孟慶忠,李孝鑒,易先達,李國榮,張 濤,呂 博
(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所,武漢 430064;2.元謀縣果然好農(nóng)業(yè)科技有限公司,云南 楚雄 651300)
朱頂紅(Hippeastrum rutilum),又稱華胄蘭(華北經(jīng)濟植物志要)、對對紅、百枝蓮等,是石蒜科朱頂紅屬多年生草本植物,原產(chǎn)于南美洲。朱頂紅劍葉挺拔,花色豐富,花朵直徑5~30 cm、花葶高度10~70 cm,花瓣形態(tài)多樣,適宜盆栽、鮮切花生產(chǎn)、罐裝裸球(無需土壤及澆水)、道路綠化、庭院裝飾等,適應(yīng)種植環(huán)境廣、觀賞花葉俱佳,作為高檔觀賞花卉市場前景廣闊[1-4]。
目前,國內(nèi)科研單位報道多以組培快繁技術(shù)為主,針對病蟲害的研究較少。朱頂紅的花葉病毒病和紅斑病在栽培中較多常見,但對于朱頂紅根腐病認(rèn)識不足,很多購買進口種球的消費者在種植過程中經(jīng)常發(fā)生種球根盤腐爛,近而整株枯死,多是由于土壤通透性差、水肥管理不當(dāng)而引起的朱頂紅根腐病。進口朱頂紅種球僵球問題也困擾著消費者,一種原因可能是種球因過度低溫冷藏導(dǎo)致自身調(diào)節(jié)問題,有待試驗驗證;另一種原因可能是新根萌發(fā)后受到根腐病病菌侵染,導(dǎo)致根尖發(fā)紅腐爛,進而產(chǎn)生僵球現(xiàn)象。魯憲[5]研究指出,朱頂紅根腐病從根部侵染,引起根部腐爛,慢慢擴展至種球,引起種球腐爛。染病葉片呈現(xiàn)出不規(guī)則紅褐色,進而引起早期黃葉。本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法,對朱頂紅根腐病的病原菌進行鑒定,為防治朱頂紅根腐病提供理論依據(jù)。
供試材料為進口朱頂紅品種花瓶(Gervase),取新萌發(fā)的發(fā)病根組織(圖1)帶回實驗室進行病菌分離。病原菌分離采用常規(guī)組織分離法:發(fā)病根組織洗凈后切成2~3 mm 的小段,置于3% 次氯酸鈉溶液中浸泡45 s,然后轉(zhuǎn)入75%乙醇溶液中浸泡60 s,再用無菌水清洗3 次,在無菌濾紙上吸干水分,最后用無菌手術(shù)鑷將其轉(zhuǎn)入馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板中,25 ℃培養(yǎng)5 d。
圖1 朱頂紅根腐病根部
挑取新鮮菌絲于Czapek 液體培養(yǎng)基中,置于25 ℃下160 r∕min 振蕩培養(yǎng)7 d,經(jīng)3 層無菌紗布過濾后,吸取少量孢子液于血球計數(shù)板中,在40 倍光學(xué)顯微鏡下測定孢子液濃度,并用無菌水將孢子液濃度稀釋至106個孢子∕mL。再用無菌槍頭吸取1 μL 孢子液于PDA 平板中,加入100 μL 無菌水涂布均勻,25 ℃培養(yǎng)2~3 d,挑取病原菌單菌落。
菌株采用活體接種。試驗設(shè)置a(劃傷根部對照)、b(劃傷根部接種)、c(幼嫩根部無劃傷對照)、d(幼嫩根部無劃傷接種)4 種處理。盆栽朱頂紅品種為進口品種艾斯黛拉(Estella),盆栽土壤經(jīng)過121 ℃、120 min 滅菌處理。小心挖出盆栽朱頂紅新鮮根部,減少根部損傷,無菌水沖洗掉根表面土壤,用無菌雙刃刀片劃傷根部,脫脂棉浸透孢子液,包裹根部,對照采用無菌水浸透脫脂棉包裹,盆栽朱頂紅置于25 ℃培養(yǎng)室,5 d 后取樣觀察。
1)形態(tài)學(xué)鑒定:將病原菌接種于新鮮PDA 平板上,置于25 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)7 d,觀察菌落生長情況。挑取邊緣菌絲于Czapek 液體培養(yǎng)基中,25 ℃條件下160 r∕min 振蕩培養(yǎng)7 d,在顯微鏡下觀察孢子形態(tài)特征。
2)分子鑒定:采用CTAB 法提取病原菌菌絲DNA。采用PCR 擴增核糖體RNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)基因,ITS 基因擴增使用的引物為ITS1 和ITS4,由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。20 μL PCR 擴增體系:7 μL ddH2O、10 μL PCR Mix 試劑、Primer-1 和Primer-2 各1 μL、DNA 模板1 μL。PCR 產(chǎn)物送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序,并將得到的基因序列與NCBI 基因庫中的序列進行對比,確定菌株分類地位。
病原菌在PDA 平板上的菌落呈圓形,菌絲最初為白色絨毛狀,隨時間菌落逐漸變?yōu)闇\黃色。菌落中分生孢子有2 種形態(tài),小型分生孢子卵圓形或橢圓形,有1~2 個橫隔,大小為(19.5~20.5)μm×(5.4~6.8)μm;大型分生孢子較直或稍彎曲為鐮刀形,有較多橫隔,大小為(27~43)μm×(4.5~5.4)μm。
圖2 病原菌菌落正面(a);病原菌菌落背面(b);病原菌分生孢子形態(tài)(c)
劃傷根部對照傷口輕微發(fā)紅(圖3a),可能是由于機械損傷導(dǎo)致朱頂紅種球根組織酚類物質(zhì)氧化物積累所致。劃傷根部接種病菌(圖3b)傷口處腐爛潰縮,呈紅色并沿導(dǎo)管方向擴展,根表面可見白色菌絲。幼嫩根部未劃傷接種(圖3d)可見根部表皮變紅,根尖侵染變紅,幼嫩根部未劃傷對照(圖3c)未見異常病變,根尖正常。從發(fā)病根部上可重新分離得到該病原菌,重新分離得到的病原菌的培養(yǎng)性狀,分生孢子形態(tài)及大小均與最初分離到的菌株相同,確定該菌株即為病原菌。
圖3 人工接種菌株致病性測定
將所得序列在NCBI 基因庫中進行序列對比,該病原菌菌株與Fusarium solanistrain F13 菌株的相似性為100%,片段大小為537 bp,其登錄號為KP310868.1。
有關(guān)朱頂紅根腐病病原菌的鑒定研究僅限于形態(tài)學(xué)方面,鑒定結(jié)果可能導(dǎo)致一定程度的誤差。目前國際上利用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合鑒定病原菌已成為一種趨勢[6-10]。綜合病原形態(tài)特征、ITS 序列比對結(jié)果,初步確定引起朱頂紅根腐病的病原菌為半知菌類叢梗孢目(Moniliales)瘤座孢科(Tuber?culariaceae)鐮刀菌屬(Fusarium)的腐皮鐮刀菌(Fu?sarium solani)。
朱頂紅根腐病是一種嚴(yán)重的真菌病害,侵染全株疏導(dǎo)組織感染,進而引發(fā)整株腐爛枯死。其病原菌存在于土壤中,主要侵染根部,剛萌動的新根根尖易感染,使根尖發(fā)紅腐爛,對朱頂紅的品種繁育和栽培管理危害較大。目前,國內(nèi)銷售的商品球大部分都是荷蘭、南非等國進口,對于國內(nèi)消費者來說,其價格昂貴,國內(nèi)有關(guān)朱頂紅育種與商品種球生產(chǎn)很少,嚴(yán)重制約朱頂紅產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,商品種球國產(chǎn)化是朱頂紅產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最大瓶頸,配套栽培技術(shù)方面的研究也相對滯后。呂英民等[11]指出引起朱頂紅根腐病的致病菌為尖孢鐮刀菌,這與本研究結(jié)果不一致,可能由于種植品種、區(qū)域土壤環(huán)境和鑒定方法不同,本研究未分離鑒定出尖孢鐮刀菌。本研究初步確定了腐皮鐮刀菌是引起朱頂紅根腐病的病原菌之一,為朱頂紅栽培管理上提供理論依據(jù)。