陳美霞 陳沖沖 文 芳 張養(yǎng)東 鄭 楠 王加啟*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶及奶制品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(北京)，北京100193；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(北京)，北京 100193；4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193)

糠氨酸，即ε-N-2-呋喃甲基-L-賴氨酸，又名呋喃素，是美拉德反應(yīng)的系列產(chǎn)物之一。糠氨酸的含量可以直接反映牛奶在加工過(guò)程中所經(jīng)歷的熱處理強(qiáng)度，一般而言，牛奶所經(jīng)歷的熱處理強(qiáng)度越強(qiáng)(加熱時(shí)間越長(zhǎng)或加熱溫度越高)，糠氨酸含量越高；此外，儲(chǔ)存過(guò)程中糠氨酸含量也規(guī)律性增加[1]。因此，國(guó)內(nèi)外常用糠氨酸含量的變化來(lái)評(píng)價(jià)牛奶加工方式或儲(chǔ)存方式對(duì)奶制品質(zhì)量的影響[2-3]。我國(guó)已經(jīng)將糠氨酸和乳果糖含量聯(lián)合用于巴氏殺菌乳和超高溫(UHT)滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定[4]。一系列研究發(fā)現(xiàn)，糠氨酸可以抑制HepG2和Hek293細(xì)胞體外生長(zhǎng)活力[5-6]，小鼠體內(nèi)試驗(yàn)證明糠氨酸具有肝臟毒性和腎臟毒性[7]，并可以影響睪丸指數(shù)、血清激素表達(dá)水平和精子質(zhì)量，并對(duì)睪丸組織造成病理?yè)p害[8]。因此，準(zhǔn)確地、定量地檢測(cè)乳制品中糠氨酸含量對(duì)于科學(xué)研究和乳制品質(zhì)量監(jiān)管具有重要意義。

目前，糠氨酸含量的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜(HPLC)法[9-10]、超高效液相色譜(UPLC)法[11]、超高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)(UPLC-MS/MS)法[12]、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜串聯(lián)(CE-MS/MS)法[13]、穩(wěn)定同位素稀釋-質(zhì)譜聯(lián)用法[14]和表面熒光光譜法[15]等。表面熒光光譜法因其靈敏度較低，一般用于半定量分析，因此應(yīng)用范圍有限。CE-MS/MS法雖然分離度較高，但前處理復(fù)雜，不適用于大批量樣品檢測(cè)。UPLC-MS/MS法因儀器昂貴、維護(hù)成本高，需要專門人員進(jìn)行操作，也限制了其在實(shí)際中的應(yīng)用。目前，對(duì)于液態(tài)奶中糠氨酸含量的檢測(cè)，國(guó)際上主要參照ISO18329中的HPLC法[10]，國(guó)內(nèi)主要參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 939—2016中的HPLC法或UPLC法[4]。盡管國(guó)內(nèi)外對(duì)糠氨酸含量的檢測(cè)做了大量的研究，但對(duì)該物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性的研究未見報(bào)道。了解標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)的穩(wěn)定性，有助于使定量分析過(guò)程準(zhǔn)確可靠，對(duì)樣品檢測(cè)具有十分重要的意義。陳永艷等[16]對(duì)抗生素類標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示不同溶劑和溫度條件對(duì)抗生素穩(wěn)定性的影響程度不同。周鑫等[17]研究了以甲醇為溶劑介質(zhì)的氯氰菊酯和氟胺氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間跨度和復(fù)雜的溫度條件會(huì)增加氯氰菊酯和氟胺氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定的風(fēng)險(xiǎn)。因此，研究糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性對(duì)于乳及乳制品中糠氨酸定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性以及乳制品質(zhì)量控制具有重要意義。此外，在參照NY/T 939—2016中規(guī)定的HPLC法或UPLC法[4]對(duì)牛奶中糠氨酸含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，使用不同批次或不同品牌鹽酸水解相同牛奶時(shí)結(jié)果有時(shí)存在差異。Guerra-Hernandez等[18]在檢測(cè)嬰兒米粉中糠氨酸含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)增加水解米粉時(shí)所用鹽酸濃度會(huì)提高糠氨酸含量的檢測(cè)值。而在參照NY/T 939—2016中規(guī)定的HPLC法或UPLC法[4]對(duì)牛奶中糠氨酸含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)使用不同批次或不同品牌鹽酸水解相同牛奶時(shí)結(jié)果有時(shí)存在差異，因此，推測(cè)不同濃度鹽酸水解牛奶影響牛奶中糠氨酸的檢測(cè)結(jié)果。因此，本試驗(yàn)研究了不同方式配制的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同儲(chǔ)存環(huán)境中的穩(wěn)定性，以期為糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液保存和檢測(cè)結(jié)果的可靠性提供一定的依據(jù)；同時(shí)，本試驗(yàn)還研究了使用不同濃度鹽酸水解牛奶對(duì)糠氨酸檢測(cè)結(jié)果的影響，以期為更準(zhǔn)確地定量檢測(cè)乳及乳制品中糠氨酸含量提供科學(xué)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液(500 mg/L)配制：將糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品按標(biāo)準(zhǔn)品證書提供的肽純度系數(shù)換算后，用3 mol/L鹽酸配制成標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，-20 ℃下可貯存24個(gè)月。

糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：移取2 mL糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液于10 mL容量瓶中，用3 mol/L鹽酸定容，此標(biāo)準(zhǔn)中間溶液濃度為100 mg/L。

糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：移取100 μL糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液于25 mL容量瓶中，用3 mol/L鹽酸液定容，此標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為2.0 mg/L。依上述方法分別配制0.05、0.10、0.50、1.00、2.00和5.00 mg/L的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)存穩(wěn)定性研究

為了研究糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同溫度和不同鹽酸濃度條件下的穩(wěn)定性，本試驗(yàn)分別用3個(gè)濃度的鹽酸(3.0、1.0和0.1 mol/L)配制不同濃度的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(1和5 mg/L)，并保存于不同溫度[-20、4 ℃和室溫(25 ℃)]條件下，分別于第1、3、5、8、10、12、14、15、17和21天對(duì)保存的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行糠氨酸含量檢測(cè)。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行。

1.3 不同濃度鹽酸水解牛奶對(duì)糠氨酸檢測(cè)結(jié)果的影響

試驗(yàn)設(shè)置11種不同濃度的鹽酸水解牛奶，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行，分析鹽酸濃度對(duì)牛奶中糠氨酸檢測(cè)結(jié)果的影響。鹽酸濃度用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液進(jìn)行標(biāo)定，試樣溶液以溴甲酚綠為指示液，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至溶液由黃色變?yōu)樗{(lán)色為終點(diǎn)[19]。選擇連續(xù)的3 d重復(fù)同樣試驗(yàn)，研究結(jié)果的可重復(fù)性。取1 mL牛奶和11 mL不同濃度的鹽酸(12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2和1 mol/L)于可以密閉的水解管中，密封水解管后放于110 ℃的恒溫干燥箱中，加熱水解24 h(加熱約1 h后輕輕搖動(dòng)水解管)；加熱結(jié)束后，取出水解管，冷卻后用濾紙過(guò)濾，濾液備用。

1.4 水解液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

移取2 mL水解液，參考GB 5009.5—2016[20]中規(guī)定的方法用凱氏定氮儀(Foss，丹麥)對(duì)水解液中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 糠氨酸含量的測(cè)定

穩(wěn)定性試驗(yàn)中的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液可以直接上機(jī)檢測(cè)。測(cè)定水解液中的糠氨酸含量時(shí)，檢測(cè)前需先取1 mL水解液與5 mL 6 g/L乙酸銨溶液混合，過(guò)0.22 μm濾膜(Waters公司)后再上機(jī)測(cè)定。

水解液中糠氨酸含量參考NY/T 939—2016[4]中規(guī)定的方法利用Waters ACQUITY UPLC H-CLASS UPLC儀(配有紫外檢測(cè)器及Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))進(jìn)行定量檢測(cè)，方法如下：使用0.1%三氟乙酸水溶液(含6 g/L乙酸銨，流動(dòng)相A)、甲醇(流動(dòng)相B)和水(流動(dòng)相C)為流動(dòng)相，色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，粒徑1.8 μm)，采用流動(dòng)相A等度洗脫模式，洗脫速度為0.4 mL/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為0.5 μL。定量檢測(cè)前需先用流動(dòng)相B和C沖洗色譜柱，再用流動(dòng)相A和C流動(dòng)相平衡色譜柱，最后用3 mol/L鹽酸檢測(cè)溶劑純度、儀器和色譜柱的狀態(tài)。上述所用試劑均為色譜純，乙酸銨購(gòu)于CNW公司，三氟乙酸購(gòu)于百靈威科技有限公司，甲醇和乙腈購(gòu)于Thermo Fisher公司。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SAS 9.1.3統(tǒng)計(jì)軟件中的單因子方差分析(one-way ANOVA)過(guò)程進(jìn)行單因子方差分析，并采用LSD法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

2.1.1 鹽酸濃度對(duì)糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)存穩(wěn)定性的影響

本試驗(yàn)采用3種不用濃度的鹽酸配制糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，由圖1和圖2可以看出，在相同儲(chǔ)存條件下，用低濃度鹽酸(0.1 mol/L)配制的糠氨酸溶液穩(wěn)定性較差，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，糠氨酸發(fā)生明顯的降解。根據(jù)糠氨酸的峰面積計(jì)算降解率，0.1 mol/L鹽酸配制的1 mg/L糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在25 ℃儲(chǔ)存8 d時(shí)降解率達(dá)到23.55%，儲(chǔ)存21 d時(shí)降解率達(dá)到84.27%，4 ℃儲(chǔ)存12 d時(shí)降解率達(dá)到21.75%，儲(chǔ)存21 d時(shí)降解率達(dá)到42.01%，-20 ℃儲(chǔ)存8 d時(shí)降解率達(dá)22.75%，儲(chǔ)存21 d時(shí)降解率達(dá)59.12%，不能夠滿足試驗(yàn)要求；0.1 mol/L鹽酸配制的5 mg/L糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液25 ℃儲(chǔ)存14 d時(shí)降解率達(dá)到10.15%，儲(chǔ)存21 d時(shí)降解率達(dá)到14.18%，4 ℃儲(chǔ)存17 d時(shí)降解率達(dá)到10.89%，儲(chǔ)存21 d時(shí)降解率達(dá)到12.19%，-20 ℃儲(chǔ)存8 d時(shí)降解率達(dá)13.10%，儲(chǔ)存21 d時(shí)降解率達(dá)49.39%，不能夠滿足試驗(yàn)要求；中濃度鹽酸(1.0 mol/L)配制的2種濃度的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(1和5 mg/L)穩(wěn)定性總體比較好，但5 mg/L糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在-20 ℃儲(chǔ)存條件下峰面積波動(dòng)比較大(18.10%～32.24%)。高濃度鹽酸(3.0 mol/L)配制的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性最好，在-20、4和25 ℃儲(chǔ)存21 d后仍保持穩(wěn)定，滿足試驗(yàn)要求?？紤]到糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在3.0 mol/L鹽酸中穩(wěn)定性最好，因此，建議用3.0 mol/L鹽酸溶解糠氨酸并進(jìn)行儲(chǔ)存。

2.1.2 儲(chǔ)存溫度對(duì)糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)存穩(wěn)定性的影響

由圖1和圖2可以看出，當(dāng)糠氨酸溶解于高濃度鹽酸(3 mol/L)時(shí)，糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性比較好，但溫度并不影響糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性。但是考慮到大批量檢測(cè)過(guò)程中，UPLC樣品室的溫度一般設(shè)定為4 ℃，同時(shí)為了盡可能減少凍融對(duì)糠氨酸的影響，因此，配制好的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液不建議保存于室溫和-20 ℃，建議于4 ℃保存，于21 d內(nèi)使用。

2.2 鹽酸濃度對(duì)牛奶中糠氨酸檢測(cè)結(jié)果的影響

由圖3和表1可以看出，一定范圍內(nèi)，隨著水解牛奶所用鹽酸濃度的升高，糠氨酸的游離程度升高，檢測(cè)到的糠氨酸含量增加。統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用的鹽酸濃度達(dá)到10 mol/L時(shí)，檢測(cè)到的糠氨酸峰面積趨于平穩(wěn)，不再發(fā)生顯著變化(P>0.05)。

為了進(jìn)一步探究上述結(jié)果的可重復(fù)性，選擇連續(xù)的3 d重復(fù)同樣試驗(yàn)。由圖4和表2可以看出，當(dāng)水解牛奶所用的鹽酸濃度達(dá)到10 mol/L時(shí)，牛奶中的糠氨酸可以完全水解游離出來(lái)，檢測(cè)到的糠氨酸含量不再發(fā)生顯著變化(P>0.05)。

3 討 論

糠氨酸是牛奶在加熱過(guò)程中發(fā)生“美拉德反應(yīng)”后的特征性產(chǎn)物之一，其含量可以反映牛奶的質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[21]。近些年的一系列研究發(fā)現(xiàn)，糠氨酸具有細(xì)胞毒性，并對(duì)小鼠肝臟、腎臟和睪丸的正常功能產(chǎn)生負(fù)面影響[5,7,22]。因此，準(zhǔn)確測(cè)定牛奶中糠氨酸含量對(duì)于牛奶加工過(guò)程質(zhì)量控制和科學(xué)研究具有重要意義。

目前基于糠氨酸檢測(cè)的研究比較多[9,12,21,23-27]，但是尚未有研究分析糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性。本研究考察了糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，糠氨酸受所處溶液環(huán)境影響比較大，在相同的儲(chǔ)存條件下，糠氨酸溶解在低濃度鹽酸(0.1 mol/L)中穩(wěn)定性較差，在中濃度鹽酸(1.0 mol/L)中穩(wěn)定性較好，在高濃度鹽酸(3.0 mol/L)溶液中穩(wěn)定性最好，這可能是因?yàn)榭钒彼岜旧頌樗嵝苑肿樱^高的酸性環(huán)境有利于其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。與單純的糠氨酸溶液不同，牛奶中糠氨酸則會(huì)在儲(chǔ)存過(guò)程中會(huì)發(fā)生規(guī)律性變化，一般而言，儲(chǔ)存時(shí)間越長(zhǎng)，儲(chǔ)存時(shí)溫度越高，糠氨酸含量會(huì)越高，室溫條件下，每10 d每100 g牛奶蛋白質(zhì)中糠氨酸含量約增長(zhǎng)7 mg，這主要是因?yàn)槭覝貤l件下牛奶中仍然可以發(fā)生緩慢的“美拉德反應(yīng)”產(chǎn)生新的糠氨酸[1]。而在相同的鹽酸濃度(3.0 mol/L)條件下，糠氨酸對(duì)溫度不敏感，在-20、4 ℃和室溫(25 ℃)條件下儲(chǔ)存21 d沒(méi)有明顯降解，滿足試驗(yàn)需求。但是考慮到在實(shí)際樣品檢測(cè)過(guò)程中，UPLC樣品室溫度一般設(shè)定為4 ℃，因此建議保存于4 ℃。

此外，本試驗(yàn)還研究了使用不同濃度鹽酸水解牛奶對(duì)糠氨酸檢測(cè)結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著水解牛奶所用鹽酸濃度的升高，檢測(cè)到的糠氨酸含量增加，一方面可能是因?yàn)榈蜐舛鹊柠}酸不能完全水解牛奶使糠氨酸完全游離出來(lái)，隨著水解牛奶所用鹽酸濃度的升高，糠氨酸游離程度升高；另一方面也可能是因?yàn)榈蜐舛鹊柠}酸并不能完全阻止新的“美拉德反應(yīng)”產(chǎn)生新的糠氨酸。前人研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)牛奶中鹽酸濃度達(dá)到6 mol/L時(shí)，可以完全阻斷“美拉德反應(yīng)”的進(jìn)行[28-29]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水解液中鹽酸濃度達(dá)到9.17 mol/L時(shí)，再提高鹽酸濃度檢測(cè)到的糠氨酸含量不再發(fā)生顯著變化，可能是因?yàn)檫@時(shí)牛奶中已經(jīng)不再發(fā)生新的“美拉德反應(yīng)”，同時(shí)糠氨酸已經(jīng)在鹽酸的作用下完全游離出來(lái)。因此，建議水解1 mL牛奶所用的鹽酸濃度至少為10 mol/L，考慮到牛奶稀釋倍數(shù)，即牛奶水解液中鹽酸濃度應(yīng)至少達(dá)到9.17 mol/L。

圖2 不同濃度鹽酸配制的5 mg/L糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同溫度下的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

圖3 不同濃度鹽酸水解牛奶對(duì)糠氨酸檢測(cè)結(jié)果的影響

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)存穩(wěn)定性進(jìn)行研究，確定了糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的儲(chǔ)存條件，可為實(shí)驗(yàn)室中糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和保存提供參考依據(jù)；同時(shí)，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)牛奶水解所用鹽酸濃度進(jìn)行研究，確定了牛奶水解液中的鹽酸濃度，可為更加準(zhǔn)確地定量檢測(cè)牛奶中糠氨酸含量提供數(shù)據(jù)支持。

4 結(jié) 論

① 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的儲(chǔ)存穩(wěn)定性受到鹽酸濃度的影響，3.0 mol/L鹽酸配制的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性最佳。

② 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的儲(chǔ)存穩(wěn)定性受儲(chǔ)存溫度的影響較小，建議將配制好的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液保存于4 ℃，于21 d內(nèi)使用。

③ 鹽酸濃度影響牛奶的水解效果，水解牛奶所用的鹽酸濃度應(yīng)使水解液中鹽酸濃度至少達(dá)到9.17 mol/L。

表1 不同濃度鹽酸水解牛奶對(duì)糠氨酸檢測(cè)結(jié)果的影響

A、B和C表示在不同的3 d進(jìn)行的3次獨(dú)立試驗(yàn)。每次試驗(yàn)n=4。

續(xù)表2水解牛奶所用鹽酸濃度HCl concentration used for milk hydrolysis procedure/(mol/L)水解液中鹽酸濃度HCl concentration in hydrolysate/(mol/L)糠氨酸含量Furosine content/(mg/100 g prot) (n=4)12343.6733.55±0.11g40.62±0.40g31.92±0.35g54.5842.16±0.53f48.95±3.60f42.25±0.57f65.5050.52±0.54e49.55±0.94e49.07±0.16e76.4261.78±0.63d62.05±1.05d62.58±1.08d87.3376.68±0.26c76.05±0.46c75.43±0.52c98.2589.56±0.65b89.18±1.88b88.06±0.21b109.17101.98±0.34a101.50±2.64a102.23±0.32a1110.08102.13±0.57a102.62±1.33a103.88±1.97a1211.00109.96±2.70a103.49±1.80a104.70±0.40a