基于CRISPR/Cas9技術構建點突變小鼠概述

劉素麗 朱 云 武會娟

(1. 北京實驗動物研究中心有限公司，北京 102609)(2. 國家兒童醫(yī)學中心 首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院 感染與病毒研究室，北京 100045)

雖然利用小鼠胚胎干細胞技術進行基因修飾的原理至今仍然適用，但CRISPR/Cas9技術的出現(xiàn)或者技術使得在小、大鼠和其它物種中構建基因工程模式生物更加容易[1-2]。Cas9核酸酶在sgRNA的引導下，在特定基因組位點產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks，DSBs)，隨后DSBs通過易錯的非同源末端連接(Non-Homologous End-Joining，NHEJ)和高保真同源介導修復(homology-directed repair，HDR)機制進行修復。NHEJ可導致插入或缺失(insertions or deletions，InDels)，利用此修復方式可以通過一個sgRNA在靶基因編碼區(qū)引入移碼突變或通過兩個sgRNA刪除關鍵外顯子或轉錄調控元件，從而構建基因敲除(Knock-Out，KO)小鼠模型；HDR是當供體模板存在時，能夠產(chǎn)生精確的基因修飾，因此被用來構建敲入(Knock-In，KI)小鼠模型，但是效率較KO低。根據(jù)文獻得知，KI中引入的模板序列可以是單鏈寡聚核苷酸(single-stranded DNA oligonucleotides，ssODN)[3-4]，也可以是帶有長同源臂的雙鏈DNA(double-strand DNA，dsDNA)[5-6]。ssODN適用于向靶位點引入短片段如小的融合標簽(HA、Flag、V5)或點突變，而dsDNA則主要用于引入長片段如大的標簽或熒光標記(GST、GFP、mCherry)。但dsDNA作為修復模板容易發(fā)生隨機整合(尤其是線性dsDNA)，并且其會對細胞產(chǎn)生毒性。Ghanta等[7]研究得到，相較于dsDNA，ssODN具有更高的修復效率。

點突變小鼠是轉錄因子結合、磷酸化位點功能分析和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)作用檢測的重要體內(nèi)研究工具。通過將Cas9 mRNA/sgRNA和ssODN共同注入小鼠受精卵可高效制備點突變小鼠。本文將重點概述利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和ssODN供體構建點突變小鼠的方法，例如sgRNA和ssODN的設計及體外轉錄、受精卵顯微注射、子代鼠基因型鑒定等。

1 sgRNA和ssODN的設計

1.1 sgRNA的設計

設計sgRNA之前，考慮到SNP會影響Cas9的結合和切割，因此應擴增靶位點附近片段，并將靶片段的Sanger測序結果與GenBank中的參考序列進行比對確認靶位點附近是否存在SNP。隨后將靶序列導入在線網(wǎng)站CRISPOR web tool(http://crispor.tefor.net/)設計sgRNA，并使用在線網(wǎng)站Cas-OFFinder(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)預測潛在脫靶位點。由于還沒有一種預測工具能夠保證sgRNA的效果，通常選擇設計多個sgRNA，并利用體外切割實驗和細胞內(nèi)切割實驗來驗證多個sgRNA的有效性，最終選擇效率較高的sgRNA進行后續(xù)受精卵注射。

1.2 ssODN的設計

獲得KI小鼠的成功率依賴sgRNA的特異性和效率，但更大程度上依賴供體ssODN的設計，其同源臂長度、對稱性、方向等均影響HDR效率，原因如下：①同源臂長度一般為40～80 bp[8-12]。不同研究中所使用的同源臂最優(yōu)長度不一致[13-17]，但供體總長度需在200 bp以內(nèi)，否則合成難度增大且價格較高。但也有研究利用長ssDNA(single-strand DNA)成功實現(xiàn)點修復和長片段的敲入[18-22]；②通常對稱ssODN效率最高，即Cas9切割位點位于中間，并且選擇距離突變位點最近的sgRNA(少于20～25 bp)[23]進行。有研究證明相較于對稱供體，非對稱供體介導的HDR效率更高[10, 16, 24]；③與sgRNA互補的ssODN效率更高[10, 25]，但并未在所有位點觀察到這種鏈偏好[24]；④為了避免Cas9切割供體以及修飾后的靶序列(突變位點在sgRNA序列及PAM外)，在供體的前間隔序列鄰近基序(protospacer adjacent motif,PAM)序列NGG或PAM近端的sgRNA序列引入一個同義突變[12](NGG不能突變成為能被Cas9識別的NAG)；⑤引入上述同義突變后，確保靶基因的氨基酸序列不變，特別是突變位點位于外顯子和內(nèi)含子交接處?？傊?，可能由于不同研究中所使用的細胞系、靶位點等不同ssODN的設計有所差異。

2 sgRNA和Cas9的體外轉錄及活性檢測

攜帶由T7啟動子驅動的Cas9基因的質粒可用來體外轉錄產(chǎn)生Cas9 mRNA[26]是一種無需連接反應的PCR方法，也可作為體外轉錄產(chǎn)生Cas9 mRNA的模板[12]。sgRNA可以利用質粒或PCR產(chǎn)物進行體外轉錄[26]。另外，一種無需克隆而是利用共享一段重疊區(qū)域的兩個長寡核苷酸進行重疊PCR后的產(chǎn)物也可以作為sgRNA的體外轉錄模板[27]。向胚胎注射有活性的sgRNA對于基因編輯的成功非常重要，利用小鼠細胞進行活性檢測是很好的方法，但需要考慮轉染效率。體外切割實驗，即在轉錄得到sgRNA后，Cas9重組蛋白誘導包含靶位點在內(nèi)的PCR片段，產(chǎn)生雙鏈斷裂(DSB)。體外切割實驗也可以用來檢測sgRNA活性，但無法保證檢測到的sgRNA在體內(nèi)仍然具有活性。

3 受精卵顯微注射

將Cas9 mRNA/sgRNA和ssODN共同注射入受精卵可以對小鼠胚胎進行高效的基因組編輯。原核RNA注射和胞質RNA注射產(chǎn)生的整體編輯效率相當。由于原核注射對胚胎的損害更大，因此胞質注射產(chǎn)生的活仔更多，并且胞質注射更方便和更簡單。Singh等[2]和Yang等[12]采用了不同注射方式及不同注射濃度，但均證實較HDR NHEJ效率更高。其介導的InDels采用胞質注射時，在較高的Cas9 mRNA(100 ng/μL)和sgRNA(50 ng/μL)注射濃度時，產(chǎn)生的大部分胚胎也是健康的。由于ssODN需在核內(nèi)發(fā)揮作用，因此HDR介導的修復采用原核顯微注射或者在原核注射退針時進行胞質注射，效果可能會更好。

4 子代鼠基因型鑒定

考慮到多個位點同時突變以及基因型嵌合的存在，表型分析之前需要進行詳細的基因分型。多種分型策略已應用到CRISPR/Cas9介導的基因修飾小鼠的鑒定。最常用的SURVEYOR核酸酶可以檢測并切割野生型鏈和包含InDels的擴增子鏈形成的異源雙鏈分子，從而確定是否發(fā)生編輯；通過PAM或sgRNA識別位點內(nèi)限制位點的丟失/獲得或者PCR擴增子在凝膠電泳中可辨別的大小變化來判斷是否發(fā)生編輯。但以上兩種方法均無法確定突變的準確序列。由于存在兩個或多個不同的等位基因，直接Sanger測序擴增子也存在問題。因此，可以將PCR產(chǎn)物克隆入質粒載體，挑取足夠數(shù)量的單克隆進行Sanger測序，但這種方法費時而且可能無法覆蓋所有等位變異，尤其是無法覆蓋嵌合體。另外一種方法是利用深度測序，對PCR擴增靶片段進行分析，同時檢測潛在脫靶位點，但二代測序中使用小片段擴增子，因此無法檢測到某些片段的缺失/修飾。以上鑒定方法各有優(yōu)缺點。對于本文概述的點突變和小的標簽插入，可以通過擴增靶位點附近的序列并將PCR產(chǎn)物與T載體連接，挑取數(shù)個單克隆進行Sanger測序，從而獲得所有基因型，但對于較大的插入或缺失，則需要進行側翼PCR(flanking PCR)和Southern blot實驗。

5 局限性

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的主要局限是可能產(chǎn)生脫靶，但已檢測到的大量脫靶是基于細胞實驗，而小鼠胚胎中CRISPR/Cas9誘導的基因編輯是高度特異的[8-9]。產(chǎn)生上述差異的原因可能是胚胎注射實驗中，由mRNA表達的Cas9蛋白是瞬時的，而細胞轉染實驗中由質粒產(chǎn)生的Cas9蛋白表達時間更久。另外，使用永生化細胞系或癌癥細胞系進行脫靶分析，無法代表正常細胞中的脫靶情況。此外，經(jīng)過幾代育種篩選后，脫靶突變也可能逐漸消失。為降低脫靶幾率，控制Cas9和sgRNA的表達時間，如使用Cas9/sgRNA核糖核蛋白(RNP)復合物來實現(xiàn)基因編輯[28-30]，RNP復合物在導入后12～24 h內(nèi)即可切割染色體DNA，并且Cas9蛋白在24～48 h內(nèi)會迅速降解[31]。另一種降低脫靶的策略是使用Cas9切口酶(Cas9n)[32]的“雙切口”策略，即利用一對sgRNA在靶位點的兩條鏈分別產(chǎn)生一個切口，隨后在供體存在時進行HDR介導編輯。由于單切口的脫靶位點可以進行無突變修復，而只有雙切口的靶位點才能產(chǎn)生后續(xù)編輯。因此雙切口靶位點可顯著提高基因編輯的特異性[26, 33]。另外，全基因組深度測序也是檢測子代鼠是否存在脫靶的一種策略。

向受精卵顯微注射Cas9 mRNA/sgRNA構建基因修飾小鼠的另一個弊端是通常會產(chǎn)生嵌合體動物。嵌合體使基因和表型分型更為復雜，因此，需要經(jīng)歷長時間的繁育純化過程。為降低嵌合率及脫靶現(xiàn)象，既可以通過直接遞送Cas9蛋白而非RNA或借助一種名為Past-CRISPR的方法(parental allele-specific gene-targeting)，即利用原核互換顯微操作技術介導的胞質稀釋作用時空特異性地控制Cas9的編輯活性[35]。

6 小結

利用CRISPR/Cas9技術構建的點突變小鼠具有極大的科研和臨床價值，能夠助力多種疾病的機制研究[36-38]。本文對點突變小鼠構建的一般流程進行綜述，希望能為基于CRISPR/Cas9技術構建點突變小鼠實驗提供一定的理論參考。