金 鹿 李勝利 桑 丹 張崇志 張春華 張俊麗 施 安 孫海洲* 李聚才*

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動物營養(yǎng)與飼料研究所，內(nèi)蒙古自治區(qū)草食動物營養(yǎng)科學(xué)重點實驗室，呼和浩特010031；2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動物科學(xué)研究所，銀川750002)

長期以來，反芻動物營養(yǎng)學(xué)家一直致力于通過優(yōu)化飼糧配方和利用飼料添加劑來改善、調(diào)節(jié)瘤胃中不同微生物菌群之間的競爭關(guān)系，以提高機體能量和蛋白質(zhì)的利用效率。飼料添加劑不僅可以改善瘤胃內(nèi)環(huán)境，而且能夠增強或抑制特定微生物菌群的結(jié)構(gòu)[1]。植物多糖是廣泛存在于植物體組織中的酮糖或醛糖通過糖苷鍵連接在一起組成的天然高分子化合物，近年來因其具有增強免疫機能、改善幼畜腸道健康和瘤胃微生態(tài)環(huán)境等特點，被用作綠色、安全的飼料添加劑之一。沙蒿多糖是植物多糖的一種，具有植物多糖的全部特性，本實驗室的前期研究結(jié)果表明，沙蒿多糖能夠能抑制消化道中有害菌的生長與繁殖，同時也可調(diào)節(jié)反芻動物瘤胃微生物發(fā)酵，提高機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，進而促進動物的生長發(fā)育[2-3]。此外，丁酸作為一種短鏈脂肪酸，能夠快速、直接的為胃腸道上皮細胞生長發(fā)育提供能量，也被證實具有改善胃腸道健康的功能。丁酸甘油酯和包膜丁酸鈉同為丁酸衍生物，在腸道內(nèi)部可水解產(chǎn)生丁酸。丁酸甘油酯無毒性和刺激性，在動物體內(nèi)發(fā)揮作用時間長，能夠提供更加集中的能量形式[4]。包膜丁酸鈉則無需主動轉(zhuǎn)運直接進入血液，作用迅速[5]。據(jù)報道，三丁酸甘油酯和包膜丁酸鈉均具有抗炎、保護腸黏膜的作用，能夠為消化道提供營養(yǎng)需要，進而預(yù)防斷奶應(yīng)激對動物機體造成的壓力，提高動物的生長性能[6]。但是，目前關(guān)于沙蒿多糖與丁酸類物質(zhì)的研究主要集中在豬和家禽等單胃動物上，在反芻動物中的研究相對較少，且大多數(shù)試驗都是集中在單一物質(zhì)的效果研究上，有關(guān)沙蒿多糖與丁酸類物質(zhì)復(fù)合使用對灘羊羔羊瘤胃的作用機理研究尚未見報道。因此，本試驗利用16S rDNA高通量測定技術(shù)，分析飼糧中添加沙蒿多糖不同組合制劑對灘羊羔羊瘤胃菌群組成及多樣性的影響，以期為沙蒿多糖不同組合制劑在舍飼灘羊生產(chǎn)實踐中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

沙蒿多糖(含量為95%以上)為實驗室自制，丁酸甘油酯(含量為60%)購于四川某飼料有限公司，包被丁酸鈉(含量為60%)購于杭州某飼料有限公司，莫能菌素(含量3.8%)購于北京某生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗設(shè)計和基礎(chǔ)飼糧

采用完全隨機試驗設(shè)計，選擇健康、體況良好、體重相近的斷奶灘羊公羔60只，按體重隨機分為4個組，每組15只羊。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗1組、試驗2組和試驗3組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加5.5 g/d沙蒿多糖+5.5 g/d包被丁酸鈉、5.5 g/d沙蒿多糖+5.5 g/d丁酸甘油酯和5.5 g/d沙蒿多糖+1.1 g/d莫能菌素的試驗飼糧。參照NRC(2007)[7]飼養(yǎng)標(biāo)準配制基礎(chǔ)飼糧，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。其中，沙蒿多糖、包被丁酸鈉、丁酸甘油酯的添加水平在NRC(2007)[7]飼養(yǎng)標(biāo)準的基礎(chǔ)上，并結(jié)合課題組前期李勝利[2]和邴新帥[3]的研究結(jié)果設(shè)定；莫能菌素的添加水平按照產(chǎn)品說明的推薦劑量設(shè)定。整個試驗期75 d，其中預(yù)試期為15 d，正試期為60 d。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗在寧夏靈誠農(nóng)牧科技有限公司養(yǎng)殖場進行，試驗期間所有羊只每日飼喂2次(08：00和17：00)，自由采食及飲水。各組試驗羊只單欄飼喂，環(huán)境條件及飼養(yǎng)管理均保持一致，由專人負責(zé)飼養(yǎng)，并每天記錄羊只的個體采食量。

1.4 基礎(chǔ)飼糧營養(yǎng)水平測定

飼糧中干物質(zhì)含量按照GB/T 6435—2014的方法進行檢測[9]；粗蛋白質(zhì)含量使用凱式定氮法，按照GB/T 6432—1994的方法，通過凱氏定氮儀(KDY-9820，北京科拓有限公司)進行檢測[10]；鈣含量使用乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合滴定法，按照GB/T 6436—2002的方法進行檢測[11]；磷含量定使用分光光度法，按照GB/T 6437—2002的方法，應(yīng)用紫外可見分光光度計(UV-2600，日本島津公司)進行檢測[12]。

1.5 瘤胃液的采集與處理

試驗結(jié)束后，每個組選擇3只試驗羊進行屠宰，屠宰后立即無菌操作采集試驗羊的瘤胃液，一部分分裝于50 mL的離心管中，用于測定pH；一部分用4層紗布過濾收集上清液，分裝于5 mL的離心管中，-20 ℃冰箱保存，用于測定氨態(tài)氮和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度；一部分置于5 mL的凍存管中，-80 ℃冰箱保存，用于瘤胃微生物區(qū)系測定。

1.6 瘤胃發(fā)酵參數(shù)測定

瘤胃液pH使用酸度計(FE20，瑞士梅特勒-托利多公司)現(xiàn)場進行測定；瘤胃液氨態(tài)氮濃度的測定采用馮宗慈等[13]的方法；瘤胃液VFA濃度采用姜芳等[14]的方法，通過氣相色譜儀(GC-2014，日本島津公司)檢測。

1.7 樣本測序

1.7.1 DNA樣品提取和PCR擴增

按照糞便基因組提取試劑盒說明書的方法對試驗樣品進行DNA提取，之后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop對提取的DNA樣品進行質(zhì)量檢測。引物上添加測序接頭和樣本特異性Barcode序列，進而擴增16s rDNA序列的V3～V4區(qū)域，引物序列為：338F，5’-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’，806R，5’-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。PCR采用25 μL擴增體系：DNA模板5 ng，5 μmol/L的上、下游引物各1 μL，2 ng/μL的牛血清白蛋白(BSA) 3 μL，2xTaq Plus Master Mix 12.5 μL，雙蒸水(ddH2O)補加至25 μL。PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸 60 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用PCR純化試劑盒純化回收，并按測序要求進行混合。

1.7.2 MiSeq測序

將樣品送至北京奧維森基因科技有限公司運用Mixed PE 300平臺進行MiSeq測序。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010進行計算，并采用SAS 9.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏法進行多重比較。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，0.05≤P<0.10為差異有顯著趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

由表2可知，與對照組相比，試驗1組和試驗2組灘羊瘤胃液乙酸、丁酸、總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度和乙酸比例顯著提高(P<0.05)。各組之間灘羊瘤胃液pH，氨態(tài)氮、丙酸濃度，丙酸、丁酸比例以及乙酸/丙酸無顯著差異(P>0.05)。

2.2 瘤胃菌群多樣性

2.2.1 操作分類單位(OTU)數(shù)量

Venn圖用于統(tǒng)計多個樣本中所共有和獨有的OTU數(shù)目，可以比較直觀地表現(xiàn)環(huán)境樣本的OTU數(shù)目組成相似性及特異性。利用瘤胃內(nèi)細菌群落共享和獨特的OTU數(shù)目對飼糧內(nèi)添加沙蒿多糖混合制劑效果進行分析，由圖1可知，4個組共產(chǎn)生1 530個OTU，其中對照組產(chǎn)生1 048個OTU，試驗1組產(chǎn)生912個OTU，試驗2組產(chǎn)生1 286個OTU，試驗3組產(chǎn)生839個OTU，4個組共享了541個OTU，占總OTU數(shù)目的35.36%。對照組、試驗1組、試驗2組和試驗3組獨有的OTU數(shù)目分別為29、30、263和31個，分別占1.90%、1.96%、17.19%和2.03%，OTU數(shù)目順序為試驗2組>試驗3組>試驗1組>對照組，表明試驗2組、試驗3組和試驗1組均提高了瘤胃內(nèi)特有微生物的種類，增加了其微生物的多樣性。

表2 沙蒿多糖組合制劑對灘羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

LW1、LW2、LW3和LW4分別代表試驗1組、試驗2組、試驗3組和對照組。下圖同。

2.2.2 多樣性分析

2.2.2.1 稀釋曲線和Shannon曲線

稀釋曲線和Shannon曲線反映本試驗的測序量和97%相似度OTU數(shù)目下制備的文庫微生物多樣性。由圖2可以看出，隨著測序深度的增加，新物種出現(xiàn)的增加速度變得緩慢，但是仍然有新種群出現(xiàn)。由圖3可以看出，當(dāng)測序深度較小時，Shannon曲線急速上升，當(dāng)測序深度達到5 000 reads時，該多樣性曲線變化緩慢，已接近飽和，說明測序趨向飽和，即本試驗當(dāng)前的測序量足夠進行樣品菌群多樣性分析。

圖2 樣品的稀釋曲線

圖3 樣品的Shannon曲線

2.2.2.2 α多樣性分析

α多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析，包括Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)等。其中，Chao1指數(shù)反映樣品中微生物的種類，即OTU數(shù)目。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)則用于估計微生物多樣性，Shannon指數(shù)越大反映了樣品中微生物多樣性越豐富。由表3可知，試驗2組的Chao1指數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)，說明試驗2組樣品中細菌物種總數(shù)高于對照組。試驗2組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)有大于對照組的趨勢(0.05≤P<0.10)，說明試驗2組樣品中細菌的多樣性高于對照組。各組的覆蓋率均高于99%，說明足夠反映試驗不同組別中每只灘羊瘤胃菌群的情況。

表3 α多樣性指數(shù)

2.2.2.3 β多樣性分析

β多樣性主要是為了研究不同樣品或組別之間的菌群結(jié)構(gòu)差異。采用加權(quán)Unifrac比較組別之間的微生物群落之間的距離，可以直觀地反映出不同組別之間物種的組成結(jié)構(gòu)差異性。各組之間離散的越遠，說明各組差異越大。由圖4可以看出，本試驗中，試驗2組與其他各組相距較遠，說明其與其他各組瘤胃微生物區(qū)系存在著差異，也進一步可以說明飼糧添加沙蒿多糖+丁酸甘油酯可以使灘羊羔羊的瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

圖4 16S rDNA的主坐標(biāo)分析

2.2.3 細菌組成和群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.3.1 門水平結(jié)構(gòu)分析

灘羊瘤胃細菌在門水平上的組成和相對豐度見表4和圖5，共檢測到21種菌門，包括厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、螺旋菌門、軟壁菌門、糖細菌門、變形菌門、絲狀桿菌門、藍藻菌門、SR1_Absconditabacteria、疣微菌門、綠彎菌門、未注釋細菌門、互養(yǎng)菌門、廣古菌門、黏膠球形菌門、浮霉菌門等。4個組中灘羊瘤胃液中的菌門主要為厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門，占到了總細菌的94.52%。與對照組相比，試驗1組瘤胃液中軟壁菌門的相對豐度顯著升高(P<0.05)，厚壁菌門和絲狀桿菌門的相對豐度有升高的趨勢(0.05≤P<0.10)；試驗2組瘤胃液中綠彎菌門的相對豐度顯著升高(P<0.05)，而疣微菌門的相對豐度有升高的趨勢(0.05≤P<0.10)；試驗3組瘤胃液中藍藻菌門和互養(yǎng)菌門的相對豐度顯著升高(P<0.05)。

2.2.3.2 屬水平結(jié)構(gòu)分析

灘羊瘤胃細菌在上水平上的組成和相對豐度見表5和圖6，將瘤胃細菌群落細化分類注釋到細菌屬水平，4組灘羊瘤胃液菌群總共包含173個屬。其中有18個菌屬相對比例均占到序列總數(shù)的1%以上，分別為普雷沃氏菌屬_1、克里斯滕森菌科_R-7、奧爾森菌屬、理研菌科_RC9、毛螺菌科_NK3A20、密螺旋體屬_2、Saccharofermentans、瘤胃球菌屬_gauvreauii、瘤胃球菌科_NK4A214、瘤胃球菌科_UCG-014、Sharpea、雙歧桿菌屬、毛螺旋菌科、互營球菌屬、Catenisphaera、產(chǎn)糞甾醇真細菌、解琥珀酸菌屬、嚙齒真桿菌等。與對照組相比，試驗1組瘤胃液中理研菌科RC9的相對豐度顯著降低(P<0.05)，解琥珀酸菌屬和丹毒絲菌屬的相對豐度顯著升高(P<0.05)；試驗2組瘤胃液中Sharpea的相對豐度顯著降低(P<0.05)，假丁酸弧菌屬的相對豐度顯著升高(P<0.05)；試驗3組瘤胃液中理研菌科RC9和Sharpea的相對豐度顯著降低(P<0.05)，互營球菌屬的相對豐度有增加的趨勢(0.05≤P<0.10)。

Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Actinobacteria：放線菌門；Spirochaetae：螺旋菌門；Tenericutes：軟壁菌門；Other：其他。

3 討 論

反芻動物的瘤胃是一個復(fù)雜的厭氧微生物發(fā)酵系統(tǒng)，主要包括細菌和古菌、原蟲和真菌以及噬菌體，其中細菌是瘤胃中數(shù)量最多、種類最復(fù)雜的微生物。細菌的生長代謝不僅能夠為反芻動物提供能量、蛋白質(zhì)、必需氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，而且可以降解纖維物質(zhì)，使其轉(zhuǎn)化為供機體吸收利用的能源物質(zhì)，進而維持反芻動物的營養(yǎng)需要[15]。研究表明，反芻動物瘤胃中的優(yōu)勢菌群主要為厚壁菌門和擬桿菌門，其在瘤胃發(fā)酵過程中扮演著重要角色[16-17]。本試驗中，瘤胃優(yōu)勢菌群按照相對豐度由大到小依次為厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門，這與上述研究得出的結(jié)果一致。郭偉[18]使用RDP數(shù)據(jù)庫資源對瘤胃菌群16S rRNA基因序列進行Meta分析后，得出山羊瘤胃中優(yōu)勢菌群依次為擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門，與本研究得出的結(jié)論不同，探究其原因可能是與動物的品種與日齡、飼糧結(jié)構(gòu)、采樣方式以及測序區(qū)域等的不同有關(guān)。厚壁菌門與擬桿菌們分別在纖維物質(zhì)與非纖維物質(zhì)的降解中發(fā)揮著重要作用，纖維與非纖維物質(zhì)經(jīng)瘤胃發(fā)酵后分別產(chǎn)生乙酸和丙酸[19]。有學(xué)者認為，厚壁菌門和擬桿菌門二者含量的比例會影響機體對能量的吸收。Turnbaugh等[20]研究發(fā)現(xiàn)，腸道富集厚壁菌門細菌的小鼠比較肥胖，然而擁有更高比例擬桿菌門細菌的小鼠卻相對消瘦。這可能是因為厚壁菌門細菌富含淀粉、半乳糖及丁酸等代謝酶，有助于促進機體對能量的吸收，更有利于脂肪的沉積[21]。本試驗前期研究結(jié)果的生長性能數(shù)據(jù)表明，與對照組相比，沙蒿多糖+包被丁酸鈉組、沙蒿多糖+丁酸甘油酯組和沙蒿多糖+莫能菌素組顯著提高了灘羊羔羊的末重和平均日增重，平均日增重比對照組分別增加了15.29%、11.98%和17.33%，但對平均日采食量無顯著影響，4個組的平均日采食量分別為2 120、2 110、2 140和2 180 g/d；4個組的料重比分別為10.99、9.86、10.20和9.99，以沙蒿多糖+包被丁酸鈉組為最低，且與對照組相比差異顯著[22]。因此，本試驗中飼糧添加沙蒿多糖+包被丁酸鈉后灘羊羔羊的增重并非由采食量導(dǎo)致的，推測其一方面是由于其提高了瘤胃中厚壁菌門的相對豐度；另一方面可能與沙蒿多糖、丁酸鈉營養(yǎng)腸道的作用有關(guān)[23]。此外，與生長性能相一致，本研究中飼糧添加沙蒿多糖+包被丁酸鈉有提高Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)的趨勢，雖然與對照組相比差異不顯著，但在數(shù)值上均有所提高。這說明飼糧添加沙蒿多糖+包被丁酸鈉可能通過提高瘤胃微生物豐度和多樣性導(dǎo)致羔羊生長性能提高。

Daly等[24]研究表明，厚壁菌門中包含有較多的纖維分解菌。本研究中，飼糧添加沙蒿多糖+包被丁酸鈉有提高瘤胃液中厚壁菌門的相對豐度的趨勢，說明添加沙蒿多糖+包被丁酸鈉后促進了纖維分解菌的生長，這可能會提高瘤胃內(nèi)纖維類物質(zhì)的分解效率，發(fā)酵產(chǎn)生更多的乙酸。VFA(乙酸、丙酸、丁酸)的組成和濃度除受飼糧結(jié)構(gòu)和品質(zhì)的影響外，瘤胃微生物活性和微生物區(qū)系也會影響VFA的生成[25]。本研究得出，飼糧添加沙蒿多糖+包被丁酸鈉顯著提高瘤胃液乙酸比例，說明添加沙蒿多糖+包被丁酸鈉后纖維的降解率有所提高，可能是由于添加沙蒿多糖+包被丁酸鈉后提高了厚壁菌門相對豐度的原因。此外，碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生VFA的過程中釋放的能量可以供微生物生長繁殖利用。據(jù)報道，pH的高低也會直接影響瘤胃微生物的生長代謝，反芻動物瘤胃液適宜pH為6.00～6.30，pH過低將會抑制纖維分解菌的活性[26-27]。本試驗中，各試驗組瘤胃液pH雖略有提高，但均處于正常范圍內(nèi)，說明發(fā)酵環(huán)境有利于微生物的生長和代謝。

表4 沙蒿多糖組合制劑對灘羊瘤胃菌群在門水平上相對豐度的影響

變形菌門是細菌域中最大的一門，除了包含纖維素降解菌、半纖維素降解菌、蛋白質(zhì)降解菌、淀粉降解菌以及乳酸利用菌以外，還包含很多如大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺桿菌等致病菌，容易引起動物腹瀉等疾病[28]。本試驗中試驗1組和試驗2組中變形菌門的相對豐度與對照組相比雖然差異不顯著，但在數(shù)值上有所降低，說明飼糧添加沙蒿多糖+包被丁酸鈉或沙蒿多糖+丁酸甘油酯具有較好的平衡腸道菌群的作用。目前關(guān)于沙蒿多糖與丁酸類物質(zhì)復(fù)合使用對腸道菌群的影響鮮有報道，只有少量試驗集中在單一物質(zhì)的效果研究上，并且主要以單胃動物為主。本課題組李勝利[2]的研究結(jié)果表明，飼糧添加沙蒿多糖能夠減少腸道致病性如弧菌、空腸彎曲菌等的相對豐度。Rivera-Chavez等[29]研究發(fā)現(xiàn)，三丁酸甘油酯和包被丁酸鈉釋放出的有效物質(zhì)丁酸，其強酸性可以有效抑制有害致病菌的增殖，并且能夠促進乳酸菌等益生菌的生長，使腸道微生態(tài)維持在正常水平。此外，本試驗中，試驗3組與對照組間互養(yǎng)菌門的相對豐度差異顯著?；ヰB(yǎng)菌門是一種較新分類門，屬革蘭氏陰性厭氧桿菌，具有降解氨基酸和丙酮酸的能力[30]。疣微菌門在哺乳動物胃腸道免疫耐受中起主要作用，其相對豐度的減少或缺失與宿主免疫力的下降密切相關(guān)[31]。本研究中，試驗2組與對照組相比，疣微菌門的相對豐度顯著升高，這表明在飼糧中添加沙蒿多糖+丁酸甘油酯可增強機體免疫力。

Unidentified：未分類；Prevotella_1：普雷沃氏菌屬_1；Olsenella：奧爾森菌屬；Christensenellaceae_R-7_group：克里斯滕森菌科_R-7；Succiniclasticum：解琥珀酸菌屬；Lachnospiraceae_NK3A20_group：毛螺菌科_NK3A20；Treponema_2：密螺旋體屬_2；Ruminococcaceae_UCG-014：瘤胃球菌科_UCG-014；Syntrophococcus：互營球菌屬；Ruminococcus_gauvreauii_group：瘤胃球菌屬_gauvreauii；Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌科_RC9；Ruminococcus_1：瘤胃球菌屬_1；Acetitomaculum：毛螺旋菌科；Ruminococcaceae_NK4A214：瘤胃球菌科_NK4A214；Eubacterium_ruminantium_group：嚙齒真桿菌；Prevotellaceae_UCG-001：普雷沃氏菌科_UCG-001；Eubacterium_coprostanoligenes_group：產(chǎn)糞甾醇真細菌；Prevotella_7：普雷沃氏菌屬_7；Ruminococcus_2：瘤胃球菌屬_2；Bifidobacterium：雙歧桿菌屬；Ruminococcaceae_UCG-005：瘤胃球菌科_UCG-005；Other：其他。

表5 沙蒿多糖組合制劑對灘羊瘤胃菌群在屬水平的豐度影響

續(xù)表5項目Items對照組 Control group試驗1組Trial group 1試驗2組Trial group 2試驗3組Trial group 3均值標(biāo)準誤SEMP值P-value瘤胃球菌科_NK4A214 Ruminococcaceae_NK4A2142.286ab1.241b3.531a1.136b0.4950.029瘤胃球菌科_UCG-014 Ruminococcaceae_UCG-0142.2593.7451.5011.9331.6610.175Sharpea2.207a0.976ab0.545b0.161b0.3840.026雙歧桿菌屬 Bifidobacterium2.5650.1110.3500.1450.9170.249毛螺旋菌科 Acetitomaculum1.8591.8321.9093.5280.8950.498互營球菌屬 Syntrophococcus1.7932.8130.7526.8591.4200.069Catenisphaera1.259ab2.259a0.573b0.204b0.4610.057產(chǎn)糞甾醇真細菌Eubacterium_coprostanoligenes_group1.0351.3221.1731.1610.1990.791解琥珀酸菌屬 Succiniclasticum0.911b6.795a1.868ab6.071ab1.6120.036嚙齒真桿菌 Eubacterium_ruminantium_group0.8641.9511.1371.2540.4580.432瘤胃球菌科_UCG-005 Ruminococcaceae_UCG-0050.4630.4050.5970.3020.4640.468丁酸弧菌屬_2 Butyrivibrio_20.2210.1170.2920.1380.0690.371韋榮球菌科_UCG-007 Erysipelotrichaceae_UCG-0070.2910.0010.0440.0000.1360.422假丁酸弧菌屬 Pseudobutyrivibrio0.040b0.000b0.173a0.008b0.0140.001毛螺菌科_ND3007 Lachnospiraceae_ND3007_group0.9000.0100.1170.2270.3820.403丹毒絲菌屬 Solobacterium0.092b0.629a0.174b0.039b0.0620.001葡萄球菌屬 Turicibacter0.0100.0030.0000.0010.0030.130

進一步從屬水平來看，普雷沃氏菌屬是普遍存在于草食動物瘤胃中數(shù)量最多的一類擬桿菌門菌屬，參與多種微生物代謝、具有較高活性的半纖維素降解能力和適應(yīng)不同飼糧結(jié)構(gòu)的能力[32]，在蛋白質(zhì)、淀粉、木聚糖和果膠的降解過程中發(fā)揮著重要作用[33-34]。本試驗中，普雷沃氏菌屬1的相對豐度最高，但各組之間差異不顯著，這與前人研究結(jié)果[35]一致。然而從數(shù)值上看，試驗1組和試驗2組瘤胃液中普雷沃氏菌屬1的相對豐度均高于對照組，說明飼糧添加沙蒿多糖+包被丁酸鈉組或沙蒿多糖+丁酸甘油酯均能在一定程度上提高普雷沃氏菌屬的數(shù)量，進而可能提高半纖維素被分解的效率。瘤胃球菌屬包括黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌，是瘤胃中主要的纖維降解菌，能產(chǎn)生大量的纖維素酶、半纖維素酶和木聚糖酶，降解粗飼料中的纖維素和半纖維素[36]。Shen等[37]在研究莫能菌素對荷斯坦奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響中發(fā)現(xiàn)，由于莫能菌素降低了革蘭氏陽性纖維溶解菌(如瘤胃球菌屬)在瘤胃液中的相對豐度，因此降低了瘤胃液中乙酸比例。在本試驗中，試驗2組瘤胃液中瘤胃球菌科_NK4A214的相對豐度顯著高于試驗3組，而瘤胃球菌科_UCG-014的相對豐度低于試驗3組，這可能是由于灘羊瘤胃內(nèi)瘤胃球菌科_NK4A214的生長因添加莫能菌素而受到抑制，導(dǎo)致了與它有競爭關(guān)系的其他瘤胃球菌屬的相對豐度提高。Grilli等[38]研究證實，丁酸弧菌屬中的假丁酸弧菌是山羊瘤胃中主要降解纖維的細菌，發(fā)酵各種碳水化合物，丁酸是主要的代謝產(chǎn)物。Koike等[39]研究發(fā)現(xiàn)，解琥珀酸菌屬中產(chǎn)琥珀酸擬桿菌，纖維分解活性很高，能夠降解白色瘤胃球菌不能降解的晶體纖維素，是研究纖維素酶最早的瘤胃菌株之一。有研究表明，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌產(chǎn)生的酶具有獨立的纖維素化區(qū)和結(jié)合區(qū)，纖維降解能力很強，并且還能降解黃白瘤胃球菌不能降解的纖維素[40]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加沙蒿多糖+丁酸甘油酯或沙蒿多糖+包被丁酸鈉促進了灘羊瘤胃中假丁酸弧菌屬和解琥珀酸菌屬的生長繁殖，提高了瘤胃液中乙酸和丁酸濃度，表明這2組瘤胃內(nèi)纖維類物質(zhì)的消化率會提高，這也與課題組前期得出的其顯著增加了中性洗滌纖維(NDF)表觀消化率的研究結(jié)果[22]相吻合。

此外，基于當(dāng)前細菌數(shù)據(jù)庫，本研究在灘羊瘤胃內(nèi)還檢測到大量未被分類鑒定的菌屬，這些結(jié)果暗示灘羊具有自己特有的瘤胃微生物菌群，同時也反映了目前對其瘤胃微生物區(qū)系研究很少的事實，在今后的研究中有待于進一步發(fā)掘。

4 結(jié) 論

在灘羊羔羊飼糧中添加沙蒿多糖組合制劑均可提高菌群多樣性，改善瘤胃微生物區(qū)系，且以添加沙蒿多糖+包被丁酸鈉效果最好。