段凱莉，江聰，王光輝

西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌712100

由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）引起的小麥赤霉病是一種世界性的真菌病害。隨著氣候變暖以及秸稈還田等耕作制度的實(shí)施，小麥赤霉病在我國長江中下游和黃淮麥區(qū)頻繁發(fā)生，其發(fā)病區(qū)域呈北擴(kuò)西移的態(tài)勢，對我國糧食安全構(gòu)成了巨大威脅[1]。該病害不但嚴(yán)重降低小麥產(chǎn)量，其病原菌還會分泌脫氧雪腐鐮刀烯醇（deoxynivalenol,DON）和玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEN）等多種真菌毒素污染小麥籽粒及其制品，造成嚴(yán)重的食品安全問題[2]。目前施用化學(xué)藥劑依然是防治小麥赤霉病最有效的手段，然而近年來菌株抗藥性、農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等問題日益凸顯[3]。因此從長遠(yuǎn)角度出發(fā)，深入研究禾谷鐮刀菌在生長發(fā)育、毒素合成以及植物侵染等過程中的關(guān)鍵基因，對于抗小麥赤霉病分子育種以及發(fā)掘綠色殺菌劑的特異靶標(biāo)等都具有十分重要的指導(dǎo)意義。

蛋白磷酸化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，生物體內(nèi)大約30%的蛋白存在磷酸化修飾[4]。蛋白的磷酸化修飾可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生物活性、穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位以及蛋白質(zhì)互作等，幾乎參與了整個生命周期的所有生命活動[5]。蛋白激酶是一個大家族，可將ATP中的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至底物蛋白的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基上，而蛋白磷酸酶則介導(dǎo)了底物蛋白的去磷酸化過程[6]。在釀酒酵母中共鑒定到127個蛋白激酶基因，約占整個基因組的2%，它們參與了信號傳導(dǎo)、細(xì)胞分裂、有性（無性）生殖、環(huán)境應(yīng)答等重要生物學(xué)過程[4,7]。蛋白激酶在植物病原真菌中也扮演著重要角色，參與了營養(yǎng)生長、生殖、脅迫應(yīng)答和植物侵染等過程。2011年，Wang等[8]以禾谷鐮刀菌為研究對象，首次系統(tǒng)地解析了植物病原真菌中蛋白激酶的生物學(xué)功能。在最近十年的研究中，禾谷鐮刀菌蛋白激酶的研究又取得了一系列的重要進(jìn)展。本文總結(jié)了禾谷鐮刀菌蛋白激酶在生長發(fā)育和致病力等方面的生物學(xué)功能和分子機(jī)制，并對未來禾谷鐮刀菌蛋白激酶的研究趨勢進(jìn)行了展望。

1 禾谷鐮刀菌中蛋白激酶概況

在真核生物中，蛋白激酶超家族分為典型的蛋白激酶和非典型的蛋白激酶[7]。根據(jù)序列同源性、結(jié)構(gòu)域和調(diào)控模式等特征，典型的蛋白激酶又細(xì)分為8組，具體為AGC、CAMK、CK1、CMGC、RGC、STE、TK和TKL；非典型的蛋白激酶具有保守的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域（PF00069），而與典型的蛋白激酶無序列同源性。非典型的蛋白激酶主要包括Alpha、PIKK、PDHK和RIO等，均已被證實(shí)具有激酶活性。在禾谷鐮刀菌中共鑒定到116個蛋白激酶基因，20個是致死基因，而剩余的96個蛋白激酶基因都能被敲除[8]。其中42個激酶基因的敲除突變體致病力顯著下降或完全喪失，3個激酶基因的突變體完全喪失產(chǎn)分生孢子的能力，26個激酶基因的突變體則不能形成子囊殼或子囊孢子發(fā)育異常，19個激酶基因突變體的子囊孢子無法正常噴發(fā)，另外還有5個激酶基因的突變體對高滲脅迫表現(xiàn)出較高的耐受性。由此可見，在禾谷鐮刀菌中蛋白激酶參與了生長發(fā)育、無性（有性）生殖、脅迫應(yīng)答和植物侵染等多種重要過程。

2 蛋白激酶A（PKA）

PKA又被稱為cAMP依賴的PKA，其介導(dǎo)的信號途徑普遍存在于真核生物中，參與了細(xì)胞生長、細(xì)胞分裂、營養(yǎng)利用、脅迫應(yīng)答等多個生物學(xué)過程。在釀酒酵母中，PKA復(fù)合體由兩個催化亞基和兩個調(diào)節(jié)亞基共同組成，在未受到環(huán)境刺激時處于鈍化狀態(tài)。當(dāng)感受到外界信號后，胞內(nèi)cAMP濃度迅速升高并與PKA調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，導(dǎo)致PKA復(fù)合體構(gòu)象發(fā)生變化，從而釋放出催化亞基將底物蛋白磷酸化[9]。

在禾谷鐮刀菌中，存在Cpk1和Cpk2兩個PKA催化亞基，只有CPK1基因的缺失會導(dǎo)致菌株生長、產(chǎn)孢率、DON毒素合成和致病力的顯著降低[10]。腺苷酸環(huán)化酶參與了胞內(nèi)cAMP的生物合成，禾谷鐮刀菌腺苷酸環(huán)化酶基因FAC1的缺失也會顯著降低DON毒素合成和致病力[10]。在產(chǎn)毒誘導(dǎo)條件下，禾谷鐮刀菌胞內(nèi)cAMP濃度顯著升高，而添加外源cAMP也會誘導(dǎo)TRI基因簇的表達(dá)和DON毒素的合成[11]。另外，在禾谷鐮刀菌中存在兩個cAMP磷酸二酯酶基因PDE1和PDE2，其雙敲除突變體pde1 pde2菌落生長極其緩慢，雖然DON毒素合成顯著上升，但卻只能使小麥穗部的接種點(diǎn)發(fā)病[11]。因而，cAMP-PKA途徑在禾谷鐮刀菌的營養(yǎng)生長、DON毒素合成和植物侵染等過程中具有重要作用。有研究表明，在禾谷鐮刀菌中PKA信號途徑可通過磷酸化修飾解除FgSfl1的轉(zhuǎn)錄抑制功能進(jìn)而激活下游基因的表達(dá)[12]。Li等[13]的研究顯示禾谷鐮刀菌PKA調(diào)節(jié)亞基（PKR）的缺失盡管會顯著上調(diào)CPK1的轉(zhuǎn)錄水平，但也會造成Cpk1蛋白的降解，暗示可能存在一條負(fù)反饋調(diào)節(jié)途徑通過降解Cpk1來抑制cAMP-PKA信號途徑的過激活。然而，CPK1基因的自發(fā)點(diǎn)突變可以部分恢復(fù)pkr突變體的表型缺陷，而這些突變可能增加了Cpk1蛋白的穩(wěn)定性[13]。目前，禾谷鐮刀菌中cAMP-PKA信號途徑的調(diào)控機(jī)制已有較多的研究，但是對其上游膜受體以及下游靶基因尚缺乏深入的研究。

3 促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）

MAPK介導(dǎo)的信號途徑是一類在真核生物中十分保守的重要信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，是由MAPKKK（MAP kinase kinase kinase）、MAPKK（MAP kinase kinase）和MAPK（MAP kinase）構(gòu)成的一個三激酶級聯(lián)體系[14]。在接收到胞外信號后，MAPK級聯(lián)激酶通過依次磷酸化將信號放大并傳遞至細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)而激活下游轉(zhuǎn)錄因子和其他靶蛋白，使細(xì)胞作出適當(dāng)?shù)膽?yīng)答。在禾谷鐮刀菌中共鑒定到3個MAPK蛋白激酶Gpmk1、FgHog1和Mgv1，它們分別與釀酒酵母中的信息素響應(yīng)/絲狀生長信號途徑（Fus3/Kss1 pathway）、細(xì)胞壁完整性信號途徑（CWI pathway）以及高滲透壓甘油信號途徑（HOG pathway）中的MAPK同源[8]。

3.1 Gpmk1蛋白激酶

在釀酒酵母中，F(xiàn)us3和Kss1兩個MAPK蛋白激酶分別介導(dǎo)了Ste11-Ste7-Fus3和Ste11-Ste7-Kss1信號途徑，二者分別調(diào)控了釀酒酵母的信息素應(yīng)答和絲狀生長[15]。在釀酒酵母中，膜受體蛋白在接收到胞外部信號后，會將信號傳遞給Ste11-Ste7-Fus3信號途徑。雙磷酸化的Fus3蛋白激酶變?yōu)榧せ顟B(tài)，進(jìn)入細(xì)胞核中磷酸化特定的底物蛋白從而啟動有性生殖過程；而當(dāng)營養(yǎng)匱乏時，外界信號則通過Ste11-Ste7-Kss1信號途徑激活釀酒酵母的絲狀生長[16]。

2003年Jenczmionka等[17]首 次 克 隆 了Fus3/Kss1在禾谷鐮刀菌中的同源蛋白Gpmk1，發(fā)現(xiàn)GPMK1基因的缺失不僅導(dǎo)致禾谷鐮刀菌營養(yǎng)生長和分生孢子產(chǎn)率的嚴(yán)重下降，還造成gpmk1突變體有性生殖和致病力的完全喪失。2005年Jenczmionka等[18]還報道，Gpmk1調(diào)控了內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶、蛋白水解酶和脂肪酶的分泌，但對淀粉酶和果膠酶無調(diào)控作用。另外，Urban等[19]發(fā)現(xiàn)MAP1（即GPMK1）基因的缺失導(dǎo)致DON產(chǎn)量下降。因而，Gpmk1可能通過調(diào)控DON毒素和細(xì)胞壁降解酶的合成參與禾谷鐮刀菌對小麥的侵染。近些年，禾谷鐮刀菌中Gpmk1信號途徑的一些上游元件、膜受體以及下游轉(zhuǎn)錄因子也被鑒定出來。有研究表明Fst11和Fst7分別為Gpmk1信號途徑中的MAPKKK和MAPKK[8]，而小G蛋白Ras2為Gpmk1信號途徑上游的重要分子開關(guān)[20]。膜蛋白FgSho1和GPCR蛋白Giv1被證明為Gpmk1信號途徑的膜受體，二者均調(diào)控了Gpmk1信號途徑的激活[21-22]。有趣地是，膜受體Giv1也調(diào)控了cAMP-PKA信號途徑的激活[22]。2015年Gu等[21]報道FgSte12為Gpmk1激酶下游的轉(zhuǎn)錄因子，Gpmk1不但調(diào)控了FgSTE12基因的轉(zhuǎn)錄水平，而且調(diào)控了FgSte12蛋白的核定位效率，另外二者在禾谷鐮刀菌侵染墊形成、菌絲穿透和細(xì)胞壁降解酶分泌等過程中具有相似的功能。

3.2 FgHog1蛋白激酶

HOG信號途徑廣泛存在于動物和真菌等真核生物中，是生物體應(yīng)對高滲脅迫所必需的[15]。在釀酒酵母中，HOG信號途徑的核心部分由1個MAPK（Hog1）、1個MAPKK（Pbs2）和3個MAPKKK（Ste11、Ssk2和Ssk22）組成，該信號途徑由兩個信號支路來激活Pbs2-Hog1[16]。一條支路信號來自膜受體Sln1，信號沿Ssk2/Ssk22-Pbs2-Hog1傳遞；另外一條支路信號來自膜受體Sho1和Msb2，信號沿Ste11-Pbs2-Hog1傳遞。

Zheng等[23]首先在禾谷鐮刀菌中鑒定出HOG信號途徑中的3個級聯(lián)激酶FgSsk2、FgPbs2和FgHog1。這3個激酶基因均參與了菌絲生長、有性生殖、DON毒素合成和植物侵染等過程。Zheng等[23]還揭示了FgHog1信號途徑通過調(diào)控甘油、阿拉伯糖醇、甘露醇和蔗糖的合成以應(yīng)對高滲脅迫環(huán)境，另外FgHog1信號途徑還調(diào)控了病原菌對氧化脅迫、細(xì)胞膜脅迫以及細(xì)胞壁脅迫的應(yīng)激反應(yīng)。2011年，Jiang等[24]發(fā)現(xiàn)2C型磷酸酶FgPtc3通過負(fù)調(diào)控FgHog1的磷酸化水平，進(jìn)而參與了病原菌的產(chǎn)毒、致病以及脂質(zhì)體的形成。

3.3 Mgv1蛋白激酶

細(xì)胞壁是病原真菌的天然屏障，在抵御外界物理、化學(xué)和生物等不利環(huán)境因子方面發(fā)揮了重要的作用。絲狀子囊菌保留了與釀酒酵母Bck1-Mkk1/Mkk2-Slt2同源的MAPK級聯(lián)途徑，該信號途徑作用于小G蛋白Rho1和蛋白激酶C（PKC）的下游，并調(diào)控了細(xì)胞壁的完整性[7]。

2002年，Hou等[25]首先在禾谷鐮刀菌中克隆了釀酒酵母SLT2的同源基因MGV1(MAP kinase for growth and virulence 1），并對該基因進(jìn)行了敲除。mgv1突變體菌落生長極其緩慢，并表現(xiàn)出嚴(yán)重的細(xì)胞壁缺陷，另外mgv1突變體基本喪失了有性生殖、DON毒素合成和植物侵染的能力。表明MGV1是禾谷鐮刀菌營養(yǎng)生長、有性生殖、致病力以及維持細(xì)胞壁完整性所必需的。此外，還有研究表明Mgv1和Gpmk1在禾谷鐮刀菌抵御真菌防御素MsDef1的過程中具有重要作用[26]。Yun等[27]報道禾谷鐮刀菌Mgv1上游的MAPKK（FgMkk1）和下游的轉(zhuǎn)錄因子FgRlm1均參與了細(xì)胞壁完整性、DON毒素合成以及病原菌的致病力，而FgMkk1還參與了對外界滲透脅迫和氧化脅迫的應(yīng)答。該研究進(jìn)一步揭示FgMkk1同時調(diào)控了CWI和HOG信號途徑的激活[27]，這也暗示這兩條MAPK信號途徑之間存在相互交流。此外，有研究報道FgSho1[21]和FgWsc2B[28]為CWI信號途徑的膜受體，二者均調(diào)控了Mgv1的磷酸化水平。

3.4 FgGpmk1、FgHog1和Mgv1激酶間的交互作用

3個MAP激 酶Mgv1、FgHog1和FgGpmk1均參與了禾谷鐮刀菌的菌絲生長、生殖、植物侵染和脅迫應(yīng)答，且三者之間也存在著聯(lián)系。FgHOG1的缺失部分恢復(fù)了mgv1突變體在營養(yǎng)生長和細(xì)胞壁完整性方面的缺陷，而MGV1的缺失也顯著降低了Fghog1突變體對高滲脅迫的敏感性[29]。研究顯示在mgv1突變體中FgHog1的磷酸化水平升高，而在mgv1 Fghog1雙敲突變體中Gpmk1的磷酸化水平也顯著升高，尤其是在細(xì)胞壁脅迫條件下[29]。推測mgv1 Fghog1雙敲突變體中Gpmk1信號途徑的激活，可能參與了細(xì)胞壁的重構(gòu)。

4 FgTor蛋白激酶

To（rtarget of rapamycin）蛋白激酶在真核生物中十分保守,且具有重要的生物學(xué)功能，一直受到科學(xué)家的廣泛關(guān)注。在20世紀(jì)90年代初期，Heitman等[30]首先在釀酒酵母中鑒定到TOR信號途徑的核心元件——Tor激酶。在真核生物中，Tor蛋白的結(jié)構(gòu)和功能都十分保守，大部分物種中只有1個Tor蛋白，然而在釀酒酵母和裂殖酵母中存在兩個Tor蛋白（Tor1和Tor2）。在釀酒酵母中，Tor1和Tor2與不同的蛋白形成TORC1和TORC2兩個復(fù)合體。TORC1代表雷帕霉素敏感的信號分支，通過激活合成代謝和抑制分解代謝促進(jìn)細(xì)胞生長。TORC2對雷帕霉素不敏感，該復(fù)合體在細(xì)胞骨架重塑和細(xì)胞內(nèi)吞等方面發(fā)揮重要功能[31]。在釀酒酵母中，雷帕霉素與肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶Fkbp12形成復(fù)合體，進(jìn)而與TORC1互作并抑制TORC1所介導(dǎo)的信號途徑[30]。

2014年Yu等[32]首次解析了禾谷鐮刀菌中TOR信號通路中關(guān)鍵元件的功能以及該信號途徑的作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，與釀酒酵母不同，禾谷鐮刀菌中僅含有1個TOR蛋白激酶FgTor，且為致死基因。雷帕霉素可以與FgFkbp12形成復(fù)合體，直接與FgTor的FRB結(jié)構(gòu)域互作從而抑制FgTor的激酶活性。而FgTor通過下游的FgTap42-磷酸酶（FgPp2A、FgSit4或FgPpg1）復(fù)合體調(diào)控了病原菌的DON毒素合成、致病力和細(xì)胞自噬等。其中FgSit4和FgPpg1通過負(fù)調(diào)控FgMsg5調(diào)控了Mgv1信號途徑，另外FgPpg1還通過下游轉(zhuǎn)錄因子FgAreA、FGSG_09019和FGSG_09709調(diào)控了DON毒素合成和致病力。Liu等[33]發(fā)現(xiàn)TOR信號途徑通過FgSit4/FgPpg1支路，利用蛋白激酶FgCak1對蛋白磷酸酶FgNem1進(jìn)行磷酸化修飾。磷酸化的FgNem1與調(diào)節(jié)亞基FgSpo7形成復(fù)合體，進(jìn)而使磷脂酰磷酸酶FgPah1脫磷酸從而激活其催化活性，最終促進(jìn)三酰甘油和脂滴的合成。該研究表明TOR信號通路通過FgNem1/Spo7-FgPah1調(diào)控的脂滴合成，對禾谷鐮刀菌的生長發(fā)育和致病力具有重要作用。在釀酒酵母中，蛋白激酶Sch9是TORC1直接作用的下游元件，其激酶活性可被TORC1介導(dǎo)的磷酸化激活[34]。Fgsch9突變體在菌絲生長、分生孢子形態(tài)建成、DON毒素合成和致病力等方面存在顯著的缺陷。在禾谷鐮刀菌中，F(xiàn)gSch9不但與FgTor1激酶互作，而且還與FgHog1激酶互作[34]。Fgsch9突變體不但對雷帕霉素敏感，其對滲透壓、氧化脅迫和細(xì)胞壁脅迫也表現(xiàn)出較高敏感性[35]。因而，推測FgSch9可能介導(dǎo)了TOR與HOG信號途徑間的交流。

5 細(xì)胞周期相關(guān)蛋白激酶

細(xì)胞周期是一個受嚴(yán)密調(diào)控且有序發(fā)生的重要細(xì)胞事件，在細(xì)胞生長、分裂和分化過程中均扮演了重要的角色。細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶（CDK）是細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的核心，其與細(xì)胞周期蛋白（cyclin）形成CDK-cyclin復(fù)合體，推動細(xì)胞跨越各細(xì)胞周期檢測點(diǎn)完成細(xì)胞周期[36-37]。在CDK-cyclin復(fù)合體中，cyclin作為調(diào)節(jié)亞基可以將催化亞基CDK引導(dǎo)至特定的底物蛋白或亞細(xì)胞部位，增強(qiáng)其底物特異性[38]。在釀酒酵母中存在5個CDKs（Cdc28、Pho85、Kin28、Ssn3和Ctk1），而只有Cdc28在細(xì)胞周期各時期相轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮重要功能[36]。在裂殖酵母中Cdc28的同源基因?yàn)镃dc2，二者高度同源[39]，CDC28/CDC2基因的缺失均會導(dǎo)致酵母菌的死亡[40-41]。在釀酒酵母中，Cdc28可以與9個細(xì)胞周期蛋白分別結(jié)合以磷酸化不同的底物蛋白，從而介導(dǎo)不同的細(xì)胞信號對細(xì)胞周期的調(diào)控[42]。

5.1 細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶Cdc2A和Cdc2B

Liu等[43]發(fā)現(xiàn)與模式酵母和多數(shù)絲狀真菌不同，禾谷鐮刀菌具有兩個CDC2同源基因——CDC2A和CDC2B，并且在糞殼菌綱中僅串珠鐮刀菌、假禾谷鐮刀菌和腐皮鐮刀菌具有兩個CDC2同源基因。該研究發(fā)現(xiàn)CDC2A和CDC2B基因的單敲除均不影響營養(yǎng)生長，但是二者同時敲除卻是致死的，表明CDC2A和CDC2B均參與了禾谷鐮刀菌營養(yǎng)生長過程中細(xì)胞周期的調(diào)控且存在功能冗余。另外，CDC2A特異調(diào)控了禾谷鐮刀菌的侵染生長和有性發(fā)育過程，該基因的缺失導(dǎo)致病原菌致病力基本喪失以及有性生殖過程中子囊和子囊孢子發(fā)育出現(xiàn)嚴(yán)重缺陷。該研究還發(fā)現(xiàn)Cdc2A-GFP在營養(yǎng)菌絲、子囊孢子和侵染菌絲中均定位于細(xì)胞核中，且熒光信號在萌發(fā)菌絲和發(fā)育子囊孢子的細(xì)胞核內(nèi)顯著增強(qiáng)，但在上述細(xì)胞中卻檢測不到Cdc2B-GFP的熒光信號。表明Cdc2A和Cdc2B存在功能分化，而Cdc2A是植物侵染和有性生殖過程中發(fā)揮主效功能的CDK，然而二者功能分化的分子機(jī)制尚不清楚。該研究還證明N端和C端區(qū)域均是Cdc2A在植物侵染過程中發(fā)揮功能所必需的，而在有性生殖過程中其N端區(qū)域具有更重要的作用，另外N端區(qū)域也決定了Cdc2A的細(xì)胞核定位[43]。

在釀酒酵母中Cdc28的激活不僅需要與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合，而且需要CDK激活激酶Cak1對其T-loop中保守的蘇氨酸殘基進(jìn)行磷酸化[43]。在禾谷鐮刀菌中，F(xiàn)gCak1可以分別與Cdc2A和Cdc2B互作。與cdc2A和cdc2B突變體不同，F(xiàn)gcak1突變體不但在營養(yǎng)生長和無性生殖方面表現(xiàn)出嚴(yán)重缺陷，其在致病力和有性生殖上表現(xiàn)出更加嚴(yán)重的缺陷[43]。因而，推斷FgCak1可能同時參與了Cdc2A和Cdc2B激酶的激活。Jiang等[44]還發(fā)現(xiàn)禾谷鐮刀菌的Cdc2A和Cdc2B存在互作關(guān)系，推測二者可能在營養(yǎng)菌絲中形成同源和異源二聚體發(fā)揮功能。

5.2 細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶FgSsn3

在釀酒酵母中細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶Ssn3是介體復(fù)合物（mediator complex）中唯一的蛋白激酶組分，而介體復(fù)合物分別與基因特異的轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶Ⅱ互作，參與二者間的信息傳遞[45]。在釀酒酵母中Ssn3通過磷酸化RNA聚合酶Ⅱ的C端結(jié)構(gòu)域調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[46]。Cao等[47]在禾谷鐮刀菌中鑒定出了釀酒酵母Ssn3的同源蛋白FgSsn3。FgSSN3基因的缺失造成禾谷鐮刀菌在營養(yǎng)生長、無性（有性）生殖、DON合成和致病力等方面的嚴(yán)重缺陷。酵母雙雜交結(jié)果顯示FgSsn3可以與C型細(xì)胞周期蛋白Cid1互作，且cid1突變體表現(xiàn)出與Fgssn3突變體相似的表型[47-48]。另外，在Fgssn3突變體中分生孢子瓶梗形成相關(guān)基因HTF1和PCS1的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而一些DON合成相關(guān)基因TRI4、TRI5、TRI6、TRI10和TRI11則顯著下調(diào)[47]。表明在介體復(fù)合物中FgSsn3與Cid1互作形成的CDK-cyclin復(fù)合體調(diào)控了多個基因的表達(dá)，從而參與了禾谷鐮刀菌的營養(yǎng)生長、生殖生長和植物侵染等過程。

6 RNA剪接相關(guān)蛋白激酶

在多數(shù)真核生物中，前體mRNA由多個外顯子和內(nèi)含子間隔形成，其需通過剪接體將內(nèi)含子去除并將外顯子連接，才能變?yōu)槌墒斓膍RNA。剪 接 體 由5種snRNA（U1、U2、U4、U5和U6 snRNA）和100多個蛋白共同組成的一個高度復(fù)雜且動態(tài)變化的復(fù)合體[49]。剪接體是在前體mRNA上從頭開始組裝的，首先U1和U2 snRNP識別并結(jié)合至前體mRNA內(nèi)含子的5′剪接位點(diǎn)，形成A復(fù)合體。而A復(fù)合體會招募U4/U6-U5 snRNP三聯(lián)體，形成無催化活性的B復(fù)合物。隨后U1和U2 snRNP從該復(fù)合體上解離，此時前體mRNA與U2、U5和U6 snRNAs之間形成復(fù)雜的RNA-RNA互作網(wǎng)絡(luò)，B復(fù)合體才變?yōu)榫哂蠷NA剪接活性的形式。具有活性的RNA剪接體通過兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)將前體mRNA上的內(nèi)含子切除，同時U2、U5和U6 snRNP會從成熟的mRNA上解離，參與下一輪的RNA剪接過程[49]。

6.1 FgPrp4蛋白激酶

Prp4（pre-RNA processing 4）是第一個被發(fā)現(xiàn)對前體mRNA剪接具有調(diào)控作用的蛋白激酶。在裂殖酵母中，Prp4可以磷酸化剪接因子SR蛋白，進(jìn)而影響前體mRNA的剪接[50-51]。在人類和釀酒酵 母 中，Prp4與U4/U6-U5三 聯(lián) 體 中 的Prp6、Prp31、Brr2和Prp8蛋白互作[52]，通過磷酸化Prp31和Prp6來調(diào)控復(fù)合體B的組裝與激活[53]。

Gao等[54]報道在禾谷鐮刀菌中FgPrp4蛋白激酶調(diào)控了前體mRNA的剪接效率，該基因的缺失會導(dǎo)致病原菌在分生孢子形態(tài)、有性生殖和致病力等方面出現(xiàn)嚴(yán)重缺陷。Fgprp4突變體生長極其緩慢，而U4/U6-U5三聯(lián)體中FgPRP6、FgPRP31、FgBRR2和FgPRP8基因的自發(fā)突變能夠部分恢復(fù)Fgprp4突變體的生長缺陷[54]。進(jìn)一步的研究表明FgPrp31的C端和N端通過互作產(chǎn)生自抑制，而FgPRP31的自發(fā)突變與FgPrp4對FgPrp31的磷酸化修飾均能解除這種自抑制作用[55]。Sun[56]和Li[57]又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)Fgprp4突變體的自發(fā)突變也會發(fā)生在U4/U6-U5三聯(lián)體組分FgSNU66和FgSAD1基因上。FgSnu66蛋白C端區(qū)域參與了其同U4/U6-U5三聯(lián)體關(guān)鍵組分FgHub1和FgPrp8的互作，進(jìn)而調(diào)控了剪接體的激活[56]。而FgSAD1基因的自發(fā)點(diǎn)突變可增強(qiáng)U4/U6-U5三聯(lián)體的穩(wěn)定性以及FgSad1與U2 SnRNP的結(jié)合，從而促進(jìn)剪接體的組裝[57]。因而，F(xiàn)gPrp4可能通過磷酸化U4/U6-U5三聯(lián)體中的關(guān)鍵組分，來調(diào)控剪接體的活性。此外，還有研究顯示FgPrp4參與了對剪接因子SR蛋白FgSrp1的調(diào)控[58]。

6.2 Srk1蛋白激酶

SR蛋白是真核生物中一類重要的剪接因子，其調(diào)控了剪接體的組裝和剪接位點(diǎn)的識別，此外SR蛋白還參與了mRNA核外運(yùn)輸、蛋白翻譯以及無義介導(dǎo)的mRNA降解等過程[59-60]。SR蛋白的功能和亞細(xì)胞定位受到SR蛋白特異激酶（SR protein-specific kinases,SRPKs）的調(diào)控[61]。SRPKs具有一個保守的激酶結(jié)構(gòu)域，但是該激酶結(jié)構(gòu)域被一個不保守的間隔序列分成兩部分[62]。Wang等[63]發(fā)現(xiàn)SR蛋白特異激酶Srk1是禾谷鐮刀菌營養(yǎng)生長、有性生殖和植物侵染所必需的，并且調(diào)控了多個基因的可變剪接和轉(zhuǎn)錄水平。在菌絲生長過程中，Srk1激酶可以在核質(zhì)間穿梭，這一過程可能受到細(xì)胞周期的調(diào)控。Srk1激酶中的間隔序列參與了Srk1蛋白的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，間隔序列的缺失會導(dǎo)致Srk1只能滯留在細(xì)胞核中。該研究通過蛋白親和純化偶聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn),Srk1可以與多個剪接體組分互作，并進(jìn)一步驗(yàn)證了Srk1與SR蛋白FgNpl3和FgSrp1的互作關(guān)系，表明Srk1可能通過磷酸化SR蛋白來調(diào)控mRNA的剪接和基因的轉(zhuǎn)錄。此外，Srk1蛋白還會聚集在隔膜孔的位置，但是其具體功能尚不清楚[63]。

7 其他蛋白激酶

7.1 有性生殖階段特異性蛋白激酶Puk1

Puk1（perithecium unique kinase）是一個在禾谷鐮刀菌有性生殖過程中具有階段特異性表達(dá)和功能的蛋白激酶。Wang等[8]首先在禾谷鐮刀菌中鑒定到該基因（FGSG_01058），其在釀酒酵母和裂殖酵母中均無同源基因，但在絲狀真菌中則較為保守。Liu等[64]發(fā)現(xiàn)，PUK1基因只在禾谷鐮刀菌有性發(fā)育后期（有性生殖誘導(dǎo)8 d）特異上調(diào)表達(dá)，而在分生孢子和營養(yǎng)菌絲中無表達(dá)。PUK1基因的缺失僅導(dǎo)致禾谷鐮刀菌在有性生殖后期出現(xiàn)子囊孢子畸形且不能噴發(fā)的表型缺陷，而不影響營養(yǎng)生長、分生孢子形成和植物侵染等表型[8,64]。

有趣的是，在鑒定Puk1互作蛋白的過程中，意外地發(fā)現(xiàn)PUK1基因的核苷酸A1831和A1834在mRNA中變?yōu)镚1831和G1834，由此在真菌中首次發(fā)現(xiàn)了A→I RNA編輯現(xiàn)象[64]。進(jìn)一步研究顯示，這兩個RNA編輯位點(diǎn)位于PUK1激酶結(jié)構(gòu)域中的兩個串聯(lián)終止密碼子UA1831GUA1834G上，且在有性生殖后期90%的PUK1轉(zhuǎn)錄本中被編輯。A→I RNA編輯后形式的PUK1基因可以完全恢復(fù)puk1突變體的表型缺陷，而非編輯形式的PUK1則不能[64]。表明A→I RNA編輯做為一種重要的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，在禾谷鐮刀菌的有性生殖時期調(diào)控了Puk1蛋白激酶的功能。除PUK1基因外，F(xiàn)GSG_04770和FGSG_05406也是階段特異性蛋白激酶，二者分別只在植物侵染和分生孢子形成時期發(fā)揮功能[8]，但作用機(jī)制尚不清楚。

7.2 Kin1蛋白激酶

Kin1同源蛋白屬于微管親和調(diào)控蛋白激酶（microtubule affinity-regulating protein kinases，MARKs）家族，該激酶家族參與了細(xì)胞極化、細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移和分化、信號傳導(dǎo)等過程[65]。釀酒酵母具有兩個MARK基因KIN1和KIN2，二者編碼的蛋白激酶通過磷酸化Sec9調(diào)控囊泡運(yùn)輸和蛋白分泌[66]。在裂殖酵母中，Kin1參與了形態(tài)建成、雙極生長、胞質(zhì)分裂和細(xì)胞壁完整性等[67]，而在新型隱球菌中Kin1是一個重要的毒力因子[68]。Luo等[69]在禾谷鐮刀菌中鑒定出FgKin1并進(jìn)行了深入研究，這在植物病原真菌中尚屬首次。Fgkin1敲除突變體在致病力、無性（有性）生殖以及脅迫應(yīng)答等方面均存在嚴(yán)重缺陷，另外FgKIN1基因的缺失還改變了β微管蛋白Tub1的亞細(xì)胞定位。FgKin1定位于分生孢子和菌絲的隔膜孔處，該定位模式與FgKin1的激酶活性無關(guān)。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)FgKin1在有性生殖過程中的功能也不依賴于其激酶活性。

7.3 糖原合成酶激酶Fgk3

糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase，GSK3）是一種獨(dú)特的蛋白激酶，具有保守的蛋白結(jié)構(gòu)，在真核生物中介導(dǎo)了多條信號通路[70]。該激酶最早在兔子胰島素信號途徑的研究中被發(fā)現(xiàn)，其通過磷酸化糖原合成酶抑制其糖原合成活性。越來越多的文獻(xiàn)報道Gsk3可以磷酸化結(jié)構(gòu)蛋白、信號蛋白和轉(zhuǎn)錄因子等多種靶蛋白，進(jìn)而調(diào)控多個細(xì)胞事件[71]。在釀酒酵母中，鑒定到了4個Gsk3的 同 源 蛋 白（Mck1、Rim11、Mrk1和Ygk3），其中Mck1不但參與了脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子Msn2的激活，也參與了細(xì)胞周期的調(diào)控。

Qin等[72]在禾谷鐮刀菌中只鑒定到1個Gsk3的同源蛋白Fgk3，發(fā)現(xiàn)FGK3基因的缺失會導(dǎo)致病原菌生長緩慢、分生孢子畸形、不能形成子囊殼、DON合成和致病力喪失等表型缺陷。fgk3突變體中糖原積累增加，表明Fgk3對糖原合成酶的活性具有抑制作用。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)FGK3的轉(zhuǎn)錄水平在低溫、H2O2和SDS脅迫條件下顯著上調(diào)，而FGK3基因的缺失會導(dǎo)致FgGRE2、FgGPD1、FgCTT1和FgMSN2等基因無法對冷、熱和鹽脅迫產(chǎn)生應(yīng)答[72]。因而，F(xiàn)gk3可能通過調(diào)控糖原代謝、脅迫應(yīng)答等參與了禾谷鐮刀菌的生長發(fā)育、DON毒素合成和植物侵染等過程。

7.4 丙酮酸脫氫酶激酶FgPdk1

丙酮酸是糖酵解的最終產(chǎn)物，其通過丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）的脫羧作用生成重要的活性物質(zhì)乙酰輔酶A。丙酮酸脫氫酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK）是一種重要的線粒體酶，通過磷酸化修飾選擇性抑制PDH的活性，減少乙酰輔酶A的生成，同時影響葡萄糖的氧化過程[73]。2016年，Gao等[74]在禾谷鐮刀菌中鑒定到1個PDK基因FgPDK1，發(fā)現(xiàn)該基因的缺失導(dǎo)致PDH活性增強(qiáng)、生長遲緩、不能產(chǎn)生分生孢子和子囊殼、DON合成下降以及致病力喪失等。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)Fgpdk1突變體對高滲脅迫和細(xì)胞膜脅迫的敏感性增強(qiáng)，且細(xì)胞中出現(xiàn)活性氧的積累和細(xì)胞質(zhì)膜的損傷。

8 展望

禾谷鐮刀菌蛋白激酶的研究相對于酵母菌起步較晚，大多數(shù)研究集中在PKA、MAPKs、Cdc2A/B、FgTor和FgPrp4等少數(shù)蛋白激酶上。迄今為止，雖然研究人員已經(jīng)從禾谷鐮刀菌中鑒定到大量的蛋白激酶基因，但是多數(shù)只是停留在對敲除突變體基本表型的描述上，而缺乏作用機(jī)制的深入探究。未來應(yīng)聚焦于蛋白激酶活性調(diào)控機(jī)制、底物蛋白鑒定、不同激酶間以及激酶與其他信號途徑間互作關(guān)系的研究上。此外，在禾谷鐮刀菌中還存在20個無法被敲除的蛋白激酶基因，未來可以利用基因沉默、條件性基因敲除以及基因點(diǎn)突變等策略明確其生物學(xué)功能。鑒于小麥赤霉病抗病材料和抗病基因的匱乏，從正向遺傳學(xué)角度挖掘小麥赤霉病抗病基因并用于育種，面臨著巨大的瓶頸。而寄主誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)是一種新興的抗病育種策略，通過靶向沉默病原菌的關(guān)鍵基因提高植物的抗病性，為小麥赤霉病的防治提供了新的思路。相信隨著研究的不斷深入，禾谷鐮刀菌蛋白激酶在生長發(fā)育和植物侵染等過程中的功能和作用機(jī)制將被進(jìn)一步揭示。在此基礎(chǔ)上，我們可選擇在禾谷鐮刀菌生長發(fā)育和致病過程具有關(guān)鍵作用的蛋白激酶為候選靶基因，利用Gateway技術(shù)將靶基因的特異區(qū)段克隆到HIGS載體上。再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)將構(gòu)建好的HIGS載體導(dǎo)入到小麥中，進(jìn)而創(chuàng)制持久抗小麥赤霉病的轉(zhuǎn)基因材料。此外，這些關(guān)鍵的蛋白激酶基因亦可以作為候選靶標(biāo)用于綠色殺菌劑的研發(fā)。