周 軼，王英媛

哮喘是一種常見慢性呼吸道疾病，影響各年齡段人群的健康，是世界性的醫(yī)學(xué)難題。哮喘的特征是喘息、胸悶、氣短和咳嗽以及可逆性發(fā)作[1]。全球哮喘病人已多達(dá)3億左右，在我國(guó)哮喘的發(fā)生率呈快速上升的趨勢(shì)[2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)哮喘病人在3 000萬以上，兒童期病人大約占其中的一半，哮喘嚴(yán)重危害了兒童的身體健康。哮喘的病變過程有多種細(xì)胞參與，如嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等，而Th1/Th2的失衡是哮喘慢性氣道炎癥發(fā)病的重要病理機(jī)制之一[3]。白細(xì)胞介素-4(IL-4)是Ⅱ型輔助T細(xì)胞(Th2)、嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞分泌的特征性細(xì)胞因子之一，在大多數(shù)哮喘病人中，Th2相關(guān)細(xì)胞因子如IL-4、IL-5和IL-13的水平非常高。而 Th2相關(guān)細(xì)胞因子受GATA 結(jié)合蛋白3(GATA-3)的調(diào)節(jié)。有研究[4]表明，GATA-3能促使正在分化或已分化的Th細(xì)胞合成Th2細(xì)胞因子，導(dǎo)致Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答，進(jìn)而調(diào)控釋放如IL-4促炎因子，加重氣道炎癥反應(yīng)。

山茶油從山茶科油茶樹種子中獲得，其中油酸含量80%以上。近年來的研究[5-6]表明，山茶油具有改善心腦血管疾病、抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖與遷移、抗氧化、抗?jié)兊壬锘钚?。此外，有?bào)道[7-9]指出，山茶油的主要成分油酸和共軛亞油酸等不飽和脂肪酸可通過清除自由基，緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減緩多種物質(zhì)引起的中毒反應(yīng)。而關(guān)于山茶油在哮喘方面的作用研究尚鮮有報(bào)道。本研究觀察山茶油對(duì)哮喘患兒的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-4分泌和GATA-3表達(dá)的影響，探討山茶油在哮喘中的作用，以期為治療哮喘的天然產(chǎn)品藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年5-12月我院兒科收治的28例未治療的過敏性哮喘患兒，其中男18例，女10例，年齡3～8歲?；純旱南\斷符合國(guó)際哮喘指南[10]。所有研究對(duì)象的監(jiān)護(hù)人簽訂知情同意書，本研究獲得本院倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 主要試劑 山茶油購(gòu)自江西瑞金生物科技有限公司，L-谷氨酰胺、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、青霉素、鏈霉素和β-巰基乙醇購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，RPMI-1640培養(yǎng)基和二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，兔抗人 GATA3 多克隆抗體、兔抗人 GAPDH 多克隆抗體和山羊抗兔 IgG抗體購(gòu)于美國(guó)Millipore公司，Trizol試劑盒、Prime ScriptTMRT試劑盒和TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 PBMCs的分離與培養(yǎng) 從未接受任何治療的過敏性哮喘患兒靜脈采血5 mL，獲得肝素化血液，采用密度梯度離心法分離 PBMCs。操作步驟：在肝素化血液中注入肝素溶液(每1 mL 全血加0.1 mL 125～250 U/mL 肝素溶液)，使血液抗凝；加入等體積的HBSS 稀釋血液，將稀釋血液緩慢加至淋巴細(xì)胞分離液上面(每10 mL 稀釋血加5 mL分層液)；以2 000 r/min 在室溫下離心20 min；去除上層液體，將所得到的 PBMCs懸液用 5倍體積的 HBSS 洗滌2次，依次以 2 000 r/min、1 500 r/min在室溫下離心10 min，棄上清液；將細(xì)胞重新懸浮于RPMI-1640培養(yǎng)基中，補(bǔ)充有10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、10 mmol/L HEPES、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素和5.78×10-5mol/L β-巰基乙醇。

1.3.2 山茶油處理PBMCs 將PBMCs濃度調(diào)整為1×106個(gè)/毫升，取100 μL接種于24孔板內(nèi)。對(duì)照組細(xì)胞不用山茶油處理(即濃度為0 μmol/L)，只加入RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；DMSO組細(xì)胞使用含0.5% DMSO的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入山茶油：將1 mg山茶油用含0.5% DMSO的RPMI-1640培養(yǎng)基充分溶解，隨后稀釋為不同濃度(10、50、100、200 μmol/L)作用于 PBMCs，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 MTT法檢測(cè)PBMCs活力 取各處理組的PBMCs，去除培養(yǎng)基，用PBS洗滌1次，每孔加入20 μL用無血清培養(yǎng)基稀釋的0.5%MTT混合均勻，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩至結(jié)晶物完全溶解，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD570nm。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 ELISA檢測(cè)PBMCs培養(yǎng)液上清液中IL-4水平 收集各處理組的PBMCs培養(yǎng)液，用ELISA法檢測(cè)IL-4分泌的水平。將待測(cè)樣品加入 96 孔板內(nèi)，在37℃下孵育2 h，去除板內(nèi)液體，PBS洗滌4～6次，用濾紙印干；每孔加入一抗工作液，37 ℃孵育1 h，去除板內(nèi)液體，再次洗滌4～6次后濾紙印干；每孔加羊抗兔IgG工作液，置 37 ℃孵育1 h，洗板4～6次后印干；每孔加入底物工作液，置 37 ℃暗處反應(yīng)10 min，加入終止液，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD490nm。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PBMCs中IL-4 mRNA和GATA-3 mRNA的表達(dá) 按Trizol試劑盒說明書提取各處理組PBMCs總RNA，按Prime ScriptTMRT試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以人 GAPDH為內(nèi)參基因，通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)IL-4 mRNA和GATA-3 mRNA表達(dá)。IL-4上游引物為：5′-ACA GGA GAA GGG ACG CCA T-3′，IL-4下游引物為：5′-GAA GCC CTA CAG ACG AGC TCA-3′；GATA-3 上游引物為：5′-GAGA TGG CAC GGG ACA CTA C-3′，下游引物為：5′-GCC TTC GCT TGG GCT TAA TG-3′；GAPDH上游引物為：5′-GGT GTG AAC CAT GAG AAG TAT GAC A-3′，下游引物為：5′-GTC CTT CCA CGA TAC AAA GTT GT-3′。按照TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ試劑盒說明書操作，反應(yīng)體系為：上游引物1 μL、下游引物1 μL、cDNA 2 μL、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL、無酶水8.5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min、95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA表達(dá)水平。

1.3.6 Western blotting法檢測(cè)PBMCs中 GATA-3蛋白水平 使用 RIPA 裂解液抽提各組PBMCs總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白，切膠并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉4 h。分別加兔抗人 GATA3 多克隆抗體(1∶300)、兔抗人 GAPDH 多克隆抗體(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG(1∶5 000)，室溫孵育 2 h；采用 ECL發(fā)光顯影，使用Image-Pro Plus 6.0分析蛋白質(zhì)灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 山油茶對(duì) PBMCs活力的影響 DMSO組細(xì)胞存活率與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組比較，10、50、100 μmol/L山茶油對(duì)PBMCs活力無明顯影響(P>0.05)，200 μmol/L山茶油能明顯降低PBMCs活力(P<0.01)(見表1)。

表1 山茶油對(duì)PBMCs存活率的影響

2.2 山油茶對(duì) PBMCs上清中IL-4水平的影響 PBMCs IL-4分泌水平呈現(xiàn)先下降后略有上升的趨勢(shì)。與對(duì)照組比較，不同濃度山茶油處理PBMCs后，IL-4分泌水平均明顯降低(P<0.01)；當(dāng)山茶油濃度為50 μmol/L時(shí)，IL-4分泌水平最低(P<0.01)(見表2)。

表2 山茶油對(duì)PBMCs分泌IL-4的影響

2.3 山油茶對(duì) PBMCs 中GATA-3 mRNA和IL-4 mRNA表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組比較，10、50、100、200 μmol/L山茶油處理PBMCs后，GATA-3 mRNA和IL-4 mRNA的表達(dá)均被明顯抑制(P<0.05)，在50 μmol/L處理后，GATA-3 與IL-4 的mRNA表達(dá)量最低(P<0.05)(見表3)。

表3 山茶油對(duì)PBMCs中GATA-3、IL-4 mRNA表達(dá)的影響

2.4 山油茶對(duì) PBMCs中 GATA3 蛋白水平的影響 與對(duì)照組比較，10、50、100、200 μmol/L山油茶處理PBMCs后GATA-3蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)，當(dāng)山茶油濃度為10 μmol/L時(shí)，GATA-3蛋白的表達(dá)量達(dá)到最低水平(P<0.05)(見圖1、表4)。

表4 山茶油對(duì)PBMCs中GATA-3蛋白表達(dá)的影響

3 討論

哮喘是較常見的兒科慢性疾病，目前國(guó)內(nèi)外醫(yī)療水平雖有了很大進(jìn)步，但兒童哮喘發(fā)病率仍呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，其發(fā)病機(jī)制也一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[10]。在哮喘治療過程中，有的藥物會(huì)引起一些不良反應(yīng)，如眼部問題、胃潰瘍、血壓升高以及中毒等[11-12]。因此，近年來從天然產(chǎn)品開發(fā)安全有效的抗哮喘藥物的相關(guān)研究也在不斷增加。

已有研究[13]結(jié)果顯示，由哮喘導(dǎo)致的呼吸道炎癥等一系列異?，F(xiàn)象的發(fā)生可能與輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)反應(yīng)失衡相關(guān)。Th細(xì)胞可分為Th1細(xì)胞和Th2 細(xì)胞兩個(gè)亞型，Th1/Th2 細(xì)胞的失衡參與包括支氣管哮喘等多種免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展[14]。其中，Th2細(xì)胞分泌以 IL-4和IL-10為代表的細(xì)胞因子，參與介導(dǎo)體液免疫。本研究發(fā)現(xiàn)，采用不同濃度山茶油處理PBMCs后，細(xì)胞上清液中IL-4的分泌水平均低于對(duì)照組，說明山茶油可以抑制PBMCs中IL-4的分泌，以50 μmol/L山茶油處理下IL-4的分泌水平達(dá)到最低。而通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，同樣在50 μmol/L山茶油處理的PBMCs中，IL-4mRNA的表達(dá)水平最低，提示山茶油抑制PBMCs分泌IL-4的最佳濃度為50 μmol/L。

GATA-3在內(nèi)皮細(xì)胞、腎細(xì)胞和神經(jīng)組織中表達(dá)，而表達(dá)GATA-3的唯一造血細(xì)胞是Τ譜系細(xì)胞，因此，該轉(zhuǎn)錄因子是T細(xì)胞發(fā)育中關(guān)鍵參與者的候選者[4]。同時(shí)，GATA-3 是 Th2 細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，使 Th2細(xì)胞具有產(chǎn)生 IL-4、IL-13 和 IL-5 的能力[15]，有研究[16]表明哮喘病人的呼吸道或者 PBMCs中 GATA-3 的表達(dá)增加。余圓圓等[17]通過檢測(cè)哮喘病人PBMCs中ANP、IL-4 含量及 GATA-3 的mRNA 與蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示檢測(cè)指標(biāo)較正常組均明顯升高。本研究中，未使用山茶油處理的PBMCs中，GATA-3 mRNA的表達(dá)量較高，而使用不同濃度山茶油處理后的PBMCs中GATA-3 mRNA的表達(dá)水平均下降； Western blotting結(jié)果同樣顯示，不同濃度山油茶處理PBMCs后GATA-3蛋白表達(dá)也均降低；10 μmol/L山茶油處理下，GATA-3 mRNA和蛋白的表達(dá)均為最低水平。

綜上所述，山茶油能明顯抑制PBMCs中GATA-3表達(dá)及IL-4分泌的水平，可能有助于哮喘患兒的治療。但是，山茶油的應(yīng)用濃度不宜過高(<200 μmol/L)，高濃度下PBMCs的活性可能會(huì)受到影響。此外，參與此過程的信號(hào)通路有待明確，而山茶油在患兒哮喘治療方面具體的臨床運(yùn)用方式尚且需要進(jìn)一步探索。