38

3 討 論

沙門氏菌噬菌體LPST144是本實(shí)驗(yàn)室前期分離得到的1 株短尾科噬菌體，其吸附時(shí)間短，9 min便達(dá)到最大吸附量77.57%，具有用于沙門氏菌快速檢測(cè)方法開發(fā)的潛力。通過測(cè)序分析，鑒定其與T7噬菌體同屬于Teseptimavirus屬，預(yù)測(cè)了其尾纖維gp38（發(fā)表中），本研究對(duì)其尾纖維進(jìn)行了進(jìn)一步的序列分析和活性鑒定。目前已知晶體結(jié)構(gòu)信息的尾纖維或尾刺數(shù)量非常有限，現(xiàn)已有報(bào)道的RBPs晶體結(jié)構(gòu)有短尾科噬菌體P22的尾刺gp9[30]、T4噬菌體的gp37[31]以及T7噬菌體的尾纖維gp17[27]，通過對(duì)LPST144 gp38進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)LPST144尾纖維gp38與T7噬菌體尾纖維gp17的N端序列具有較好的相似性，C端相似性卻極差。并通過遺傳進(jìn)化、多序列比對(duì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)其滿足RBPs的以下特征：具有模塊化的性質(zhì)，N端保守性強(qiáng)而C端多樣性大；C端富含β折疊結(jié)構(gòu)；序列相似性低。將其C端序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比對(duì)，發(fā)現(xiàn)僅與BP12A的尾纖維具有較好的相似性，而與其他序列同源性不高。BP12A為1 株沙門氏菌噬菌體，GenBank登錄號(hào)為KM366096，經(jīng)基因組比較鑒定，其與噬菌體LPST144是2 個(gè)不同的物種，理論上宿主范圍存在一定差異，而兩者的尾纖維C端僅有兩個(gè)位點(diǎn)（533位和612位）的差異，因此推測(cè)這兩個(gè)位點(diǎn)可能是受體結(jié)合關(guān)鍵氨基酸。由于PDB數(shù)據(jù)庫中缺乏能夠滿足同源建模要求的結(jié)構(gòu)模板，而采用從頭計(jì)算的方法預(yù)測(cè)得到的三維結(jié)構(gòu)未能通過評(píng)估，因此未能得到gp38三維結(jié)構(gòu)，而LPST144的尾纖維與其他噬菌體（除噬菌體BP12A）的尾纖維幾乎沒有相似性，因此未來有必要對(duì)其空間構(gòu)象進(jìn)行解析，為擴(kuò)寬其宿主譜提供指導(dǎo)依據(jù)。

目前報(bào)道的常用于沙門氏菌檢測(cè)的RBPs有短尾科噬菌體P22的尾刺gp9[17]和肌尾科噬菌體S16的尾纖維gp38[32]，本研究對(duì)短尾科噬菌體LPST144的尾纖維進(jìn)行異源表達(dá)，驗(yàn)證了尾纖維gp38的特異性結(jié)合能力。在異源表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，最初使用的表達(dá)質(zhì)粒為pET28b，由于表達(dá)產(chǎn)物溶解性差形成包涵體，于是在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中采用了攜帶His標(biāo)簽和SUMO標(biāo)簽的促融表達(dá)質(zhì)粒pSmart-I。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，增加SUMO標(biāo)簽?zāi)茱@著提高目的蛋白的溶解性。通過考察確定最佳的誘導(dǎo)條件為37 ℃誘導(dǎo)4 h，純化后測(cè)定其蛋白質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。在目的蛋白結(jié)合能力的實(shí)驗(yàn)中，gp38蛋白加入后的吸光度較陰性對(duì)照明顯提高，表明了gp38蛋白對(duì)于宿主菌具有較強(qiáng)的結(jié)合能力。在驗(yàn)證其特異性結(jié)合能力的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)gp38對(duì)于宿主菌以及其他6 株受試的不同血清型沙門氏菌較大腸桿菌T10、沙門氏菌外膜蛋白、金黃色葡萄球菌6538和PBS代替宿主菌對(duì)照組的吸附明顯更強(qiáng)，而包被大腸桿菌T10、沙門氏菌外膜蛋白和金黃色葡萄球菌6538組與PBS代替宿主菌對(duì)照組無顯著性差異，表明了gp38蛋白的結(jié)合特異性，相比于常見的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中對(duì)照組的吸光度偏高，推測(cè)這種現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是由于gp38重組蛋白N端的SUMO標(biāo)簽未切割所造成，產(chǎn)生了一定的非特異性結(jié)合。通常情況下，重組表達(dá)蛋白的活性受到表達(dá)條件（溫度、pH值等）、表達(dá)菌株和表達(dá)過程中重組蛋白是否正確折疊等諸多因素的影響，因此，后期還有待對(duì)這樣因素加以考慮并優(yōu)化條件，針對(duì)這一問題進(jìn)行改進(jìn)。通常RBPs的宿主范圍會(huì)與完整噬菌體顆粒相當(dāng)或者更為廣泛，沙門氏菌血清型眾多，目前已分離鑒定2 600多種，同時(shí)可大規(guī)模測(cè)定gp38結(jié)合的宿主范圍，以明確檢測(cè)的對(duì)象范圍。已知目前報(bào)道的用于沙門氏菌的分子探針P22 gp9和S16 gp38對(duì)部分其他血清型鼠傷寒沙門氏菌作了測(cè)試，而鼠傷寒沙門氏菌ATCC13311均未被測(cè)試，一般來講，由于RBPs的序列差異大，且沙門氏菌血清型眾多（目前已發(fā)現(xiàn)超過2 600 個(gè)沙門氏菌血清型），能夠結(jié)合的宿主范圍差異也會(huì)很大。另一方面，本實(shí)驗(yàn)是一個(gè)初步的功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其目的在于證明gp38具有RBPs特異性結(jié)合活性，具有作為檢測(cè)探針的潛力，后期課題組將進(jìn)一步優(yōu)化gp38重組表達(dá)和活性研究并開發(fā)檢測(cè)方法。一般來說檢測(cè)靈敏度是針對(duì)檢測(cè)體系的建立，因此目前未能進(jìn)行靈敏度的比較。

4 結(jié) 論

迄今為止，沙門氏菌感染仍然是世界范圍內(nèi)主要的公共衛(wèi)生問題，每年沙門氏菌的感染事件給人類健康以及經(jīng)濟(jì)社會(huì)造成重大負(fù)擔(dān)，噬菌體作為細(xì)菌的天敵，能夠特異性吸附并侵染宿主菌，給沙門氏菌的檢測(cè)提供了新的思路。本研究對(duì)短尾科沙門氏菌噬菌體LPST144的尾纖維基因orf38進(jìn)行研究，預(yù)測(cè)了其序列和結(jié)構(gòu)信息，通過異源表達(dá)純化，驗(yàn)證了gp38具有特異性結(jié)合宿主沙門氏菌以及實(shí)驗(yàn)中其他受試沙門氏菌的能力，為開發(fā)基于噬菌體RBPs為分子探針建立沙門氏菌的檢測(cè)方法奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也為理解噬菌體與宿主菌的相互作用提供了依據(jù)。