徽州臭鱖魚微生物多樣性、品質(zhì)特性及其酶解產(chǎn)物抗氧化能力分析

吳永祥，王婷婷，張夢婷，張 瑤，郭孝成，孫漢巨，陳向陽,*

（1.黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山 245041；2.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

臭鱖魚是我國安徽黃山地區(qū)的傳統(tǒng)自然發(fā)酵食品，是以新鮮鱖魚為原料，配以一定量的香辛料，經(jīng)低鹽、低溫、短期腌制發(fā)酵而成，具有悠久的歷史和獨(dú)特的地域風(fēng)味。經(jīng)過發(fā)酵作用，鱖魚體內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪及核酸等分子被降解成氨基酸、多肽、脂肪酸、核苷酸及醛、醇、酮等風(fēng)味物質(zhì)，營養(yǎng)價(jià)值得到提高，風(fēng)味品質(zhì)發(fā)生變化，并賦予了發(fā)酵后鱖魚似臭非臭、鮮香透骨、魚肉酥爛的特點(diǎn)[1-2]。目前，徽州臭鱖魚的加工方法以傳統(tǒng)的自然發(fā)酵為主，即通過魚體自身攜帶的微生物在適宜溫度條件下自然發(fā)酵形成的，臭鱖魚的質(zhì)構(gòu)特性、特征氣味形成與發(fā)酵微生物有關(guān)，但參與發(fā)酵的微生物多樣且群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，使得發(fā)酵過程中的工藝參數(shù)不可控、發(fā)酵后臭鱖魚的質(zhì)量品質(zhì)不穩(wěn)定[3]。因此，分析傳統(tǒng)發(fā)酵臭鱖魚的微生物多樣性對于了解其品質(zhì)質(zhì)量至關(guān)重要。李燕等[4]采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)分析了臭鱖魚發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同樣本臭鱖魚的微生物群落結(jié)構(gòu)存在一定差異。羅靚芷等[5]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法分離純化得到屎腸球菌、彎曲乳桿菌、堅(jiān)強(qiáng)腸球菌、干酪乳桿菌4 株優(yōu)良乳酸菌。楊培周等[6]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法篩選鱖魚主要發(fā)酵微生物，分離鑒定出蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法獲得臭鱖魚的純培養(yǎng)菌株非常有限，存在一定的局限性和片面性。高通量測序技術(shù)通量高、準(zhǔn)確率高，可定性及相對定量解析復(fù)雜微生物群落結(jié)構(gòu)體系，是一種有效、便捷的方法，被廣泛應(yīng)用于豆醬、米酒、酒曲、酸奶、泡菜等發(fā)酵食品中微生物多樣性的研究[7-9]。本研究采用高通量測序技術(shù)對發(fā)酵前后鱖魚中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比分析，解析各類微生物的結(jié)構(gòu)比例，明確優(yōu)勢菌群，并從營養(yǎng)成分、理化性質(zhì)、質(zhì)構(gòu)特性等角度分析發(fā)酵品質(zhì)，為準(zhǔn)確認(rèn)識臭鱖魚的微生物群落結(jié)構(gòu)組成及發(fā)酵品質(zhì)提供數(shù)據(jù)參考。

酶解技術(shù)是食品精深加工的一項(xiàng)綠色加工手段，通過選擇性的可控酶解，促進(jìn)被多種共存雜質(zhì)干擾的多糖、多肽等活性成分的釋放，并可協(xié)同微生物發(fā)酵，應(yīng)用于提高發(fā)酵后產(chǎn)品的品質(zhì)[10-11]。包汭琪等[12]研究了木瓜蛋白酶添加對臭鱖魚揮發(fā)性成分和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)之間的影響，表明木瓜蛋白酶的添加能顯著提高游離氨基酸含量，并促進(jìn)臭鱖魚中風(fēng)味物質(zhì)的形成。王翠等[13]采用中性酶對臭鱖魚肉糜進(jìn)行蛋白質(zhì)水解，并對影響水解反應(yīng)的因素如酶的添加量、酶解溫度、pH值和液固比進(jìn)行研究，確定了最佳工藝條件。然而，目前缺乏不同蛋白酶酶解處理對發(fā)酵后臭鱖魚品質(zhì)影響的深入研究。本研究采用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對發(fā)酵后臭鱖魚進(jìn)行酶解，擬通過微生物發(fā)酵、酶解兩步法提高不同酶解產(chǎn)物的可溶性多肽含量、增強(qiáng)不同酶解產(chǎn)物清除2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基能力及還原能力，以期為徽州臭鱖魚的微生物與酶協(xié)同發(fā)酵及提高臭鱖魚應(yīng)用價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

未發(fā)酵鱖魚和發(fā)酵后徽州臭鱖魚，由安徽徽字一號投資有限公司提供。

DPPH、VC、牛血清白蛋白（bovine serumalbumin，BSA）、ABTS 美國Sigma公司；酸性蛋白酶（100 000 U/g）、堿性蛋白酶（200 000 U/g）滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司；中性蛋白酶（50 000 U/g）河南仰韶生化工程有限公司；木瓜蛋白酶（200 000 U/g）南寧龐博生物工程有限公司；蒽酮、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CR-10plus色差儀 日本柯尼卡美能達(dá)公司；GY-4數(shù)顯式硬度計(jì) 北京金科利達(dá)電子科技有限公司；SpectraMax-190全波長酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；S3400N掃描電子顯微鏡 日本日立公司；DL-CJ-1N型超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；SQ510C型高壓滅菌器 重慶雅馬拓科技有限公司；MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司；LabStart-Aw便攜式水活度測定儀 瑞士Novasina公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵前后鱖魚微生物宏基因組DNA提取及檢測

在無菌超凈工作臺中，分別剪取發(fā)酵前后鱖魚不同部位魚肉組織，各自隨機(jī)混合。稱取20 g魚肉組織，加入50 mL生理鹽水，均質(zhì)5 min。過濾后，取上清液于10 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀重懸浮于1 mL TE buffer，-80 ℃保存?zhèn)溆肹14]。用Omega細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒分別提取發(fā)酵前后鱖魚中細(xì)菌的總DNA，具體操作步驟見說明書。提取后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

1.3.2 PCR擴(kuò)增以及高通量測序

細(xì)菌16S rDNA的V3-V4區(qū)域擴(kuò)增采用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。PCR擴(kuò)增及高通量測序工作委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行。

1.3.3 發(fā)酵前后鱖魚理化性質(zhì)的測定

水分含量的測定：參照GB 5009.3—2016《食品中水分測定》方法；水分活度的測定：采用LabStart-Aw便攜式水分活度測定儀，具體操作步驟見說明書；灰分含量的測定：參照GB 5009.4—2016《食品中灰分測定》方法；粗蛋白含量的測定：參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)測定》方法。

可溶性多肽含量的測定：采用雙縮脲法[15]。繪制BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線，以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，BSA質(zhì)量濃度（X/（mg/mL））為橫坐標(biāo)，得到回歸方程為：Y=0.079 9X+0.088 8（R2=0.996 3）。根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中多肽含量，結(jié)果以每100 g魚肉中含有相當(dāng)BSA質(zhì)量表示，即g/100 g。

可溶性總糖含量的測定：采用蒽酮比色法[16]。繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度（X/（mg/mL））為橫坐標(biāo)，得到回歸方程為：Y=3.233 4X+0.008 2（R2=0.998 5）。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中可溶性總糖含量，結(jié)果以每100 g魚肉中含有相當(dāng)葡萄糖質(zhì)量表示，即mg/100 g。

1.3.4 發(fā)酵前后鱖魚質(zhì)構(gòu)特性的測定

硬度值采用GY-4型數(shù)顯式硬度計(jì)測定，探頭直徑為7.9 mm，分別在發(fā)酵前后鱖魚表面隨機(jī)選取10 個點(diǎn)測量，并記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算其平均值，單位為kg/cm2。

色澤測定利用CR-10 plus型色差儀，在發(fā)酵前后鱖魚表面隨機(jī)選取10 個點(diǎn)測量，并記錄L*、a*、b*值，計(jì)算其平均值。

微觀組織結(jié)構(gòu)觀察利用S3400N型掃描電子顯微鏡，將發(fā)酵前后鱖魚魚肉凍干后，固定在樣品托上，采用離子濺射儀在樣品的橫斷面上噴金，掃描電子顯微鏡（500、2 000 倍）觀察并拍照[17]。

1.3.5 發(fā)酵臭鱖魚蛋白酶解液的制備流程

臭鱖魚肉糜→加入一定量的滅菌水?dāng)嚢杈鶆颉附狻鷾缑福ǚ兴?0 min）→冷卻→離心（3 500 r/min，20 min）→取上清液→多肽含量測定

1.3.6 酶解條件的選擇

選擇酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶作為蛋白質(zhì)水解酶，分別在各種酶最佳溫度、pH值條件下對臭鱖魚行水解。參考文獻(xiàn)[13]，統(tǒng)一為加酶量2 000 U/g、料液比1∶20（g/mL）、酶解時間1.5 h。同時設(shè)立對照組，為未添加酶處理。

1.3.7 酶解產(chǎn)物抗氧化活性的測定

ABTS陽離子自由基清除能力的測定參考文獻(xiàn)[18]；DPPH自由基清除能力的測定參考文獻(xiàn)[19-20]；還原能力的測定參考文獻(xiàn)[21]。酶解產(chǎn)物的抗氧化能力以半數(shù)抑制濃度（IC50）表示，IC50指的是清除率為50%時或OD值達(dá)到0.5時，所需要樣品的有效質(zhì)量濃度，可根據(jù)不同質(zhì)量濃度的清除率作曲線方程求出。同時設(shè)立VC為陽性對照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 鱖魚發(fā)酵前后的細(xì)菌菌群α多樣性分析

表1 發(fā)酵前后鱖魚的細(xì)菌菌群α多樣性分析Table 1 Bacterial α diversity indexes of fermented and fresh mandarin fish

由表1可知，未發(fā)酵鱖魚和發(fā)酵后臭鱖魚細(xì)菌菌群的覆蓋率都達(dá)到99%以上，說明樣本文庫測序結(jié)果能反映樣品真實(shí)情況，可用于樣品細(xì)菌多樣性分析。未發(fā)酵鱖魚細(xì)菌菌群的Chao l指數(shù)平均值為27.13，Shannon指數(shù)平均值為1.36，ACE指數(shù)平均值為29.34；發(fā)酵后臭鱖魚細(xì)菌菌群的Chao l指數(shù)平均值為68.93，Shannon指數(shù)平均值為1.67，ACE指數(shù)平均值為67.89。從Chao l指數(shù)和ACE指數(shù)可以看出，發(fā)酵后臭鱖魚的細(xì)菌菌群豐度高于未發(fā)酵鱖魚細(xì)菌菌群豐度。發(fā)酵后臭鱖魚中細(xì)菌Shannon指數(shù)也明顯高于未發(fā)酵鱖魚，說明發(fā)酵后臭鱖魚中細(xì)菌菌群多樣性高于未發(fā)酵鱖魚。因此，傳統(tǒng)發(fā)酵臭鱖魚中細(xì)菌菌群多樣性更加豐富。

2.2 發(fā)酵前后鱖魚的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析

圖1 門水平上發(fā)酵前后鱖魚的細(xì)菌豐度分析Fig. 1 Relative abundance of bacteria in fermented and fresh mandarin fish at the phylum level

由圖1 可知，在門水平上，發(fā)酵前鱖魚總細(xì)菌群落主要由變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）組成，相對豐富分別為74.55%、25.45%。發(fā)酵后臭鱖魚的總細(xì)菌群落組成仍以變形菌門和厚壁菌門為主，占據(jù)菌群總量的90.34%，余下9.37%為Epsilonbacteraeota、梭桿菌門（Fusobacteria）。由此說明，徽州臭鱖魚是通過魚體自身攜帶的微生物在適宜溫度條件下自然發(fā)酵形成的，變形菌門和厚壁菌門是臭鱖魚發(fā)酵的主要優(yōu)勢細(xì)菌。

由圖2 可知，在屬水平上，發(fā)酵前后鱖魚的微生物多樣性與豐度有明顯差異。發(fā)酵前鱖魚共分離得到8 個屬，相對豐富大于1%的菌群為假單胞菌屬（Pseudomonas）、肉桿菌屬（Carnobacterium）、沙雷氏菌屬（Serratia）、漫游球菌屬（Vagococcus）、環(huán)絲菌屬（Brochothrix）、乳桿菌屬（Lactobacillus）及冷桿菌屬（Psychrobacter）。發(fā)酵前鱖魚中假單胞菌屬和肉桿菌屬的優(yōu)勢較為明顯，分別為總水平的69.30%和17.33%。發(fā)酵后臭鱖魚共分離得到14 個屬，與發(fā)酵前鱖魚相比，發(fā)酵后臭鱖魚的總細(xì)菌群落組成發(fā)生變化，主要由冷桿菌屬、漫游球菌屬、弓形桿菌屬（Arcobacter）及Psychrilyobacter組成，相對豐度分別為59.96%、26.97%、7.21%及1.23%。冷桿菌屬微生物在臭鱖魚發(fā)酵中占有優(yōu)勢，對臭鱖魚發(fā)酵起重要作用。已有報(bào)道表明，冷桿菌屬是低溫發(fā)酵食品的主要優(yōu)勢菌群，在冷鮮肉、海產(chǎn)品及牛奶中都十分常見[14,22]。同時，本研究從發(fā)酵后臭鱖魚中檢測出乳桿菌屬，與羅靚芷[5]和Dai Zhiyuan[23]等傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的研究結(jié)果一致。乳酸菌能賦予發(fā)酵臭鱖魚柔和的酸味，改善產(chǎn)品風(fēng)味，促進(jìn)發(fā)酵成熟。

圖2 發(fā)酵前后鱖魚的屬水平上細(xì)菌豐度分析Fig. 2 Relative abundance of bacteria in fermented and fresh mandarin fish at the genus level

2.3 發(fā)酵前后鱖魚的理化性質(zhì)分析

表2 發(fā)酵前后鱖魚理化性質(zhì)的比較Table 2 Comparison of physicochemical properties of fermented and fresh mandarin fish

由表2可知，相比于未發(fā)酵組，發(fā)酵后臭鱖魚的pH值及水分含量、水分活度、粗蛋白含量略降低。臭鱖魚的水分含量及水分活度下降，可能與發(fā)酵前期臭鱖魚加入食鹽腌制中，魚肉脫水致使含水量降低以及與發(fā)酵后期pH值的下降引發(fā)了蛋白質(zhì)變性，使其魚肉持水能力降低等有關(guān)。發(fā)酵后臭鱖魚的灰分、可溶性多肽、可溶性總糖含量較發(fā)酵前均明顯提高，分別增加了95.10%、50.00%、209.20%。臭鱖魚灰分含量的增加，與發(fā)酵過程中加入食鹽腌制有關(guān)。

2.4 發(fā)酵前后鱖魚的理化指標(biāo)與細(xì)菌相關(guān)性分析

目前已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了發(fā)酵食品微生物群落與其理化指標(biāo)具有一定的相關(guān)性：如姜靜[24]研究表明自然發(fā)酵豆醬的pH值與乳桿菌、假單胞菌、環(huán)絲菌等呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)，蛋白質(zhì)和脂肪含量與乳桿菌、明串珠菌和環(huán)絲菌呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)；Broekaert等[25]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌Psychrilyobacterspp.、Pseudoalteromonasspp.是褐蝦在保藏過程中揮發(fā)性成分（硫化物、酮類、氨類、醇類等成分）產(chǎn)生的主要優(yōu)勢菌群；孫瑛等[26]研究表明海水魚腌制過程細(xì)菌群落多樣性和N-亞硝胺變化呈現(xiàn)一定相關(guān)性，嗜冷桿菌屬為優(yōu)勢菌群。本研究對發(fā)酵前后鱖魚的理化指標(biāo)與細(xì)菌變化進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表3所示。漫游球菌屬與pH值、粗蛋白含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），假單胞菌屬、肉桿菌屬、沙雷氏菌屬和乳桿菌屬與pH值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。漫游球菌屬與可溶性多肽、可溶性總糖含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)性系數(shù)（r）分別為0.999和0.999，表明在發(fā)酵過程中漫游球菌屬能合成蛋白酶、碳水化合物活性酶等，促進(jìn)了蛋白質(zhì)、碳水化合物的分解，致使發(fā)酵后粗蛋白含量下降，而可溶性多肽、可溶性總糖含量顯著上升[27]。結(jié)果揭示了發(fā)酵前后鱖魚的理化指標(biāo)與細(xì)菌群落呈現(xiàn)顯著相關(guān)性，而細(xì)菌群落代謝的復(fù)雜酶體系可能是引起發(fā)酵前后鱖魚理化性質(zhì)發(fā)生變化的主要原因。

表3 理化指標(biāo)與細(xì)菌相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between physicochemical indexes and bacterial genera in stinky mandarin fish

2.5 發(fā)酵前后鱖魚的質(zhì)構(gòu)特性分析

表4 發(fā)酵前后鱖魚硬度、色澤的比較Table 4 Comparison of hardness and color parameters of fermented and fresh mandarin fish

由表4可知，未發(fā)酵鱖魚的硬度值為（2.10±0.10）kg/cm2，發(fā)酵后臭鱖魚的硬度值增加到（3.95±0.09）kg/cm2，提高了0.88 倍。L*值表示發(fā)酵前后鱖魚魚肉的明暗度，L*值越大表明顏色越白。與未發(fā)酵鱖魚相比，發(fā)酵后臭鱖魚的L*值減少，魚肉呈現(xiàn)灰白色；發(fā)酵前后鱖魚的b*值亦存在差異，發(fā)酵后臭鱖魚的b*值顯著增加，魚肉顏色呈現(xiàn)淡黃色[28]。如圖3所示，與未發(fā)酵鱖魚相比，發(fā)酵后臭鱖魚的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生了顯著改變，外表面干燥，脫水嚴(yán)重，組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)嚴(yán)重皺縮，卷曲現(xiàn)象更明顯，魚肉間形成了較為清晰的紋路。發(fā)酵前后鱖魚微觀結(jié)構(gòu)掃描電鏡觀察結(jié)果與前期研究的水分含量、水分活度及硬度具有一定的吻合度[29]，從微觀結(jié)構(gòu)上對發(fā)酵前后鱖魚質(zhì)構(gòu)特性差異進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證。

圖3 發(fā)酵前后鱖魚微觀組織結(jié)構(gòu)的比較Fig. 3 Comparison of microstructure of fermented and fresh mandarin fish

2.6 臭鱖魚不同蛋白酶酶解產(chǎn)物的可溶性多肽含量分析

選用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶及木瓜蛋白酶分別在最適條件下對臭鱖魚肉糜進(jìn)行酶解，以可溶性多肽含量為評價(jià)指標(biāo)，結(jié)果如表5所示。不同蛋白酶酶解液中可溶性多肽含量差異顯著（P＜0.05），其中堿性蛋白酶的酶解程度最高，可溶性多肽含量可達(dá)（4.97±0.18）g/100 g；未處理組中可溶性多肽含量最低，為（1.32±0.13）g/100 g，顯著低于其他4 種蛋白酶處理組（P＜0.05）。4 種蛋白酶酶解能力從大到小依次為堿性蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶=酸性蛋白酶。包汭琪[12]和王翠[13]等研究表明，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶能有效促進(jìn)臭鱖魚中蛋白質(zhì)水解，游離氨基酸含量顯著提升。

表5 臭鱖魚的不同蛋白酶酶解產(chǎn)物可溶性多肽含量的比較Table 5 Comparison of soluble polypeptide contents in different protease hydrolysates of stinky mandarin fish

2.7 臭鱖魚不同蛋白酶酶解產(chǎn)物對ABTS陽離子自由基清除作用

表6 臭鱖魚酶解產(chǎn)物對ABTS陽離子自由基的清除作用Table 6 ABTS cation radical- scavenging ability of enzymatic hydrolysates of stinky mandarin fish

由表6可知，臭鱖魚4 種蛋白酶酶解產(chǎn)物對ABTS陽離子自由基清除作用均表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系，即隨著酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度的增加，ABTS陽離子自由基清除能力隨之增強(qiáng)。酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶及木瓜蛋白酶的酶解產(chǎn)物清除ABTS陽離子自由基能力較未處理組均顯著提高（P＜0.05），對ABTS陽離子自由基清除作用的IC50值分別為（0.11±0.004）、（0.18±0.01）、（0.49±0.02）、（0.39±0.01）mg/mL，而未處理組的IC50值為（1.66±0.01）mg/mL。臭鱖魚酶解產(chǎn)物ABTS陽離子自由基清除能力的顯著提高，可能與不同蛋白酶酶解產(chǎn)物中可溶性多肽含量的增加有關(guān)。有大量研究顯示，多肽類物質(zhì)能顯著清除ABTS陽離子自由基，具有良好的抗氧化作用[30-32]。

2.8 臭鱖魚不同蛋白酶酶解產(chǎn)物對DPPH自由基清除作用

表7 臭鱖魚酶解產(chǎn)物對DPPH自由基的清除作用Table 7 DPPH radical scavenging ability of enzymatic hydrolysates of stinky mandarin fish

由表7可知，臭鱖魚的4 種蛋白酶酶解產(chǎn)物均呈現(xiàn)出顯著的DPPH自由基清除作用，并呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。DPPH自由基清除能力從大到小依次為VC＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞堿性蛋白酶＞酸性蛋白酶＞未處理組，其DPPH自由基清除作用的IC50值分別為（0.04±0.002）、（1.15±0.04）、（2.29±0.08）、（2.41±0.02）、（3.05±0.06）、（3.46±0.10）mg/mL，說明4 種蛋白酶對臭鱖魚魚肉進(jìn)行蛋白質(zhì)酶解，可以顯著提高其DPPH自由基清除作用（P＜0.05）。

2.9 臭鱖魚不同蛋白酶酶解產(chǎn)物對還原能力的影響

由表8可知，臭鱖魚不同蛋白酶酶解產(chǎn)物均具有較好的還原能力，隨著酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度的增加，還原能力增強(qiáng)。與未發(fā)酵組相比，臭鱖魚的4 種蛋白酶酶解產(chǎn)物的還原能力顯著提高（P＜0.05）。結(jié)果表明，4 種蛋白酶酶解產(chǎn)物還原能力的變化規(guī)律與對ABTS陽離子自由基清除能力一致，說明臭鱖魚中可溶性多肽可能是其發(fā)揮抗氧化作用的主要活性物質(zhì)。

表8 臭鱖魚酶解產(chǎn)物的還原能力Table 8 Reducing powers of enzymatic hydrolysates of stinky mandarin fish

3 結(jié) 論

本研究采用高通量測序技術(shù)分析發(fā)酵前后鱖魚中菌群組成及變化情況，解析各類微生物的結(jié)構(gòu)比例，明確優(yōu)勢菌群。結(jié)果表明，發(fā)酵前鱖魚的主要優(yōu)勢菌為假單胞菌屬、肉桿菌屬、沙雷氏菌屬、漫游球菌屬及冷桿菌屬；而發(fā)酵后臭鱖魚的總細(xì)菌群落組成發(fā)生變化，主要由冷桿菌屬、漫游球菌屬、弓形桿菌屬及Psychrilyobacter組成。由于氧氣含量、溫度、鹽濃度、競爭等因素，發(fā)酵后臭鱖魚的優(yōu)勢菌數(shù)量逐步增加變得顯著，說明優(yōu)勢菌與臭鱖魚的發(fā)酵品質(zhì)有密切關(guān)系[22]，其中冷桿菌屬、漫游球菌屬、乳桿菌屬等為主要優(yōu)勢菌，在臭鱖魚發(fā)酵過程中起重要作用。發(fā)酵后臭鱖魚的營養(yǎng)成分、理化性質(zhì)及質(zhì)構(gòu)特性等發(fā)酵品質(zhì)發(fā)生了顯著變化，其中灰分、可溶性多肽、可溶性總糖、硬度較發(fā)酵前均顯著增加，而水分、水分活度、粗蛋白明顯減少；發(fā)酵后臭鱖魚魚肉呈現(xiàn)灰白色，魚肉組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)嚴(yán)重皺縮，卷曲現(xiàn)象更明顯，魚肉間形成了較為清晰的紋路。相關(guān)性分析表明，菌群的種類和豐度對發(fā)酵后臭鱖魚理化指標(biāo)的影響較大，從而影響產(chǎn)品品質(zhì)，其中對發(fā)酵后臭鱖魚理化指標(biāo)影響較大的細(xì)菌為漫游球菌屬。

采用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對發(fā)酵后臭鱖魚肉糜進(jìn)行蛋白質(zhì)酶解，并評價(jià)4 種不同酶解產(chǎn)物的抗氧化能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，臭鱖魚4 種蛋白酶酶解產(chǎn)物清除ABTS陽離子自由基、DPPH自由基能力及還原能力較未處理組顯著提高，這可能與不同蛋白酶酶解產(chǎn)物中可溶性多肽含量的增加有關(guān)。本研究闡明了發(fā)酵前后鱖魚微生物群落組成和品質(zhì)特性的差異及相關(guān)性，揭示了發(fā)酵后臭鱖魚蛋白酶解產(chǎn)物具有良好的抗氧化活性，研究結(jié)果為準(zhǔn)確認(rèn)識徽州臭鱖魚的微生物群落結(jié)構(gòu)組成及發(fā)酵品質(zhì)提供數(shù)據(jù)參考，為臭鱖魚的微生物與酶協(xié)同發(fā)酵及提高臭鱖魚應(yīng)用價(jià)值提供了可能性。