基于UPLC-QTOF-MS 技術(shù)的壓榨和浸出油茶籽油甘油酯組成比較分析

胡 謙，張九凱*，韓建勛，邢冉冉，劉 晗，陳 穎

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048）

油茶籽油，又名山茶油、茶樹油、茶油，是山茶屬（CamelliaL.）油茶樹種子經(jīng)加工制得，與橄欖油、椰子油、棕櫚油并列為世界四大木本植物油，在我國(guó)已有2 000多年的歷史。油茶籽油中脂肪酸的組成和比例，以及物理化學(xué)性質(zhì)，與橄欖油接近，被譽(yù)為“東方橄欖油”[1]。油茶籽油富含單不飽和脂肪酸、茶多酚、角鯊烯和維生素，具有預(yù)防心腦血管疾病、抗腫瘤和抗氧化等功效[2-4]。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對(duì)生活質(zhì)量要求的提高，油茶籽油作為我國(guó)能與進(jìn)口橄欖油相媲美的木本食用油，其產(chǎn)量與銷量逐步上升。

油茶籽油的生產(chǎn)工藝主要有壓榨法和浸出法。壓榨法是利用物理壓力從山茶籽中將油脂榨取出來，出油率相比于浸出法要低。浸出法是采用食品級(jí)溶劑從壓榨后的山茶籽中浸出殘留的油脂，以提高出油率。市場(chǎng)上壓榨油茶籽油的價(jià)格和品質(zhì)都比浸出油茶籽油高[5-6]。由于國(guó)內(nèi)油茶籽油市場(chǎng)的消費(fèi)量日漸遞增以及原料產(chǎn)量的限制等原因，導(dǎo)致了將浸出油茶籽油冒充壓榨油茶籽油出售以賺取巨額利潤(rùn)的違法現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。GB 11765—2018《油茶籽油》中規(guī)定在外包裝上應(yīng)標(biāo)識(shí)油茶籽油的加工工藝，但目前還沒有有效的手段鑒別壓榨油茶籽油和浸出油茶籽油。因此為了防止浸出油茶籽油冒充壓榨油茶籽油，保證消費(fèi)者利益，為行政執(zhí)法提供依據(jù)，維護(hù)油茶籽油產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，開展研究浸出油茶籽油和壓榨油茶籽油的鑒別方法具有重要意義。

近年來，已經(jīng)有使用紅外光譜[7]、可見-近紅外光譜[8-9]、可見-紫外光譜[10]、核磁共振[11]等技術(shù)用于鑒別壓榨和浸出植物油。這些方法具有快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，但是難以從分子水平分析代謝物組成。植物油的主要成分是甘油三酯，占比達(dá)95%～98%[12-13]。脂質(zhì)組學(xué)是代謝組學(xué)最主要的分支之一，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品脂質(zhì)成分分析[14-15]、品質(zhì)判別[16-17]、真?zhèn)舞b別[18-19]和產(chǎn)地溯源[20-21]等方面。Jergovi?等[22]采用基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)分析甘油三酯，可快速鑒別初榨橄欖油、精制橄欖油和葵花籽油摻假特級(jí)初榨橄欖油。Da Silveira等[13]基于質(zhì)譜技術(shù)篩選大豆油的特征脂質(zhì)，可鑒別低至1%的大豆油摻假的特級(jí)初榨橄欖油，此外Fasciotti等[23]使用液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）建?？设b別大豆油摻假特級(jí)初榨橄欖油。但目前還沒有基于液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)的脂質(zhì)組學(xué)方法用于比較壓榨油茶籽油和浸出油茶籽油的甘油酯組成。因此，本研究基于超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間-質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）技術(shù)的脂質(zhì)組學(xué)，比較浸出油茶籽油和壓榨油茶籽油的甘油酯組成。結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，以甘油酯分子組成為變量參數(shù)，建立判別模型以區(qū)分壓榨和浸出油茶籽油。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8 種浸出油茶籽油和9 種壓榨油茶籽油均由江西省贛州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所提供，避光貯藏于室溫。異丙醇、乙腈、甲醇（均為質(zhì)譜級(jí)） 美國(guó)Honeywell公司；乙酸銨（質(zhì)譜級(jí)） 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Kinetex C18柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm，100 ?）美國(guó)Phenomenex公司；TripleTOF 6600質(zhì)譜儀（配備有2 個(gè)ExionLC AD泵、ExionLC AD自動(dòng)進(jìn)樣器和ExionLC AC柱溫箱的ExionLC AD系統(tǒng)） 美國(guó)AB Sciex公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

每個(gè)樣品精確稱取0.1 g（±0.1 mg）溶解于10 mL甲醇-異丙醇（1∶1，V/V，5 mmol/L乙酸銨），稀釋10 倍，實(shí)驗(yàn)樣品制備完成后，每個(gè)樣品取等量混勻作為質(zhì)控樣品，以監(jiān)測(cè)儀器的穩(wěn)定性和重復(fù)性，并優(yōu)化UPLCQTOF-MS條件。

1.3.2 脂質(zhì)分離與檢測(cè)

脂質(zhì)分離采用ExionLC AD系統(tǒng)，色譜柱為Kinetex C18柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm，100 ?）。二元梯度洗脫，流動(dòng)相A為甲醇-乙腈-水（1∶1∶3，V/V，5 mmol/L乙酸銨），流動(dòng)相B為異丙醇（5 mmol/L乙酸銨）。梯度洗脫程序?yàn)椋?.0～1.0 min，80% A，20% B；1.0～3.0 min，80%～30% A，20%～70% B；3.0 ～1 3.0 m i n，3 0%～2% A，7 0%～9 8% B；13.0～15.0 min，2% A，98% B；15.0～15.1 min，2%～80% A，98%～20% B；15.1～18.0 min，80% A，20% B。流速0.3 mL/min，柱溫40 ℃，1 μL進(jìn)樣，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣3 次。

使用串聯(lián)QTOF質(zhì)譜進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，配備有DuoSpray離子源，采用正離子模式。數(shù)據(jù)采集使用Analyst TF 1.7.1軟件，并在full-scan TOF MS和MS/MS模式下操作，在單針注射中采用信息依賴采集（information dependent acquisition，IDA）模式、動(dòng)態(tài)背景扣除和實(shí)時(shí)多重質(zhì)量虧損。最佳離子源參數(shù)如下：離子源溫度550 ℃；噴霧電壓5 500 V；氣簾氣30 psi；霧化氣50 psi；輔助加熱氣55 psi；去簇電壓80 V。在全掃描TOF MS中，滯留時(shí)間為250 ms，質(zhì)量掃描范圍m/z200～1 200。在MS/MS模式下，碰撞能量35 eV；擴(kuò)展碰撞能量15 eV；滯留時(shí)間50 ms；質(zhì)量掃描范圍m/z150～1 200。此外，為了維持TripleTOF 6600在數(shù)據(jù)采集中保持高質(zhì)量準(zhǔn)確度，每隔6 個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品，使用自動(dòng)校準(zhǔn)裝置系統(tǒng)對(duì)儀器進(jìn)行校正。

1.3.3 脂質(zhì)的鑒定

采取full-scan TOF MS和MS/MS模式掃描獲得精確的MS和MS/MS信息，使用PeakView 2.2軟件（美國(guó)AB Sciex）結(jié)合LIPIDMAPS[24]數(shù)據(jù)庫，對(duì)甘油三酯和甘油二酯定性分析。采用PeakView軟件鑒定脂質(zhì)，將各脂質(zhì)的分子式、離子加合方式輸入到MasterView插件中，軟件會(huì)算出一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)，根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)和同位素類型的誤差情況計(jì)算出樣品中該化合物的質(zhì)譜信息，并能匹配出液相色譜的出峰時(shí)間及豐度。質(zhì)量誤差范圍設(shè)置為0.02 Da，保留時(shí)間窗口設(shè)置為0.4 min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每種脂質(zhì)的峰面積除以樣品中所有脂質(zhì)峰面積的總和，歸一化脂質(zhì)豐度數(shù)據(jù)。使用SIMCA 15.0（瑞典Umetrics）軟件進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，采用佩爾托標(biāo)度（Pareto scaling）的PCA和正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，

OPLS-DA）建立模型。通過使用SIMCA軟件的默認(rèn)選項(xiàng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行七輪內(nèi)部交叉驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘油酯的定性分析

采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)，對(duì)油茶籽油中脂質(zhì)進(jìn)行分析。以full-scan TOF MS掃描以盡可能多檢測(cè)脂質(zhì)，并且采用MS/MS模式得到脂質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜信息。甘油酯在反相液相色譜上的洗脫依據(jù)等效碳數(shù)（等效碳數(shù)=脂肪?；偺紨?shù)-2雙鍵數(shù)）的大小，等效碳數(shù)越大，保留時(shí)間也就越長(zhǎng)[25]。植物油中脂質(zhì)主要為甘油三酯和甘油二酯，其主要的離子加合方式有3 種：[M+NH4]+、[M+Na]+和[M+H]+。為增強(qiáng)質(zhì)譜信號(hào)，在流動(dòng)相和溶解試劑中添加改性劑乙酸銨。在電噴霧離子源模式下甘油酯以[M+NH4]+加合的質(zhì)譜響應(yīng)最強(qiáng)，因此以[M+NH4]+對(duì)UPLC-QTOF-MS數(shù)據(jù)提取甘油酯。二級(jí)譜圖可以確定甘油酯的脂肪?；溄M成，在碰撞池內(nèi)，前體離子[M+NH4]+離子會(huì)產(chǎn)生碎片離子[M-FA+H]+，即中性丟失FA+NH3[26]。因此可以基于中性丟失的質(zhì)量數(shù)，推測(cè)甘油酯的脂肪?；溄M成，結(jié)果見表1。在浸出和壓榨油茶籽油中均鑒定到43 種甘油三酯和12 種甘油二酯，UPLC-QTOF-MS分析油茶籽油的甘油酯組成見表2。

表1 甘油酯離子[MNH4]的脂肪?；溨行詠G失質(zhì)量數(shù)Table 1 Neutral loss masses of fatty acyl chains of glyceride ion[MNH4]+

表1 甘油酯離子[MNH4]的脂肪酰基鏈中性丟失質(zhì)量數(shù)Table 1 Neutral loss masses of fatty acyl chains of glyceride ion[MNH4]+

注：CN∶DB為?；紨?shù)∶雙鍵數(shù)。表2同。

名稱 CN∶DB 分子式 中性丟失質(zhì)量數(shù)乙酸 2∶0 C2H4O2 77.0辛酸 8∶0 C8H16O2 161.1月桂酸 12∶0 C12H24O2 217.2肉豆蔻酸 14∶0 C14H28O2 245.2肉豆蔻油酸 14∶1 C14H26O2 243.2棕櫚酸 16∶0 C16H32O2 273.3棕櫚油酸 16∶1 C16H30O2 271.3十六碳二烯酸 16∶2 C16H28O2 269.2十六碳三烯酸 16∶3 C16H26O2 267.2硬脂酸 18∶0 C18H36O2 301.3油酸 18∶1 C18H34O2 299.3亞油酸 18∶2 C18H32O2 297.3亞麻酸 18∶3 C18H30O2 295.3花生酸 20∶0 C20H40O2 329.3二十碳烯酸 20∶1 C20H38O2 327.3二十碳二烯酸 20∶2 C20H36O2 325.3山崳酸 22∶0 C22H44O2 357.4芥酸 22∶1 C22H42O2 355.3二十四烷酸 24∶0 C24H48O2 385.4二十四碳烯酸 24∶1 C24H46O2 383.4二十六烷酸 26∶0 C26H52O2 413.4二十六碳烯酸 26∶1 C26H50O2 411.4

表2 UPLC-QTOF-MS分析油茶籽油的甘油酯組成Table 2 Glyceride composition of camellia oil analyzed by UPLC-QTOF-MS

續(xù)表2

2.2 甘油酯的相對(duì)含量

在壓榨和浸出油茶籽油中均檢測(cè)到55 種甘油酯分子，未觀察到壓榨和浸出油茶籽油中甘油酯分子組成的明顯差異。同一類脂質(zhì)之間的質(zhì)譜離子化和質(zhì)譜響應(yīng)具有相似性和可比性，因此甘油酯分子的峰面積可代表其在食用油的含量。通過PeakView 2.2軟件的MasterView插件提取每個(gè)甘油酯分子的峰面積，并計(jì)算甘油酯的相對(duì)含量，進(jìn)一步比較壓榨和浸出油茶籽油中甘油酯分子相對(duì)含量的差異。

在本實(shí)驗(yàn)中觀察到無論是壓榨油茶籽油還是浸出油茶籽油，甘油三酯都是主要成分，相對(duì)含量遠(yuǎn)高于甘油二脂。相比于浸出油茶籽油，壓榨油茶籽油中甘油三酯的相對(duì)含量更高，而甘油二酯的相對(duì)含量較低。壓榨和浸出油茶籽油中甘油三酯的相對(duì)含量存在極顯著差異（P＜0.01），分別為（98.58±0.45）%和（97.94±0.45）%，甘油二酯的相對(duì)含量存在極顯著差異（P＜0.01），分別為（1.42±0.45）%和（2.06±0.45）%。壓榨和浸出油茶籽油中最主要的5 種甘油酯相同，依次為TAG 54∶3、TAG 52∶2、TAG 54∶4、TAG 52∶3和TAG 54∶2，這些甘油酯的脂肪?；湺加?～3 條是油酸（C18∶1）。而且脂肪酰基鏈均為油酸的TAG 54∶3是壓榨和浸出油茶籽油中最主要的甘油酯，相對(duì)含量均超過了30%，壓榨和浸出的相對(duì)含量差異不顯著（P＞0.05）。據(jù)報(bào)道油茶籽油中的油酸占總脂肪酸含量的74%～87%[27]，本實(shí)驗(yàn)從甘油酯的脂肪酰基鏈組成出發(fā)，解析了油茶籽油中油酸在甘油酯上的分布。

2.3 甘油酯的化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

使用UPLC-QTOF-MS技術(shù)鑒定到55 種甘油酯，需要對(duì)多維的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行降維分析，建立判別模型對(duì)壓榨油茶籽油和浸出油茶籽油進(jìn)行鑒別。不同變量之間往往具有非常大的差異，因此為調(diào)整相關(guān)變量的權(quán)重，使用Pareto scaling對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行縮放。佩爾托標(biāo)度是先將數(shù)據(jù)中心化處理后，以數(shù)據(jù)的方差平方根為縮放權(quán)重進(jìn)行縮放。R2X和R2Y分別代表矩陣X和矩陣Y的方差分?jǐn)?shù)。模型解釋度（R2）和預(yù)測(cè)度（Q2）的值越大（接近1），表明模型的解釋能力和預(yù)測(cè)能力越好[28]。一般要求，Q2大于0.9說明模型優(yōu)秀，Q2大于0.5說明模型比較好，R2和Q2值的差值不超過0.2～0.3[29]。

PCA模型是將原始的多維變量按一定權(quán)重組合產(chǎn)生新的主成分，PCA得分圖體現(xiàn)樣本之間的離散和聚集趨勢(shì)。首先將壓榨油茶籽油和浸出油茶籽油的55 種甘油酯用于無監(jiān)督的PCA建模。依據(jù)甘油酯的組成，壓榨油茶籽油和浸出油茶籽油在PCA模型的PC1和PC2上聚集成不同的2 類（圖1A），所有樣本都在95%的置信區(qū)間內(nèi)，R2X和Q2分別為0.964和0.861。所有質(zhì)控樣本在PCA得分圖上緊密聚集在一起，而且同一個(gè)樣本的3 個(gè)重復(fù)也緊密聚集在一起，說明數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。Hotelling'sT2和DMod未觀察到異常樣本。這些結(jié)果表明壓榨油茶籽油和浸出油茶籽油的55 種甘油酯的組成差異，可以區(qū)分壓榨和浸出油茶籽油。

采用有監(jiān)督的OPLS-DA進(jìn)行判別分析，以最大程度地提高組間差異，突出關(guān)鍵變量和潛在標(biāo)志物。浸出油茶籽油和壓榨油茶籽油在OPLS-DA得分圖上聚集成2 類（圖1B）。OPLS-DA模型的R2X=0.643，R2Y=0.942，Q2=0.926，R2Y和Q2差值為0.016，表明模型的解釋能力和預(yù)測(cè)能力非常優(yōu)秀。由于本研究數(shù)據(jù)具有高維度和小樣本的特性，有監(jiān)督的判別模型容易出現(xiàn)過擬合的現(xiàn)象。因此為驗(yàn)證模型的可靠性進(jìn)行置換檢驗(yàn)（圖2），將X矩陣固定不變，隨機(jī)改變Y矩陣，重新建立OPLS-DA模型并計(jì)算R2和Q2。R2和Q2回歸線的斜率越大，與y軸的截距越小，最右端的OPLS-DA判別模型的R2和Q2值大于隨機(jī)改變Y矩陣計(jì)算的R2和Q2值（原始模型的解釋能力和預(yù)測(cè)能力大于隨機(jī)改變Y矩陣的模型），說明判別模型沒有過擬合[29]。OPLS-DA模型經(jīng)200 次置換檢驗(yàn)，R2截距為0.132，Q2截距為-0.402，表明該模型擬合優(yōu)秀未出現(xiàn)過擬合，可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)壓榨和浸出油茶籽油。

圖1 壓榨油茶籽油和浸出油茶籽油中55 種甘油酯的化學(xué)計(jì)量學(xué)分析Fig. 1 Chemometric analysis of 55 glycerides in pressed camellia oil and extracted camellia oil

圖2 壓榨油茶籽油和浸出油茶籽油OPLS-DA判別模型的200 次置換檢驗(yàn)結(jié)果Fig. 2 Results of 200 permutation tests of pressed camellia oil and extracted camellia oil with OPLS-DA

3 討論與結(jié)論

本研究采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)分離和檢測(cè)油茶籽油中的甘油酯，分析了壓榨油茶籽油和浸出油茶籽油中脂質(zhì)的分子種類、脂肪?；溄M成、相對(duì)含量的差異，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析建立區(qū)分壓榨和浸出油茶籽油的判別模型。共鑒定到55 種甘油酯分子，包括43 種甘油三酯和12 種甘油二酯。田瀟瀟等[30]采用高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜技術(shù)在15 個(gè)不同物種/品種油茶果實(shí)中檢測(cè)到24 種甘油三酯，此外Zeb等[31]在油茶籽油中檢測(cè)到15 種甘油三酯。而本研究發(fā)現(xiàn)了許多之前沒有在油茶籽油中報(bào)道過的甘油酯分子，說明UPLC-QTOF-MS技術(shù)結(jié)合IDA掃描具有更高的質(zhì)量精確度、靈敏度和寬的動(dòng)態(tài)范圍，根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)（m/z）和二級(jí)譜圖（MS/MS）有助于分析和鑒定更多的甘油酯分子，對(duì)區(qū)分浸出和壓榨油茶籽油提供大量甘油酯分子組成信息。通過分析甘油酯的脂肪?；溄M成，發(fā)現(xiàn)單個(gè)甘油酯分子（m/z相同的甘油酯）的脂肪?；湸嬖诙喾N可能的組成，以本研究的技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)脂肪酰基鏈異構(gòu)的完全分離。例如依據(jù)二級(jí)質(zhì)譜圖的碎片離子峰推測(cè)甘油酯分子的脂肪?；溄M成，發(fā)現(xiàn)TAG 54∶4分子可能同時(shí)存在2 種脂肪?；溄M成：18∶0/18∶2/18∶2和18∶1/18∶1/18∶2。大白菜葉片的甘油酯分子也存在這一現(xiàn)象，鄭姝寧等[32]采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)在大白菜葉片中鑒定到甘油酯多達(dá)65 種，而且發(fā)現(xiàn)許多甘油酯分子的脂肪?；湸嬖诙喾N組成。甘油酯分子的脂肪?；溛恢?、長(zhǎng)度和不飽和度差異，以及雙鍵的順反異構(gòu)和脂肪?；溛恢卯悩?gòu)，使得甘油三酯的物理化學(xué)性質(zhì)多樣、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而且不同甘油酯分子的含量差異巨大，跨越幾個(gè)數(shù)量級(jí)。但這對(duì)開發(fā)具有更強(qiáng)分離能力的技術(shù)，以解析油茶籽油甘油酯異構(gòu)體的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和生物功能提供了理論依據(jù)。壓榨油茶籽油和浸出油茶籽油中最主要甘油酯的相對(duì)含量并沒有顯著差異，但結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析可以有效區(qū)分壓榨和浸出油茶籽油。

結(jié)果表明采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)的脂質(zhì)組學(xué)分析方法，可快速和準(zhǔn)確地分析食用油甘油酯分子組成，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析建立多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析模型，為分析不同加工工藝油茶籽油的脂質(zhì)組成提供了強(qiáng)大的分析平臺(tái)，對(duì)維護(hù)油茶籽油產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展、保障消費(fèi)者權(quán)益提供了強(qiáng)大的技術(shù)支撐。