曾小艷童麗李永平#

（1青海大學(xué)2019級(jí)碩士研究生 西寧810016；2青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院 西寧810099）

2019年12月我國(guó)湖北省武漢市報(bào)道多例由新型冠狀病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-COV-2）感染引起的新型冠狀病肺炎（簡(jiǎn)稱新冠肺炎，WHO正式命名為Coronavirus Disease 2019,COVID-19）。在我國(guó)抗擊新冠肺炎疫情中，中醫(yī)藥發(fā)揮了重要作用，國(guó)家中醫(yī)藥管理局及國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)推薦使用清肺排毒湯[1]。射干麻黃湯是清肺排毒湯的重要組成部分，射干麻黃湯在新冠肺炎治療中發(fā)揮了宣降肺氣、溫肺化飲的作用，對(duì)新冠肺炎所致的咳喘發(fā)揮了重要作用。射干麻黃湯出自《金匱要略》，射干麻黃湯中射干-麻黃共為君藥，射干性味苦、寒，具有化痰止咳的功效；麻黃性味溫、辛、微苦，具有發(fā)汗解表、宣肺平喘的功效[2]。在臨床中，射干與麻黃用于治療咳喘病癥時(shí)常配對(duì)使用。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，射干具有抗氧化、抗炎等藥理作用[3]，麻黃具有抗氧化、平喘鎮(zhèn)咳等藥理作用。本研究對(duì)射干-麻黃治療COVID-19的有效活性成分、作用靶點(diǎn)、作用途徑進(jìn)行分析?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 分析方法

1.1 射干-麻黃活性成分及靶點(diǎn)篩選 在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP）中檢索射干、麻黃，收集其化學(xué)成分以及靶點(diǎn)信息，設(shè)定成分篩選條件為OB≥30%，DL≥0.18，對(duì)所有成分進(jìn)行篩選，篩選出射干、麻黃的活性成分及作用靶點(diǎn)。

1.2 COVID-19靶點(diǎn)篩選 以“Novel Coronavirus”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、在線人類孟德?tīng)栠z傳病數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM）和美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）基因數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，篩選出疾病的靶點(diǎn)。

1.3 射干-麻黃治療COVID-19靶點(diǎn)的篩選 將射干、麻黃和新冠肺炎的靶點(diǎn)分別導(dǎo)入生物信息學(xué)與進(jìn)化基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（Bioinformatics&Evolutionary Genomics）中，篩選出射干-麻黃作用于疾病的靶點(diǎn)，用于下面的通路富集分析。

1.4 射干-麻黃治療COVID-19的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 將射干-麻黃及COVID-19的共有靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscap3.7.2中，通過(guò)NetworkAnalyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治?，以Degree、betweenness centrality、Average shortest path length和Closeness centrality這四個(gè)參數(shù)為參考標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)Degree排序，選取分值大于平均分的基因作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，篩選出排名前20的靶點(diǎn)。

1.5 中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 應(yīng)用Cytoscape3.7.2軟件，以納入的射干-麻黃、對(duì)應(yīng)的活性成分、COVID-19及作用靶點(diǎn)為基礎(chǔ)，構(gòu)建中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，以篩選出核心活性成分。

1.6 GO富集分析 將射干-麻黃及COVID-19的共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO的生物過(guò)程（Biological Process,BP）、分子功能（Molecular Function,MF）、細(xì)胞組分（Cell Component,CC）富集，引用String數(shù)據(jù)庫(kù)，將校正P值≤0.05的項(xiàng)目進(jìn)行篩選，并用R3.6.3繪制柱狀圖及氣泡圖。

1.7 KEGG通路富集 將射干-麻黃及COVID-19共有靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，引用String數(shù)據(jù)庫(kù)，將校正P值≤0.05的項(xiàng)目進(jìn)行篩選，并篩選排名靠前的20條KEGG通路，應(yīng)用R3.6.3繪制柱狀圖及氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 射干-麻黃活性成分及靶點(diǎn)篩選結(jié)果 麻黃篩選得到23個(gè)有效活性成分和治療COVID-19的210個(gè)靶點(diǎn)；射干篩選獲得到17個(gè)活性成分和治療COVID-19的96個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 COVID-19靶點(diǎn)基因篩選結(jié)果 經(jīng)過(guò)檢索，在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到2個(gè)疾病相關(guān)基因，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到350條相關(guān)基因，NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)到51個(gè)基因，將這3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的基因合并刪重之后，得到356個(gè)新型冠狀病毒肺炎相關(guān)基因。

2.3 射干-麻黃治療COVID-19靶點(diǎn)篩選結(jié)果 將射干、麻黃和新冠肺炎的靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Bioinformatics和Evolutionary Genomics數(shù)據(jù)庫(kù)中，篩選出射干-麻黃作用于疾病的靶點(diǎn)，治療COVID-19的靶點(diǎn)有48個(gè)，用于下面的通路富集分析。同時(shí)將射干-麻黃的靶點(diǎn)和疾病的靶點(diǎn)共同輸入Venny2.1.0繪制韋恩圖。見(jiàn)圖1。

圖1 射干-麻黃治療新冠肺炎靶點(diǎn)圖

2.4 射干-麻黃治療COVID-19的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選結(jié)果 將藥物疾病共有靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscap3.7.2中，通過(guò)NetworkAnalyzer工具進(jìn)行拓 撲 分 析，以Degree、Betweenness centrality、Average shortest path length和Closeness centrality這四個(gè)參數(shù)為參考標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)degree排序，選取分值大于平均分的基因作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，總共篩選出27個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，將前20個(gè)靶點(diǎn)使用R3.6.3進(jìn)行圖片繪制。見(jiàn)圖2、圖3。從圖2、圖3中可以看出，射干-麻黃作用COVID-19的靶點(diǎn)蛋白主要有白細(xì)胞介素-6（IL-6）、CASP3、絲 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶3（MAPK3）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、趨化因子2（CCL2）等蛋白。

圖2 射干-麻黃治療COVID-19的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 射干-麻黃治療COVID-19的前20個(gè)靶點(diǎn)蛋白

2.5 中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 應(yīng)用Cytoscape3.7.2軟件，以納入的射干-麻黃、對(duì)應(yīng)的活性成分、COVID-19及作用靶點(diǎn)為基礎(chǔ)，構(gòu)建中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。以篩選出核心活性成分（77個(gè)節(jié)點(diǎn)，266條邊）。網(wǎng)絡(luò)圖中疾病及藥物成分的Degree值為：COVID-19為48、鼠李素41、異鼠李素29、射干10、麻黃18。網(wǎng)絡(luò)圖中各節(jié)點(diǎn)之間相連線路的數(shù)目為degree，該值越高說(shuō)明該活性成分在射干-麻黃中起著越重要的作用，表明射干-麻黃治療COVID-19的主要活性成分可能為鼠李黃素41、異鼠李素29等。通過(guò)對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖的分析，可以推斷出射干-麻黃中的活性成分可作用整個(gè)生物網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，表明射干-麻黃通過(guò)多靶點(diǎn)治療COVID-19。見(jiàn)圖4。

圖4 中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO富集分析 應(yīng)用R語(yǔ)言進(jìn)行GO的生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞組分富集，引用String數(shù)據(jù)庫(kù)，將校正P值≤0.05的項(xiàng)目進(jìn)行篩選，并繪制柱狀圖?？梢钥闯觯涓?麻黃中的有效成分主要通過(guò)對(duì)脂多糖反應(yīng)、細(xì)菌源分子反應(yīng)，細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)細(xì)菌源分子反應(yīng)等生物過(guò)程作用于COVID-19。見(jiàn)圖5。

圖5 GO富集分析柱狀圖

2.7 KEGG通路富集 將藥物疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，引用String數(shù)據(jù)庫(kù)，將校正P值≤0.05的項(xiàng)目進(jìn)行篩選，總共富集到150條信號(hào)通路，使用R3.6.3進(jìn)行氣泡圖繪制。見(jiàn)圖6。隨著節(jié)點(diǎn)由小增大，節(jié)點(diǎn)富集到的靶點(diǎn)數(shù)量也逐漸增多，P值逐漸減小。從圖6中可以看出富集靶點(diǎn)較多的通路有糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、恰加斯?。绹?guó)錐蟲(chóng)病）、利什曼病等通路。

圖6 KEGG通路富集柱狀圖

3 討論

在我國(guó)抗擊新冠肺炎疫情中，中醫(yī)藥發(fā)揮了重要作用。新冠肺炎歸屬于中醫(yī)學(xué)“疫病”范疇，又稱瘟疫、疫癘，主要致病因素是“濕、毒”，濕毒化為濕熱可引起咽喉腫痛、咳嗽、咳痰，針對(duì)咳嗽、咳痰、咽痛等癥，清肺排毒湯中特意用到了射干、麻黃。

本研究通過(guò)篩選麻黃，得到23個(gè)有效活性成分和210個(gè)靶點(diǎn)，射干篩選獲得17個(gè)活性成分和96靶點(diǎn)。將兩者共有靶點(diǎn)刪除去重后，總共篩選出218個(gè)藥物靶點(diǎn)。其中治療COVID-19的主要活性成分為鼠李黃素41、異鼠李素29。據(jù)研究報(bào)道，鼠李黃素具有很好的抗炎作用及抗氧化作用，可以很好地預(yù)防肺部炎癥[4～6]，異鼠李素可通過(guò)抑制細(xì)胞炎癥因子IL-6、TNF-α、MCP-1的釋放而發(fā)揮抗炎作用，同時(shí)異鼠李素具有調(diào)節(jié)免疫的作用[7]。

在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選中，射干-麻黃作用COVID-19的靶點(diǎn)蛋白主要有IL-6、CASP3、MAPK3等靶點(diǎn)蛋白。Go富集分析中，射干-麻黃治療COVID-19的生物過(guò)程中起關(guān)鍵作用的主要有對(duì)脂多糖反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌源分子反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)細(xì)菌源分子反應(yīng)等。有研究顯示[8～9]，脂多糖可通過(guò)活化炎性細(xì)胞釋放出大量的炎性因子，從而引起肺部的炎癥。通過(guò)KEGG通路富集可看出，射干-麻黃的靶點(diǎn)蛋白主要通過(guò)糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、恰加斯?。绹?guó)錐蟲(chóng)?。?、利什曼病等信號(hào)通路作用于COVID-19；AGEs-RAGE信號(hào)通路可通過(guò)激活NF-κB促進(jìn)大量促炎細(xì)胞因子（如IL-6、IL-8）等的釋放，導(dǎo)致細(xì)胞和組織的炎癥損傷[10]。

綜上所述，射干-麻黃中的鼠李黃素、異鼠李素成分在治療COVID-19中起主要作用。射干-麻黃治療COVID-19的主要靶點(diǎn)蛋白是IL-6、CASP3、MAPK3、MAPK8、IL-10、CCL2等。射干-麻黃中的有效成分主要通過(guò)對(duì)脂多糖反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌源分子反應(yīng)，細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)細(xì)菌源分子反應(yīng)等生物過(guò)程作用于COVID-19。射干-麻黃治療COVID-19的主要信號(hào)通路有AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、恰加斯?。绹?guó)錐蟲(chóng)?。⒗猜〉?。說(shuō)明射干-麻黃治療COVID-19有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究具有局限性，還需要后期進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及從分子層面進(jìn)行驗(yàn)證，為射干-麻黃的開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。