成熟度對(duì)諾麗果酵素品質(zhì)的影響

趙文珂，肖春琴，張 賢，崔 春,*

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.海南赤酵生物科技有限公司，海南 ?？?570100）

諾麗果是海巴戟天的果實(shí)，屬呼吸躍變型水果[1]。果實(shí)呈手榴彈狀，表面上有凹凸不平的麻點(diǎn)，成熟過程顏色從青色變成黃色直至接近白色，果肉豐富多汁，較為苦澀。成熟的諾麗果實(shí)具有一種獨(dú)特的強(qiáng)烈腐臭味道[2]，果肉呈凝膠狀。諾麗果含有至少200 種植物化學(xué)物質(zhì)和100 種揮發(fā)性化合物[3]，具有多種生理活性，營養(yǎng)價(jià)值極高[4]。研究證實(shí)諾麗果具有抗氧化[5-6]、防癌抗腫瘤[7-9]、消炎抑菌[10]、降血糖和保護(hù)肝臟[11]、抗胃潰瘍和食道炎[12]、調(diào)節(jié)五羥色胺和多巴胺[13]、抑制血管增生[14]、抑制脂蛋白酶[15]等多種生理功能。

目前市面上很多和諾麗果有關(guān)的產(chǎn)品都是沿用就地發(fā)酵這種傳統(tǒng)處理方法，即將成熟的諾麗果置于室溫下進(jìn)行密閉發(fā)酵，利用諾麗果果實(shí)內(nèi)原生菌進(jìn)行發(fā)酵而得到酵素。諾麗果果內(nèi)菌主要包含細(xì)菌、酵母菌和霉菌，其中細(xì)菌占比最高，霉菌數(shù)量最少[16]。諾麗果經(jīng)過發(fā)酵后得到的諾麗果酵素含有豐富的VC、VB1、VB2、VB3和VB12等[17]，而且發(fā)酵后的酵素能有效增加有益微生物體（酶、酵母和菌類等）的數(shù)量和質(zhì)量，從而增強(qiáng)有效成份的生物活性。因此，發(fā)酵后的諾麗果酵素比不發(fā)酵的諾麗果功效更強(qiáng)[18]。

對(duì)諾麗果發(fā)酵的研究均是以成熟的黃色諾麗果或者乳白色諾麗果為原料，鮮見成熟度對(duì)諾麗果酵素品質(zhì)影響的相關(guān)研究。諾麗果成熟過程中品質(zhì)和生理活性均發(fā)生較明顯變化[19]，因此，本研究探究諾麗果成熟度對(duì)發(fā)酵諾麗果酵素品質(zhì)的影響，以期為高品質(zhì)諾麗果生產(chǎn)提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

未成熟的諾麗鮮果（即青色諾麗果）以及成熟的諾麗鮮果（即黃色諾麗果）從海南當(dāng)?shù)噩F(xiàn)采摘寄送至實(shí)驗(yàn)室。

酪氨酸酶（500 IU/mg）、左旋多巴 上海麥克林生化科技有限公司；沒食子酸、福林-酚、異辛烷、醋酸銅（均為分析純）、胰脂肪酶（15～35 IU/mg）上海阿拉丁試劑公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（均為生化試劑） 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204E分析天平 梅特勒-托力多儀器（上海）有限公司；SPECTRA MAX 190酶標(biāo)儀 Molecular Devices公司；GL21M高速冷凍離心機(jī) 長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；0～80手持式折光儀 禹城市田園信科光學(xué)儀器有限公司；UV765紫外-可見分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；ZXJP-A1430霉菌培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；FJ200-SH數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)本模型廠。

1.3 方法

1.3.1 諾麗果酵素的制備

取新鮮的諾麗果用蒸餾水洗凈表面，瀝干后切成小塊，置于密封發(fā)酵罐中，于室溫條件下避光自然發(fā)酵，定期從發(fā)酵罐中取諾麗果浸出酵素并保存在-4 ℃冰箱，以備檢測(cè)使用。

1.3.2 諾麗果發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的測(cè)定

pH值和總酸檢測(cè)參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[20]；可溶性固形物測(cè)定參照GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》[21]；還原糖測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸法[22]；總糖測(cè)定采用蒽酮-硫酸法[23]；總多酚測(cè)定采用福林-酚法[24]；氨基酸態(tài)氮測(cè)定采用甲醛滴定法[25]。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力的測(cè)定改良自鄰苯三酚自氧化法[26]。具體步驟如下：取4.5 mL TE緩沖液和10 μL鄰苯三酚溶液混合均勻，立即在波長325 nm處測(cè)定吸光度，記為A自0，在2 min之內(nèi)，每隔30 s記錄一次，共記錄4 個(gè)值分別為A自1、A自2、A自3、A自4，最后計(jì)算A自值。取4.5 mL TE緩沖液和10 μL諾麗果酵素，振蕩均勻后加入10 μL鄰苯三酚溶液，混勻后快速在325 nm波長處測(cè)定吸光度，記為A抗0，在2 min內(nèi)每間隔30 s測(cè)定一次，分別記為A抗1、A抗2、A抗3、A抗4，并計(jì)算出最終的A抗值。SOD活力計(jì)算如式（1）所示：

1.3.3 諾麗果發(fā)酵過程中菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌的測(cè)定

菌落總數(shù)測(cè)定參考GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[27]；霉菌和酵母菌測(cè)定參考GB 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》[28]。

1.3.4 諾麗果發(fā)酵過程中酪氨酸酶抑制率和胰脂肪酶抑制率的測(cè)定

酪氨酸酶抑制率測(cè)定采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法[29]。反應(yīng)混合物2 mL（0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液1.8 mL（pH 6.8）+諾麗果酵素0.1 mL+蘑菇酪氨酸酶0.1 mL（40 U）），37 ℃孵育10 min，加入0.15%左旋多巴反應(yīng)液1 mL，2 min后立即于波長475 nm處測(cè)定吸光度。酪氨酸酶抑制率計(jì)算如式（2）所示：

式中：A為未加諾麗果酵素的加酶混合液的吸光度；B為未加諾麗果酵素也未加酶的混合液的吸光度；C為加諾麗果酵素和酶混合液的吸光度；D為加諾麗果酵素而未加酶的混合液吸光度。

胰脂肪酶抑制率測(cè)定參考周麗麗[30]的方法。在25 mL比色管中加入2 mL乳化液以及2.5 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5），40 ℃預(yù)熱5 min，再加入1 mL樣品以及0.5 mL 3 mg/mL的胰脂肪酶溶液，40 ℃水浴反應(yīng)20 min，加入6 mL無水乙醇以及1 mL 6 mol/L HCl溶液使反應(yīng)停止，再加入3 mL異辛烷在60 ℃水浴中靜置分層10 min，冷卻后取上層液體1 mL于離心管中，再加入4 mL異辛烷以及1 mL醋酸銅顯色劑，振蕩后靜置，取上層清液在714 nm波長處測(cè)定吸光度。將樣品替換成蒸餾水作為空白對(duì)照組，其余實(shí)驗(yàn)操作步驟不變。胰脂肪酶抑制率如式（3）所示：

式中：A空為空白對(duì)照組的吸光度；A樣為實(shí)驗(yàn)組的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，使用SPSS 16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)以表示，并使用Origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 諾麗果發(fā)酵過程中酪氨酸酶抑制率、胰脂肪酶抑制率的變化

表1 成熟度對(duì)諾麗果發(fā)酵過程中酪氨酸抑制率的影響Table 1 Effect of maturity on tyrosinase inhibition rate during fermentation of noni fruit%

酪氨酸酶是人體內(nèi)存在的一種具有雙重催化功能的重要生物酶，對(duì)人體的黑色素形成具有關(guān)鍵作用[31]，因此，酪氨酸酶抑制活性可表征諾麗果酵素的美白活力。由表1可得，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，青果和黃果酵素的酪氨酸酶抑制率均呈上升趨勢(shì)。青果酵素經(jīng)過8 周發(fā)酵后，酪氨酸酶抑制率可達(dá)到89.62%，遠(yuǎn)高于黃果酵素的58.65%。這表明諾麗果青果酵素具有更好的美白效果。

表2 成熟度對(duì)諾麗果發(fā)酵過程中胰脂肪酶抑制率的影響Table 2 Effect of maturity on the inhibition rate of pancreatic lipase during fermentation of noni fruit%

食物中的脂肪被胰脂肪酶水解為單酰甘油和游離脂肪酸后在腸道被吸收，然后在體內(nèi)重新合成脂肪，是導(dǎo)致肥胖等諸多疾病的重要原因之一[32]。脂肪酶抑制活性可有效抑制脂肪的水解和吸收，有控制體重的作用。由表2可知，由未成熟青色諾麗果發(fā)酵得到的酵素在整個(gè)發(fā)酵過程中均具有較高的胰脂肪酶抑制作用，發(fā)酵第1、4、8周的胰脂肪酶抑制率均在85%以上；而黃果在發(fā)酵第1周沒有胰脂肪酶抑制效果，但是隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，其胰脂肪酶抑制率不斷提高，發(fā)酵至第8周其胰脂肪酶抑制率高達(dá)84.5%，與青果酵素相當(dāng)。這表明青果酵素在整個(gè)發(fā)酵過程中均具有潛在的預(yù)防肥胖的功效，而黃果酵素在發(fā)酵后期具有良好的防止肥胖的效果。

2.2 諾麗果發(fā)酵過程中總多酚、SOD活力、還原糖和總糖的變化規(guī)律

圖1 成熟度對(duì)諾麗果發(fā)酵過程中總多酚（A）和SOD活力（B）的影響規(guī)律Fig. 1 Effect of maturity on total polyphenol content (A) and SOD activity (B) during fermentation of noni fruit

如圖1A所示，青果和黃果發(fā)酵過程中總多酚含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（P＜0.05），黃果發(fā)酵過程中的總多酚含量高于青果酵素（P＜0.05）。由圖1B可知，SOD活力隨著發(fā)酵時(shí)間的延長也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在發(fā)酵后期酵素基本上檢測(cè)不到SOD活力。青果和黃果SOD活力的下降無明顯差異。通過總多酚以及SOD活力的變化趨勢(shì)推測(cè)，長時(shí)間的發(fā)酵使得諾麗果酵素抗氧化能力下降。

如圖2所示，黃果酵素的總糖與還原糖含量在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)浮動(dòng)趨勢(shì)。總糖質(zhì)量濃度在26～40 mg/mL范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長有顯著差異。郝玉潔等[33]在諾麗果控溫37 ℃發(fā)酵過程中測(cè)得100 d內(nèi)總糖質(zhì)量濃度在45～50 mg/mL范圍波動(dòng)，本研究結(jié)果與其相符。而青果酵素的總糖和還原糖含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而逐漸減少（P＜0.05），與下述可溶性固形物的變化趨勢(shì)對(duì)應(yīng)?？偺呛瓦€原糖含量的變化趨勢(shì)與發(fā)酵過程中纖維素、果膠等大分子碳水化合物被酶和微生物等分解產(chǎn)生低分子糖類，以及微生物生長消耗糖類物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化有關(guān)，青果酵素的糖量變化與黃果酵素趨勢(shì)不同，推測(cè)原因是青果發(fā)酵過程中微生物數(shù)量遠(yuǎn)超黃果酵素，所以消耗糖量的速度極快。

圖2 成熟度對(duì)諾麗果發(fā)酵過程中總糖（A）和還原糖（B）的影響Fig. 2 Effect of maturity on total sugar (A) and reducing sugar (B)contents during noni fruit fermentation

2.3 諾麗果發(fā)酵過程中菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌的變化

圖3 成熟度對(duì)諾麗果發(fā)酵過程中菌落總數(shù)（A）和霉菌（B）、酵母菌（C）的影響規(guī)律Fig. 3 Effect of maturity on total number of colonies (A), mold count (B)and yeast count (C) during fermentation of noni fruit

由圖3可知，諾麗果在發(fā)酵初期的菌落總數(shù)高于發(fā)酵后期，則諾麗果進(jìn)行發(fā)酵后的菌落總數(shù)減少，說明諾麗果發(fā)酵過程中在一定程度上抑制了微生物的生長，起到了抑菌的作用。其中，在發(fā)酵至第3～4周諾麗果酵素的菌落總數(shù)呈現(xiàn)出低峰狀態(tài)，微生物數(shù)量的減少推測(cè)原因可能是由諾麗果酵素的化學(xué)變化引起，原因有二：一是底物特征發(fā)生改變；二是諾麗果本身的抑菌性開始起作用，此時(shí)的抑菌效果最好。青果酵素的菌落總數(shù)遠(yuǎn)超過黃果酵素（P＜0.05），數(shù)量級(jí)上的差距說明利用未成熟諾麗果進(jìn)行發(fā)酵所得酵素對(duì)微生物的抑制作用不明顯，其抑菌效果遠(yuǎn)低于利用完全成熟諾麗果酵素。青果與黃果的含糖量表現(xiàn)出明顯不同，推測(cè)可能因?yàn)榍喙木淇倲?shù)遠(yuǎn)高于黃果，導(dǎo)致青果酵素的總糖含量和還原糖含量低于黃果酵素，且呈急速下降趨勢(shì)。

諾麗果酵素的霉菌在發(fā)酵過程中的總體變化趨勢(shì)與菌落總數(shù)一致，從第2周開始，霉菌數(shù)量下降，后續(xù)發(fā)酵過程霉菌數(shù)量略有增加（P＞0.05）。黃果酵素的酵母菌僅在第3周發(fā)酵液中檢測(cè)到，其余發(fā)酵時(shí)間未檢測(cè)到。青果酵素的霉菌和酵母菌數(shù)顯著高于黃果酵素，這與菌落總數(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。說明利用成熟諾麗果進(jìn)行發(fā)酵所得的酵素抑制霉菌和酵母菌的能力遠(yuǎn)大于未成熟諾麗果酵素，Dittmar[34]于1993年得出諾麗果的成熟程度與加工方式影響其抗菌性，其成熟諾麗果的抗菌性優(yōu)于未成熟諾麗果，本實(shí)驗(yàn)佐證其觀點(diǎn)，推測(cè)諾麗果在成熟過程中合成了某種具有抑菌性的物質(zhì)，并且在發(fā)酵過程中能夠保留下來。

2.4 諾麗果發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的變化

圖4 成熟度對(duì)諾麗果發(fā)酵過程中pH值（A）和總酸（B）的影響Fig. 4 Effect of maturity on pH (A) and total acid content (B) during fermentation of noni fruit

工業(yè)和信息化部于2018年12月21日頒布了酵素行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 5323—2018《植物酵素》[35]，酵素品質(zhì)有了規(guī)范可循。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定食用植物酵素的pH≤4.5、總酸≥0.8 g/100 g。如圖4A所示，青果和黃果酵素的pH值隨著發(fā)酵時(shí)間的延長呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（P＞0.05），在發(fā)酵過程中青果酵素的pH值高于黃果酵素（P＜0.05），且pH值符合QB/T 5323—2018的要求，同時(shí)與郝玉潔等[33]在研究諾麗果在37 ℃控溫發(fā)酵過程中pH值從3.9緩慢下降至3.6結(jié)果相符。如圖4B所示，青果酵素和黃果酵素的初始總酸含量水平相當(dāng)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，總酸含量均有所增加（P＞0.05），但增長幅度不同。黃果酵素總酸含量經(jīng)過發(fā)酵有微量增加，從0.86 g/100 g緩慢上升至0.93 g/100 g，青果酵素總酸含量的增長速度遠(yuǎn)高于黃果酵素，并無顯著性差異，相比于發(fā)酵初期總酸含量增加了1 倍。同時(shí)兩種酵素在發(fā)酵過程中的總酸符合其技術(shù)規(guī)范。其中青果酵素的pH值不斷下降，總酸不斷上升，推測(cè)主要是由于青果酵素中酵母菌含量較高，酵母菌代謝生成的有機(jī)酸、二氧化碳等物質(zhì)積累而成。

圖5 成熟度對(duì)諾麗果發(fā)酵過程中可溶性固形物（A）和氨基酸態(tài)氮（B）的影響規(guī)律Fig. 5 Effect of maturity on soluble solids (A) and amino nitrogen (B)contents during fermentation of noni fruit

如圖5A所示，青果在發(fā)酵過程中的可溶性固形物不斷減少，從6.3 °Brix下降至4.2 °Brix（P＞0.05），而黃果酵素的可溶性固形物則是呈波動(dòng)性變化（P＞0.05），穩(wěn)定在6.0～7.0 °Brix范圍內(nèi)，原因可能是由于青色諾麗果硬度較大，結(jié)構(gòu)致密。如圖5B所示，諾麗果在發(fā)酵初期氨基酸態(tài)氮含量下降幅度較大，在后續(xù)發(fā)酵過程中含量基本保持穩(wěn)定（P＜0.05），推測(cè)可能是由于隨著發(fā)酵的進(jìn)行，氨基酸被菌體利用，導(dǎo)致其氨基酸態(tài)氮含量不斷下降，發(fā)酵后期由于菌體生長緩慢，氨基酸消耗逐漸變小。

3 結(jié) 論

本研究利用未成熟的青色諾麗果和成熟的黃色諾麗果進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果表明，黃果酵素的抑菌性優(yōu)于青果，青果第8周發(fā)酵液的酪氨酸酶抑制率和胰脂肪酶抑制率均較高，具有潛在的美白功效和減肥功效。通過總多酚和SOD活力的測(cè)定可以得出縮短發(fā)酵時(shí)間有利于保留更好的抗氧化性。青果和黃果酵素的pH值和總酸均符合植物酵素標(biāo)準(zhǔn)，其中青果酵素的pH值高于黃果酵素，可溶性固形物含量低于黃果酵素。