UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定畢氏海蓬子中13個(gè)功能成分

邵陽(yáng)陽(yáng) 趙善倉(cāng)馮溫澤 張梅 鄭顏 董燕婕 范麗霞 王磊 李大鵬 馮立田

摘 要：利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法同時(shí)測(cè)定畢氏海蓬子（Salicornia bigelovii，SB）中沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、隱綠原酸、綠原酸、新綠原酸、兒茶素、表兒茶素、異綠原酸-B、蘆丁、異槲皮苷、褪黑素、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷13個(gè)功能成分的含量。樣品利用甲醇提取，過(guò)0.22 μm濾膜后上機(jī)檢測(cè)。采用C18 色譜柱 （100 mm × 2.1 mm，1.7 μm）進(jìn)行分離，以0.1%甲酸水溶液-甲醇為流動(dòng)相，流速0.3 mL/min，柱溫（35±5）℃，采用電噴霧離子源（ESI）、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：13個(gè)功能成分在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，該方法的檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）分別為1.0～20.0 μg/kg、2.0～50.0 μg/kg，平均加標(biāo)回收率在89.10%～109.51%范圍內(nèi)。LC-MS/MS法測(cè)定畢氏海蓬子功能成分快速靈敏，準(zhǔn)確可靠，可用于畢氏海蓬子中功能成分的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：畢氏海蓬子;液相色譜-串級(jí)質(zhì)譜;多功能成分檢測(cè)

畢氏海蓬子是一種耐鹽性較強(qiáng)的鹽生植物[1-3]，其口感脆嫩、形狀似珊瑚、色澤如翡翠且具有豐富的黃酮、多酚等生物活性成分[4-10]，但對(duì)其成分的含量測(cè)定鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的快速、精準(zhǔn)的特點(diǎn)[11-16]，建立同時(shí)測(cè)定畢氏海蓬子中沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、隱綠原酸、綠原酸、新綠原酸、兒茶素、表兒茶素、異綠原酸-B、蘆丁、異槲皮苷、褪黑素、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷13個(gè)成分含量的檢測(cè)方法，為畢氏海蓬子的功能成分檢測(cè)及鹽生植物資源利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品

畢氏海蓬子，于2020年種植于愛(ài)姆海洋生物科技（煙臺(tái)）有限公司煙臺(tái)畢氏海蓬子繁育基地。供試材料為嫩苗期、開(kāi)花期、成熟期植株的地上部分，采集時(shí)間分別為6月26日、8月28日、10月30日。采集嫩苗期、開(kāi)花期、成熟期的畢氏海蓬子1 kg，分別冷凍干燥，粉碎后過(guò)20目篩，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司;AB5500三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)AB SCIEX有限公司;高速離心機(jī)K15，揚(yáng)州Sigma離心機(jī)有限公司;渦旋震蕩儀IKA MS3，德國(guó)IKA工業(yè)設(shè)備公司;電子天平STP-FA2204，上海上平儀器有限公司;氮吹儀N-EVAP-112，美國(guó)Organomation公司;超聲波清洗器KQ-800DE，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試劑

對(duì)照品沒(méi)食子兒茶素（98%，970-74-1，上海源葉生物科技有限公司）、表沒(méi)食子兒茶素（98%，970-74-1，上海源葉生物科技有限公司）、隱綠原酸（98%，905-99-7，上海源葉生物科技有限公司）、綠原酸（98%，327-97-9，上海源葉生物科技有限公司）、新綠原酸（98%，906-33-2，上海源葉生物科技有限公司）、兒茶素（98%，154-23-4，上海源葉生物科技有限公司）、表兒茶素（98%，490-46-0，上海源葉生物科技有限公司）、異綠原酸-B（98%，14534-61-3，上海源葉生物科技有限公司）、蘆丁（98%，100080-201610，中國(guó)食品藥品檢定研究院）、異槲皮苷（98%，112007-201602，中國(guó)食品藥品檢定研究院）、褪黑素（98%，73-31-4，上海源葉生物科技有限公司）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（98%，111538-201606，中國(guó)食品藥品檢定研究院）、槲皮苷（98%，111538-201606，中國(guó)食品藥品檢定研究院）;甲醇、甲酸，均為色譜純，購(gòu)自Merck公司;水為娃哈哈純凈水，其余試劑為分析純。

1.4 方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別準(zhǔn)確稱取對(duì)照品沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、隱綠原酸、綠原酸、新綠原酸、兒茶素、表兒茶素、異綠原酸-B、蘆丁、異槲皮苷、褪黑素、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷10 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，制成濃度為1 mg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確吸取10 μL上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用甲醇定容至10 mL容量瓶，制成1 000 μg/L的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，-20℃保存，備用。取上述的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇稀釋成5、10、20、50、100、200、500 μg/L等7個(gè)濃度系列的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4.2 色譜條件 采用色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18 column （100 mm×2.1 mm，1.7μm）（Waters，USA），流動(dòng)相A為0.1%（v/v）的甲酸水，流動(dòng)相B為甲醇。梯度洗脫條件見(jiàn)表1，進(jìn)樣量2 μL，柱溫（35±5）℃，流速0.3 mL/min。

1.4.3 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離，掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件為MultiQuant 3.0.2工作站，具體參數(shù)：離子源噴霧電壓：+4500 V/-4500V，氣簾氣：20.0 psi，霧化氣：14 psi（表2）。

1.4.4 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取畢氏海蓬子粗粉（過(guò)2號(hào)篩）約2.5 g（精確到0.001 g）加入離心管，向離心管中加入10 mL甲醇，渦旋1 min，靜置24 h后，超聲1.5 h，于8 000 r/min離心10 min，取5 mL上清液，氮吹干后用2 mL的甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm的濾膜過(guò)濾后上機(jī)。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入編輯，以SPSS 25進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素ANOVA方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相條件優(yōu)化

選擇0.1%甲酸-甲醇溶液、0.1%甲酸-乙腈溶液、0.1%甲酸-0.1%甲酸乙腈溶液作為流動(dòng)相，也對(duì)比了不同進(jìn)樣量（1、2、5 μL）和不同柱溫[（25±5）℃、（35±5）℃、（45±5）℃]對(duì) 13種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，最終選擇峰形最好、保留時(shí)間最短的作為色譜條件。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

試驗(yàn)過(guò)程中同時(shí)采用MRM和選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SIM條件下的各成分響應(yīng)較低，尤其是低含量成分褪黑素和兒茶素類，無(wú)法實(shí)現(xiàn)定量分析，因此選擇MRM掃描方式用于畢氏海蓬子中的13個(gè)成分。在MRM模式下，優(yōu)化去簇電壓、碰撞能量，選擇響應(yīng)最強(qiáng)的2個(gè)離子對(duì)分別作為定量離子對(duì)和定性離子對(duì)。

2.3 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

分別采用甲醇、50%甲醇水溶液、乙醇、70%乙醇水溶液進(jìn)行提取，結(jié)果用甲醇提取時(shí)成分較多。在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h這5個(gè)時(shí)間段中，超聲時(shí)間為1.5 h時(shí)提取成分較多。因此，選擇甲醇作為提取溶劑、超聲時(shí)間為1.5 h進(jìn)行提取。

2.4 線性關(guān)系、檢出限及定量下限

不同濃度系列的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液溶液，按“1.4.2”“1.4.3”的設(shè)定方法進(jìn)樣。以各待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、以各待測(cè)成分的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，得回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果表明，13個(gè)成分在相應(yīng)的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，稀釋，分析檢測(cè)，按信噪比S/N=3計(jì)算檢出限，S/N=10計(jì)算定量限，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5 精密度

取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、隱綠原酸、綠原酸、新綠原酸、兒茶素、表兒茶素、異綠原酸-B、蘆丁、異槲皮苷、褪黑素、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷峰面積的RSD分別為1.5%、2.5%、1.3%、1.8%、1.1%、2.1%、1.7%、1.4%、2.2%、1.6%、1.7%、1.3%、2.1%，結(jié)果表明，精密度良好。

2.6 重復(fù)性

按照“1.4.4”的方法制備同一批樣品（SB-3）的供試品溶液，按照“1.4.2”、“1.4.3”的液質(zhì)聯(lián)用條件進(jìn)行分析，結(jié)果表明，沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、隱綠原酸、綠原酸、新綠原酸、兒茶素、表兒茶素、異綠原酸-B、蘆丁、異槲皮苷、褪黑素、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷的平均含量分別為137.33、50.32、1 066.89、2 009.49、2 143.11、103.43、58.99、2 683.46、4 402.64、3 222.85、8.97、687.58、2 833.67 μg/kg，RSD分別為2.7%、3.5%、1.1%、1.9%、2.2%、3.4%、1.5%、2.6%、1.2%、1.7%、2.9%、1.9%、3.1%，結(jié)果表明，重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性

取“1.4.4” 中所應(yīng)對(duì)的同一份供試品溶液，分別于0、8、24 h 進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、隱綠原酸、綠原酸、新綠原酸、兒茶素、表兒茶素、異綠原酸-B、蘆丁、異槲皮苷、褪黑素、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷峰面積的RSD分別為2.3%、1.8%、2.7%、1.2%、1.8%、1.7%、1.1%、3.1%、2.6%、2.3%、1.4%、2.2%、1.3%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加標(biāo)回收率

為了確定該方法的準(zhǔn)確度，向樣品中（SB-3，n=6）加入了不同濃度（50、100、200 μg/L）的制備的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，進(jìn)行了進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.9 樣品測(cè)定

取嫩苗期、開(kāi)花期、成熟期（分別表示為SB-1，SB-2，SB-3）3批畢氏海蓬子，按“1.4.4” 的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表5。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了LC- MS/MS法同時(shí)測(cè)定畢氏海蓬子中沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、隱綠原酸、綠原酸、新綠原酸、兒茶素、表兒茶素、異綠原酸-B、蘆丁、異槲皮苷、褪黑素、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷13個(gè)成分的含量，該方法前處理簡(jiǎn)單、精準(zhǔn)、快速，為畢氏海蓬子的功能成分檢測(cè)及鹽生植物資源利用提供技術(shù)支撐。◇

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Simultaneous Determination of 13 Functional Constituents in Salicornia bigelovii by UPLC-MS/MS

SHAO Yang-yang1，2，3， ZHAO Shan-cang2， FENG Wen-ze4，5， ZHANG Mei2，6， ZHENG Yan2，3， DONG Yan-jie2， FAN Li-xia2， WANG Lei2， Li Da-peng3， FENG Li-tian1

（1Jinan Winsir Biotechnology Co.，Ltd.，Jinan 250100，China;2Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-Products，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Shandong Provincial Key Laboratory of Test Technology on Food Quality and Safety，Jinan 250100，China;3College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China;4 University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China;5Institute of Oceanology Chinese Academy of Sciences，Qingdao 266071，China;6School of Agricultural Engineering and Food Science，Shandong University of Technology，Zibo 255000，China）

Abstract：The contents of 13 functional constituents such as gallocatechin，epigallocatechin，cryptochlorogenic acid，chlorogenic acid，neochlorogenic acid，catechin，epicatechin，isochlorogenic acid B，rutin，isoquercitrin，melatonin，kaempferol-3-O-rutinoside and quercitrin in Salicornia bigelovii were determined by UPLC-MS/MS.The samples were extracted with methanol，and then filtered through 0.2 μm membranes before using the UPLC-MS/MS system for determination.The separation was carried out on C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）with a mobile phase consisting of 0.1% formic acid-methanol at the flow rate of 0.3 mL/min.The column temperature was （35±5）℃.The salicornia bigeloviis were determined in the electrospray ionization mode and multiple reaction monitoring（MRM）mode.The results showed good linear relationships for all analytes in their respective ranges，with their correlation coefficients（R2）all above 0.99.The limits of detection（LOD）and the limits of quantifiction（LOQ）of the method were 1.0—20.0 μg/kg and 2.0—50.0 μg/kg，respectively.The recoveries of 13 functional constituents were in the range of 89.10%-109.51%.UPLC-MS/MS method is rapid，sensitive，accurate and reliable，so it can be applied to the determination of functional constituents in Salicornia bigelovii .

Keywords：Salicornia bigelovii;UPLC-MS/MS;multi-functional constituents detection

基金項(xiàng)目：山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：SD2019ZZ023）。

作者簡(jiǎn)介：邵陽(yáng)陽(yáng)（1997— ），女，碩士研究生，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康。

通信作者：馮立田（1964— ），男，博士，研究方向：鹽生植物資源的開(kāi)發(fā)利用。