付常喜，陸阿明，孫一

摘要：目的：通過果糖喂養(yǎng)建立大鼠非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）模型，觀察有氧運動對糖脂代謝、肝臟損傷和炎癥反應的影響并探討腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）在運動發(fā)揮肝臟保護作用中的可能機制。方法：60只雄性Wistar大鼠隨機分為對照安靜組（CU）、對照運動組（CT）、高負荷果糖喂養(yǎng)安靜組（HU）和高負荷果糖喂養(yǎng)運動組（HT）。HU和HT組大鼠給予100 g/L果糖溶液喂養(yǎng)，2周后，CT和HT組動物進行8周中等強度跑臺運動訓練（60 min/d，4 d/w）。末次訓練后72 h取材（血清和肝臟），利用胰島素耐量試驗測定胰島素敏感性指數(shù)（ISI），酶聯(lián)免疫吸附法測定血清胰島素含量，比色酶法測定血清和肝臟甘油三酯（TAG）以及肝糖原含量，HE染色進行肝臟組織病理學觀察，采用熒光底物法測定血清、肝臟血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）和ACE2活性，高效液相色譜法檢測血管緊張素II（Ang II）和Ang（1-7）含量，蛋白印跡法檢測肝臟ACE、Ang II 1型受體（AT1R）、ACE2、Mas受體、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）蛋白表達量。結(jié)果：（1）肝臟形態(tài)、代謝與損傷：與CU組比較，HU組大鼠表現(xiàn)出肝臟腫大和中度脂肪變性，肝臟脂肪變性指數(shù)明顯升高（P<0.05），肝糖原和肝臟TAG含量增加（P<0.05），血清胰島素和TAG濃度升高（P<0.05），炎癥因子IL-6和TNF-α蛋白表達量上調(diào)（P<0.05）;與HU組比較，HT組肝細胞脂肪滴減少，肝臟脂肪變性指數(shù)顯著下降（P<0.05），肝糖原和肝臟TAG含量降低（P<0.05），血清胰島素和TAG濃度降低（P<0.05），TNF-α蛋白表達量下調(diào)（P<0.05）。各組血糖濃度以及ISI比較均無顯著性差異（P>0.05）。（2）肝臟RAS：與CU組比較，HU組肝臟ACE活性和蛋白表達量以及Ang II含量升高（P<0.05），ACE2和Mas受體蛋白表達量下調(diào)（P<0.05），ACE/ACE2活性和蛋白表達比值、AT1R/Mas受體蛋白表達比值以及Ang II/Ang（1-7）含量比值升高（P<0.05）;與HU組比較，HT組肝臟ACE活性和蛋白表達量以及Ang II含量降低（P<0.05），Ang（1-7）含量升高（P<0.05），ACE2和Mas受體蛋白表達量上調(diào)（P<0.05），ACE/ACE2活性和蛋白表達比值、AT1R/Mas蛋白表達比值以及Ang II/Ang（1-7）含量比值下降（P<0.05）。各組血清ACE、ACE2活性以及ACE/ACE2活性比值比較均無顯著性差異（P>0.05）。結(jié)論：長期有氧運動通過調(diào)控肝臟RAS（即促使ACE/Ang II/AT1R軸向ACE2/Ang（1-7）/Mas受體軸轉(zhuǎn)變）發(fā)揮肝臟保護作用，進而改善代謝紊亂并抑制NAFLD進展。

關鍵詞：有氧運動;非酒精性脂肪性肝病;代謝綜合征;腎素-血管緊張素系統(tǒng);脂肪變性

中圖分類號：G804.2文獻標識碼：A文章編號：1006-2076（2021）04-0075-11

Effects and mechanism of aerobic exercise on non-alcoholic fatty liver disease through regulation of hepatic renin-angiotensin system in rats

FU Changxi1， LU Aming2， SUN Yi3

1. Dept. of P.E.， Xuzhou University of Technology， Xuzhou 221008， Jiangsu， China; 2. School of Physical Education， Soochow University， Suzhou 215021， Jiangsu， China; 3. College of P.E.， Jilin University， Changchun 130012， Jilin， China

Abstract：Objective： To establish a rat model of non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD） by fructose overload feeding， observe the effects of aerobic exercise on glucose and lipid metabolism， liver injury and inflammation， and explore the possible mechanism of renin-angiotensin system （RAS） in exercise induced protective effect on liver. Methods： 60 male Wistar rats were randomly divided into control untrained （CU）， control trained （CT）， high-fructose untrained （HU） and high-fructose trained （HT） groups. Rats in HU and HT groups were fed with 100g/L fructose solution. 2 weeks later， animals in CT and HT groups received 8 weeks of moderate intensity treadmill training （60 min/d， 4 d/w）. 72 hours after the last training， the samples （serum and liver） were extracted and the parameters were measured as follows： insulin sensitivity index （ISI） by insulin tolerance test， serum insulin content was measured by enzyme linked immunosorbent assay， the contents of triglyceride （TAG） in serum and liver and hepatic glycogen by colorimetric enzyme assay， liver histopathology was observed by HE staining， angiotensin converting enzyme （ACE） and ACE2 activities in serum and liver by fluorescent substrates， the contents of angiotensin II （AngII） and Ang （1-7） by high performance liquid chromatography， the protein expression of ACE， Ang II type 1 receptor （AT1R）， ACE2， Mas receptor， tumour necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） protein in liver by Western blotting. Results： 1） Liver morphology， metabolism and damage： compared with CU group， HU group showed hepatomegaly and moderate steatosis， hepatic steatosis index significantly increased （P<0.05）， liver glycogen and liver TAG content increased （P<0.05）， serum insulin and TAG concentration increased （P<0.05）， inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α protein expression upregulated （P<0.05）. Compared with HU group， hepatocyte fat droplets decrease （P<0.05）， hepatic steatosis index reduced （P<0.05）， hepatic glycogen and liver TAG content decrease （P<0.05）， serum insulin and TAG concentration reduced （P<0.05） in HT group. There was no significant difference in blood glucose concentration and ISI （P>0.05） among all groups. 2） Liver RAS： compared with CU group， ACE activity and protein expression， and Ang II content in increased （P<0.05）， ACE2 and Mas receptor protein expression downregulated （P<0.05）， ACE/ACE2 activity and protein expression ratio， AT1R/Mas receptor protein expression ratio， and Ang II/Ang（1-7） content ratio increased （P<0.05） in HU group. Compared with HU group， ACE activity and protein expression， and Ang II content decreased （P<0.05）， Ang （1-7） content raised （P<0.05）， ACE2 and Mas receptor protein expression increased （P<0.05）， ACE/ACE2 activity and protein expression ratio， AT1R/Mas receptor protein expression ratio， and Ang II/Ang （1-7） content ratio decreased （P<0.05） in HT group. There was no significant difference in serum ACE， ACE2 activity and ACE/ACE2 activity ratio （P>0.05） among all groups. Conclusion： Long-term aerobic exercise plays a protective role in liver by regulating liver RAS （promoting the transformation of ACE/Ang II/AT1R axis to ACE2/Ang（1-7）/Mas receptor axis）， which can improve metabolic disorder and inhibit the progression of NAFLD.

Key words：aerobic exercise; non-alcoholic fatty liver disease; metabolic syndrome; renin-angiotensin system; steatosis

代謝綜合征是腹型肥胖、血壓升高、血脂異常、胰島素抵抗及其肝臟病變?nèi)绶蔷凭灾拘愿尾。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）等一系列代謝組分異常聚集的病理狀態(tài)。已證實，大量攝入膳食碳水化合物尤其是果糖，可導致代謝異常甚至引發(fā)心血管疾病。近期的實驗研究發(fā)現(xiàn)，過量攝入含果糖的飲料或食物可用于制作嚙齒類動物心臟代謝損害模型以及NAFLD模型。多項針對果糖超負荷NAFLD大鼠模型的研究表明，胰島素抵抗作為關鍵調(diào)節(jié)因子通過多種代謝途徑促進NAFLD的發(fā)生發(fā)展。首先，胰島素抵抗增加甘油三酯（triacylglycerol，TAG）合成，導致肝臟脂肪過度沉積;其次，胰島素抵抗可刺激促炎性脂肪細胞因子（adipocytokines）的產(chǎn)生，如腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）;第三，胰島素抵抗發(fā)生時，胰島素抑制糖異生關鍵酶——葡萄糖6-磷酸酶（glucose 6-phosphatase，G6Pase）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）的能力下降，進而造成肝臟葡萄糖代謝紊亂。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）激活與代謝綜合征并發(fā)癥密切相關，并且認為RAS是局部組織代謝調(diào)控的關鍵介質(zhì)。在經(jīng)典的RAS級聯(lián)反應途徑中，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）催化血管緊張素I（angiotensin I，Ang I）轉(zhuǎn)變?yōu)檠芫o張素II（angiotensin II，Ang II），后者與Ang II 1型受體（Ang II type 1 receptor，AT1R）結(jié)合進而發(fā)揮生物學效應。ACE/Ang II/AT1R軸（經(jīng)典軸）介導多種病理生理過程，包括炎癥反應、氧化應激以及胰島素抵抗，可引發(fā)心血管、肝臟、肺臟、腎臟等多種臟器病變。近期的研究發(fā)現(xiàn)，RAS存在一種ACE2（ACE的同源酶）介導的反向調(diào)節(jié)機制，即ACE2將Ang I或Ang II轉(zhuǎn)變?yōu)锳ng（1-7），后者與Mas受體結(jié)合。ACE2/Ang（1-7）/Mas受體軸具有與經(jīng)典RAS信號軸（ACE/Ang II/AT1R軸）相反的生物學作用，可對抗Ang II誘導的諸多不利影響，對各種器官組織（血管、心臟、腦、肺、肝、腎、脂肪組織和骨骼肌）具有保護作用。研究表明，RAS穩(wěn)態(tài)失衡可引發(fā)肝臟疾病，而激活ACE2/Ang（1-7）/Mas受體軸則具有肝臟保護效應。

規(guī)律體力活動是治療代謝綜合征的重要非藥物康復手段，其對代謝綜合征各個組分均具有改善作用。長期規(guī)律運動可明顯改善胰島素抵抗、異位脂肪沉積以及炎癥反應狀態(tài)。此外，運動還對RAS產(chǎn)生積極影響，包括降低血漿Ang II濃度，下調(diào)心肌中ACE和Ang II表達量，促進骨骼肌中ACE/Ang II/AT1R軸向ACE2/Ang（1-7）/Mas受體軸轉(zhuǎn)化。然而，運動對肝臟組織RAS的影響尚不清楚。因此，本研究通過果糖喂養(yǎng)建立大鼠NAFLD模型，觀察有氧運動對糖脂代謝、肝臟損傷和炎癥反應的影響并探討RAS在運動發(fā)揮肝臟保護作用中的可能機制。

1材料和方法

1.1實驗動物與分組

60只10周齡雄性Wistar大鼠由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2018-0027。大鼠在溫度可控（22±2℃）、反相明暗周期12 h/12 h的房間里以標準飼料飼養(yǎng)（5只/籠），自由進食水。大鼠適應環(huán)境1周后先隨機分為2組：對照組和果糖喂養(yǎng)組，每組n=30。果糖喂養(yǎng)組飲用果糖溶液，即將D-果糖（Sigma公司，美國）溶于水中配成濃度為100 g/L的果糖溶液，對照組整個實驗期間僅飲用水。2周后，將大鼠隨機分為4組：對照安靜組（control untrained， CU）、對照運動組（control trained，CT）、高負荷果糖喂養(yǎng)安靜組（high-fructose untrained，HU）和高負荷果糖喂養(yǎng)運動組（high-fructose trained，HT），每組n=15，其中CU和CT組正常喂養(yǎng)，HU和HT組繼續(xù)飲用果糖溶液，CU和HU組保持安靜狀態(tài)，CT和HT組進行8周跑臺運動訓練。每周評估食物和水的攝入量，能量攝入通過進食中飼料和果糖的攝入量換算成熱量，整個實驗期間（2周+8周）每周測量動物的體重。本研究經(jīng)徐州工程學院倫理委員會審查和批準（批準號：XZUTLL 2019-003-02）。

1.2最大跑臺運動測試

所有動物進行跑臺適應性訓練運動（10 min/d;強度為5～15 m/min逐漸遞增）1周后以及8周實驗結(jié)束后接受最大跑臺運動測試，方案為：初始速度為以15 m/min，每2 min遞增2 m/min，直至力竭，記錄最大跑速。動物力竭標準為：用毛刷驅(qū)趕（未使用電刺激）仍處于跑臺后1/3處超過10次。該測試用于評定大鼠有氧運動能力（最大跑速）并據(jù)此制定訓練強度。

1.3運動訓練方案

大鼠飲用水或D-果糖溶液2周后開始進行跑臺運動訓練，運動負荷逐漸遞增（強度為最大跑速的50～75，坡度為0～7），每周4天（周一、周三、周五和周日），每天60 min，共8周。末次訓練72 h（避免急性運動的影響）后，先進行胰島素耐量試驗，隨后麻醉動物并取材。

1.4胰島素敏感性測定

大鼠禁食8 h后，參照Osundiji等建立的方法進行胰島素耐量試驗。腹腔注射胰島素（0.75 U/kg，美國Sigma公司），分別于注射前、注射后15 min尾靜脈取血，用血糖儀（Accu-Chek，德國羅氏公司）測定血糖濃度。用血糖在15 min內(nèi)的變化率表示胰島素敏感性指數(shù)（insulin sensitivity index，ISI），即ISI=（＼t=0 min-＼t=15 min）÷15。由于ISI反映葡萄糖的清除率，因此數(shù)值越大表示胰島素敏感性越高。

1.5組織取材

用氯胺酮（80 mg/kg）和賽拉嗪（12 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，心臟穿刺采血后放血處死大鼠。全血離心（3 000 rpm，15 min）分離血清，-20℃低溫冰箱凍存待測血糖、血清胰島素和TAG含量以及ACE和ACE2活性。剝離肝臟并稱重，將其分為兩部分，一部分固定在甲醛溶液中進行光鏡觀察，另一部分投入液氮快速冷凍，取出用錫紙包裹并于-80℃低溫冰箱中儲存用于蛋白表達分析以及肝臟TAG、糖原水平、ACE和ACE2活性、Ang II和Ang（1-7）含量測定。

1.6物質(zhì)代謝參數(shù)測定

血清胰島素含量用全自動酶標儀（BIO-RAD iMark，美國）以酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定，ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;血清和肝臟TAG、肝糖原含量用自動分光光度計（HACH DR2700，美國）以比色酶法測定，試劑盒購自中國生物技術股份有限公司。

1.7肝臟組織病理學觀察

取固定的肝臟樣品，石蠟包埋，用蘇木精和伊紅（Hematoxylin and Eosin，HE）染色并制作3 μm厚切片。每張切片于光學顯微鏡（奧林巴斯IX71，日本）下選取15個視野，對肝臟組織標本進行病理學觀察，評估肝臟脂質(zhì)蓄積（脂肪變性）情況。參照Catta-Preta等的方法計算肝臟脂肪變性指數(shù)（）。

1.8血清、肝臟ACE和ACE2活性測定

參照Carmona等建立的方法，采用熒光底物法測定血清、肝臟中ACE和ACE2活性。血清和肝臟ACE活性測定：將肝組織樣品（60 mg）在0.1 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH=7.0，含50 mmol/L NaCl）勻漿，4℃、1000 g離心10 min。于37℃、0.1 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH=7.0，含50 mmol/L NaCl和10 mmol/L ZnCl2）中測定血清和肝臟ACE酶活性，以0.5 μmmol/L甲巰丙脯酸作為陰性樣品中的抑制劑。以分子內(nèi)淬滅熒光底物Abz-FRK-（Dnp）P-OH（10 μmmol/L）與樣品（肝臟勻漿或血清）在37℃孵育30 min的水解速率代表ACE酶活性。蛋白含量用考馬斯亮藍法以牛血清白蛋白為標準進行測定。血清和肝臟ACE2活性：以Abz-APK-（Dnp）-OH作為熒光底物測定血清和肝組織中ACE2活性，其他方法與步驟ACE。單位分別為：U/min/mL蛋白（血清）或U/min/mg蛋白（肝臟）。

1.9蛋白印跡分析

取100 mg肝臟組織在含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的緩沖液中勻漿，離心（4℃、5 000 g）20 min取上清。使用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度（蛋白質(zhì)檢測試劑盒購自美國Thermo公司）。取10 μg蛋白樣品在垂直電泳儀上經(jīng)12 SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至聚二氟乙烯膜上。用5牛血清白蛋白封閉，并在4℃依次與下列兔抗鼠一抗孵育過夜：ACE（稀釋比1∶500，美國Abcam公司，貨號：ab11734）、AT1R（稀釋比1∶500，美國Santa Cruz公司，貨號：SC579）、ACE2（稀釋比1∶200，美國Abcam公司，貨號：ab108252）、Mas受體（稀釋比1∶500，美國Santa Cruz公司，貨號：SC135063）、PEPCK（稀釋比1：1000，美國Santa Cruz公司，貨號：SC32879）、G6Pase（稀釋比1∶1 000，美國Santa Cruz公司，貨號：SC25840）、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2（glucose transporter 2，GLUT-2）（稀釋比1∶1 000，美國Santa Cruz公司，貨號：SC9117）、腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）（稀釋比1∶500，美國Santa Cruz公司，貨號：SC1350）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）（稀釋比1∶500，美國Abcam公司，貨號：ab1423）。TBST洗滌3次后加入二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，稀釋比1∶5 000，武漢博士德生物工程有限公司，貨號：AR1201）室溫孵育1 h。充分洗滌后，使用ECL發(fā)光成像，X線膠片壓片曝光，利用凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDoc XRS，美國Bio-Rad公司）拍攝并掃描各條帶灰度值。β-actin（稀釋比1∶5 000，美國Santa Cruz公司，貨號：SC81760）為內(nèi)參蛋白，以各組與CU 組的比值作為蛋白相對表達量。

1.10血管緊張素含量測定

取25 mg肝臟樣品勻漿，4℃、3 000 g離心10 min。參照Li等 建立的方法，采用高效液相色譜法（高效液相色譜儀，島津LC-6A型，日本）檢測Ang II和Ang（1-7）含量。色譜柱采用粒徑5 μm的C8反相柱（150 mm×4.6 mm），流動相采用1.0 mmol/L乙腈，60 g/L甲醇，20 mmol/L氫氧化鈉，30 mmol/L醋酸鈉，10 mmol/L醋酸，流速1.0 mL/min。檢測波長為215 nm，柱溫為40℃。分別稱取Ang II和Ang（1-7）標準品制備標準應用液，上述同樣條件繪制標準曲線。計算各樣品中Ang II和Ang（1-7）含量，單位：mg/mL。

1.11統(tǒng)計學分析

使用SPSS 20.0軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理與分析。所有數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標準差”表示。各指標四組間比較采用雙因素方差分析，多重比較使用LSD檢驗，同組干預前后比較采用配對t檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1樣本量分析以及各組體重和能量攝入比較

實驗過程中，由于意外死亡、拒跑等原因，共剔除5只動物，因此最終樣本量n=55，各組分別為CU組（n=15）、CT組（n=14）、HU組（n=14）和HT組（n=12）。實驗結(jié)束后，四組間體重比較無顯著性差異（P>0.05），實驗期間能量攝入比較無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2各組有氧運動能力比較

實驗前各組最大跑速基線值比較無顯著性差異（P>0.05）。與實驗前比較，實驗后CT和HT組最大跑速升高（P<0.05），HU組最大跑速降低（P<0.05）。實驗后組間比較，CT組最大跑速高于CU組（P<0.05），HU組最大跑速均低于其他三組（P<0.05），HT組最大跑速高于CU組和HU組（P<0.05）且與CT組無顯著性差異（P>0.05）。見表2。

2.3各組胰島素敏感性和物質(zhì)代謝參數(shù)比較

與CU和CT組比較，HU組血清胰島素和TAG含量升高（P<0.05）;與HU組比較，HT組血清胰島素和TAG含量降低（P<0.05）。各組血糖濃度以及胰島素敏感性ISI比較均無顯著性差異（P>0.05）。見表3。

2.4各組肝臟代謝參數(shù)與組織病理學比較

與CU和CT組比較，HU和HT組表現(xiàn)出肝臟腫大（肝臟重量增加）（P<0.05），此外，HU組還出現(xiàn)肝糖原和肝臟TAG含量增加（P<0.05）。與HU組比較，HT組肝臟重量無顯著性變化（P>0.05），肝糖原和肝臟TAG含量降低（P<0.05）。見表4。

肝臟HE染色高倍鏡（×400倍）觀察病理組織學變化顯示，正常肝臟細胞（CU和CT組）形態(tài)正常，無脂肪變性，HU組發(fā)生脂質(zhì)積聚，肝細胞腫脹呈圓形，充滿脂肪滴，表現(xiàn)為中度脂肪變性，肝臟脂肪變性指數(shù)明顯升高（P<0.05）。HT組大鼠肝臟細胞形態(tài)與CT組相似，脂肪變性以輕度為主，病變細胞間存在大量正常細胞，與HU組比較，肝細胞形態(tài)明顯改善，肝細胞中脂肪滴減少，肝臟脂肪變性指數(shù)顯著下降（P<0.05）。HE染色肝臟組織病理學變化見圖1，肝臟脂肪變性指數(shù)見圖2。

2.5各組血清、肝臟ACE和ACE2活性比較

各組血清ACE、ACE2活性以及ACE/ACE2活性比值比較均無顯著性差異（P>0.05）。見圖3～5。

與CU和CT組比較，HU組肝臟ACE活性以及ACE/ACE2活性比值升高（P<0.05）;與HU組比較，肝臟ACE活性以及ACE/ACE2活性比值下降（P<0.05）。各組肝臟ACE2活性比較均無顯著性差異（P>0.05）。見圖6～8。

2.6各組蛋白表達量比較

2.6.1RAS軸

與CU和CT組比較，HU組肝臟ACE蛋白表達量上調(diào)（P<0.05），ACE2和Mas蛋白表達量下調(diào)（P<0.05），ACE/ACE2蛋白表達比值以及AT1R/Mas蛋白表達比值升高（P<0.05）;與HU組比較，HT組肝臟ACE蛋白表達量下調(diào)（P<0.05），ACE2和Mas蛋白表達量上調(diào)（P<0.05），ACE/ACE2蛋白表達比值以及AT1R/Mas蛋白表達比值下降（P<0.05）。各組肝臟AT1R蛋白表達量比較均無顯著性差異（P>0.05）。見圖9～14。

2.6.2肝臟葡萄糖輸出

與CU組比較，HU組肝臟PEPCK和GLUT2蛋白表達量上調(diào)（P<0.05）;與HU組比較，HT組肝臟PEPCK和GLUT2蛋白表達量下調(diào)（P<0.05）。各組肝臟G6pase蛋白表達量比較均無顯著性差異（P>0.05）。見圖15～17。

2.6.3促炎癥因子

與CU組比較，HU組肝臟IL-6和TNF-α蛋白表達量上調(diào)（P<0.05）;與HU組比較，HT組肝臟TNF-α蛋白表達量下調(diào)（P<0.05），IL-6表達量無顯著性變化（P>0.05）。見圖18～19。

2.7各組肝臟Ang II和Ang（1-7）含量比較

與CU和CT組比較，HU組肝臟Ang II含量升高（P<0.05），Ang（1-7）含量無顯著性變化（P>0.05），Ang II/Ang（1-7）含量比值升高（P<0.05）;與HU組比較，HT組肝臟Ang（1-7）含量升高（P<0.05），Ang II含量以及Ang II/Ang（1-7）含量比值下降（P<0.05）。見圖20～22。

3討論

本研究的主要發(fā)現(xiàn)是，有氧運動對果糖超負荷NAFLD大鼠模型具有以下作用：（1）使肝組織中ACE活性、蛋白表達量以及AngⅡ含量恢復正常;（2）上調(diào)肝臟ACE2蛋白表達量，繼之增加肝臟Ang（1-7）和Mas受體水平;（3）降低肝臟ACE/ACE2、AngⅡ/Ang（1-7）和AT1R/Mas受體比值;（4）對全身RAS水平并無影響。雖然已有研究表明，RAS參與了代謝綜合征相關肝病的形成過程，但并未檢測肝臟組織中RAS各組分。因此，本研究首次證實，長期有氧運動通過調(diào)控肝臟RAS發(fā)揮肝臟保護作用，進而改善代謝紊亂并抑制NAFLD進展。

3.1有氧運動對果糖超負荷NAFLD大鼠運動能力以及肝臟形態(tài)與代謝的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，與CU組比較，果糖喂養(yǎng)大鼠（HU組）體重并未增加，然而大鼠卻表現(xiàn)出肝臟損傷和亞臨床代謝改變，提示果糖對肝臟代謝的不良影響在一定程度上獨立于體重的變化。值得注意的是，與CU組比較，HU組大鼠最大跑速下降，經(jīng)過8周跑臺運動后，HT組最大跑速較HU組增加，提示有氧運動改善果糖喂養(yǎng)大鼠的有氧運動能力，這與Medeiros等的研究結(jié)果類似。

本研究觀察到HU組葡萄糖濃度正常，但血胰島素濃度升高，即模型組大鼠發(fā)生高胰島素血癥。由于HU組僅出現(xiàn)肝臟葡萄糖代謝改變，因此推測該組大鼠高胰島素血癥可能不足以引起胰島素敏感性的顯著改變以及發(fā)生胰島素抵抗。經(jīng)過跑臺訓練后，HT組高胰島素血癥和胰島素敏感性均得到改善，且達到與CU和CT組動物相似的水平，提示規(guī)律有氧運動有助于預防糖尿病前期進一步發(fā)展甚至得到逆轉(zhuǎn)。有氧運動可明顯減輕果糖誘導的大鼠代謝綜合征病情，其機制與內(nèi)臟脂肪含量降低，高密度脂蛋白膽固醇增加，血漿TAG和胰島素濃度下降，胰島素抵抗以及胰島素介導的信號途徑改善等有關。

未經(jīng)訓練的果糖喂養(yǎng)動物（HU組）表現(xiàn)出肝臟腫大、中度脂肪變性以及血清和肝臟TAG含量升高，組織病理學觀察顯示肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，這與胰島素抵抗和低度炎癥反應狀態(tài)有關。TAG合成途徑改變，外周脂解轉(zhuǎn)運脂質(zhì)以及脂肪外組織脂質(zhì)蓄積（脂毒性），在上述因素共同作用下導致肝臟脂肪酸過度沉積。此外，肝臟的病理變化還與脂肪酶過度活化以及和線粒體β氧化受到抑制有關，從而促進NAFLD的進展。經(jīng)過運動訓練后，HT組上述病理改變減輕，肝臟脂肪變性和TAG積聚得到逆轉(zhuǎn)，肝實質(zhì)形態(tài)基本恢復。

3.2有氧運動對果糖超負荷NAFLD大鼠肝臟RAS的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，果糖超負荷上調(diào)肝臟ACE活性和蛋白表達量并增加AngⅡ含量，然而AT1R蛋白表達水平并未隨之升高。先前的研究表明，肝纖維化大鼠模型ACE/Ang II/AT1R軸表達上調(diào)，并參與肝臟炎癥反應和TAG積聚，進而減少脂肪酸氧化并干擾細胞內(nèi)胰島素信號轉(zhuǎn)導途徑。然而，跑臺訓練后HT組大鼠肝臟ACE和Ang II下降至正常水平，提示運動對肝臟代謝的有益效應與ACE/Ang II/AT1R軸功能恢復有關。此外，HU組大鼠ACE2/Ang（1-7）/Mas受體軸表達顯著下調(diào)。Cao等的研究發(fā)現(xiàn)，ACE2在發(fā)生胰島素抵抗的器官中高表達，推測ACE2一方面通過降低Ang II，另一方面通過產(chǎn)生Ang（1-7）發(fā)揮組織保護效應。與上述假設類似，ACE2/Ang（1-7）/Mas受體軸缺陷的FVB/N小鼠發(fā)生葡萄糖耐量減低、血脂異常、胰島素濃度升高和胰島素敏感性下降。ACE2/Ang（1-7）/Mas受體軸通過蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS-1）介導的胰島素信號途徑改善肝臟胰島素抵抗，進而增加葡萄糖攝取，增強葡萄糖耐量和胰島素敏感性，減少糖原合成并降低肝細胞應激水平。經(jīng)過8周跑臺運動后，HT組大鼠ACE2/Ang（1-7）/Mas受體軸水平升高并基本恢復正常，提示有氧運動通過調(diào)控肝臟ACE2/Ang（1-7）/Mas受體軸對抗果糖超負荷的不利影響并對肝臟組織起保護效應。

值得注意的是，本研究還發(fā)現(xiàn)，喂食果糖的大鼠肝臟ACE/ACE2比值（活性和蛋白表達量）、AngⅡ/Ang（1-7）含量比值和AT1R/Mas受體蛋白表達比值升高，提示肝臟RAS發(fā)生穩(wěn)態(tài)失衡并向經(jīng)典軸（ACE/Ang II/AT1R軸）方向漂移。經(jīng)過8周跑臺運動后，HT組上述指標得到逆轉(zhuǎn)，表明有氧運動促使ACE/Ang II/AT1R軸向ACE2/Ang（1-7）/Mas受體軸轉(zhuǎn)變。上述結(jié)果提示，運動能夠?qū)笰CE/Ang II/AT1R軸的不良作用，而ACE2/Ang（1-7）/Mas受體軸上調(diào)可能是運動發(fā)揮肝臟損傷保護效應以及維持胰島素敏感性的重要分子機制。此外，本研究并未觀察到血清ACE和ACE2活性的變化，推測蛋白酶主要在表達相應受體（AT1R和Mas）的組織局部發(fā)揮其生物學效應。因此，局部組織RAS的改變獨立于全身RAS，即肝臟與全身RAS的變化并無關聯(lián)。

研究報道，Ang II可增加肝臟葡萄糖合成，從而可能引發(fā)胰島素抵抗。本研究對參與糖異生和葡萄糖攝取的關鍵蛋白如PEPCK、G6Pase和GLUT2表達量進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HU組PEPCK和GLUT2表達明顯上調(diào)，說明糖異生代謝增強，這可能是葡萄糖穩(wěn)態(tài)失衡的重要原因之一。此外，果糖的利用率明顯高于葡萄糖，過多的果糖轉(zhuǎn)化為肝糖原，因此本研究中HU組顯示肝糖原含量顯著增加，這與Buziau等的研究結(jié)果一致。上述蛋白表達量在HT組大鼠顯著性下調(diào)，提示維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)是運動防治代謝性疾病的重要生物化學機制。

Bidwell等發(fā)現(xiàn)，運動訓練通過調(diào)控RAS抑制果糖過負荷誘導的炎癥反應。細胞因子TNF-α和IL-6在全身和局部炎癥反應中發(fā)揮關鍵作用，研究證實，肥胖和NAFLD等病理生理狀態(tài)下TNF-α和IL-6表達明顯增加。TNF-α還具有拮抗脂聯(lián)素的作用，干擾脂質(zhì)代謝，并在IRS-1水平上破壞胰島素信號轉(zhuǎn)導通路。饒有興趣的是，注射Ang II的大鼠肝臟IL-6的表達量顯著增加，同時伴隨單核細胞募集并發(fā)生系統(tǒng)炎癥。據(jù)此推測，運動訓練可能在病理條件時發(fā)揮下調(diào)RAS的作用，這在一定程度上有助于改善胰島素敏感性，減輕肝臟脂肪變性以及炎癥反應狀態(tài)。

4結(jié)論

長期有氧運動通過調(diào)控肝臟RAS，即促使ACE/Ang II/AT1R軸向ACE2/Ang（1-7）/Mas受體軸轉(zhuǎn)變而發(fā)揮肝臟保護作用，繼之改善代謝紊亂并抑制NAFLD進展;然而運動的有益效應與全身RAS的變化并無關聯(lián)。

參考文獻：

[1]Kang SH， Cho Y， Jeong SW， et al. From nonalcoholic fatty liver disease to metabolic-associated fatty liver disease： Big wave or ripple？. Clin Mol Hepatol， 2021， 27（2）：257-269.

[2]Taskinen MR， Packard CJ， Borén J. Dietary fructose and the metabolic syndrome. Nutrients， 2019， 11（9）：875-886.

[3]Carbone S， Billingsley HE， Lavie CJ. The effects of dietary sugars on cardiovascular disease and cardiovascular disease-related mortality：Finding the sweet spot. Mayo Clin Proc， 2019， 94（12）：2375-2377.

[4]Buziau AM， Schalkwijk CG， Stehouwer C， et al. Recent advances in the pathogenesis of hereditary fructose intolerance：implications for its treatment and the understanding of fructose-induced non-alcoholic fatty liver disease. Cell Mol Life Sci， 2020， 77（9）：1709-1719.

[5]Cheng PW， Lin YT， Ho WY， et al. Fructose induced neurogenic hypertension mediated by overactivation of p38 MAPK to impair insulin signaling transduction caused central insulin resistance. Free Radic Biol Med， 2017， 112（32）：298-307.

[6]Said MA， Nafeh NY， Abdallah HA. Spexin alleviates hypertension， hyperuricaemia， dyslipidemia and insulin resistance in high fructose diet induced metabolic syndrome in rats via enhancing PPAR- and AMPK and inhibiting IL-6 and TNF-α. Arch Physiol Biochem， 2021， 15（3）：1-6.

[7]Sharma R， Kumari M， Prakash P， et al. Phosphoenolpyruvate carboxykinase in urine exosomes reflect impairment in renal gluconeogenesis in early insulin resistance and diabetes. Am J Physiol Renal Physiol， 2020， 318（3）：F720-731.

[8]Kim M， Do GY， Kim I. Activation of the renin-angiotensin system in high fructose-induced metabolic syndrome. Korean J Physiol Pharmacol， 2020， 24（4）：319-328.

[9]Santos R， Oudit GY， Verano-Braga T， et al. The renin-angiotensin system：going beyond the classical paradigms. Am J Physiol Heart Circ Physiol， 2019， 316（5）：958-970.

[10]Takimoto-Ohnishi E， Murakami K. Renin-angiotensin system research：from molecules to the whole body. J Physiol Sci， 2019， 69（4）：581-587.

[11]Santos R， Sampaio WO， Alzamora AC， et al. The ACE2/angiotensin-（1-7）/Mas axis of the renin-angiotensin system：Focus on angiotensin-（1-7）. Physiol Rev， 2018， 98（1）：505-553.

[12]Wewege MA， Thom JM， Rye KA， et al. Aerobic， resistance or combined training：A systematic review and meta-analysis of exercise to reduce cardiovascular risk in adults with metabolic syndrome. Atherosclerosis， 2018， 274（18）：162-171.

[13]Machado MV， Vieira AB， da Conceio FG， et al. Exercise training dose differentially alters muscle and heart capillary density and metabolic functions in an obese rat with metabolic syndrome. Exp Physiol， 2017， 102（12）：1716-1728.

[14]Azadpour N， Tartibian B， Kosar SN. Effects of aerobic exercise training on ACE and ADRB2 gene expression， plasma angiotensin II level， and flow-mediated dilation：a study on obese postmenopausal women with prehypertension. Menopause， 2017， 24（3）：269-277.

[15]Peng WW， Hong L， Liu GY， et al. Prehypertension exercise training attenuates hypertension and cardiac hypertrophy accompanied by temporal changes in the levels of angiotensin II and angiotensin （1-7）. Hypertens Res， 2019， 42（11）：1745-1756.

[16]Frantz E， Prodel E， Braz ID， et al. Modulation of the renin-angiotensin system in white adipose tissue and skeletal muscle：focus on exercise training. Clin Sci （Lond）， 2018， 132（14）：1487-1507.

[17]Medeiros RF， Gaique TG， Bento-Bernardes T， et al. Aerobic training prevents oxidative profile and improves nitric oxide and vascular reactivity in rats with cardiometabolic alteration. J Appl Physiol （1985）， 2016， 121（1）：289-298.

[18]Osundiji MA， Lam DD， Shaw J， et al. Brain glucose sensors play a significant role in the regulation of pancreatic glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes， 2012， 61（2）：321-328.

[19]Catta-Preta M， Mendonca LS， Fraulob-Aquino J， et al. A critical analysis of three quantitative methods of assessment of hepatic steatosis in liver biopsies. Virchows Arch， 2011， 459（5）：477-485.

[20]Carmona AK， Schwager SL， Juliano MA， et al. A continuous fluorescence resonance energy transfer angiotensin I-converting enzyme assay. Nat Protoc， 2006， 1（4）：1971-1976.

[21]Li S， Zhao W， Tao Y， et al. Fugan Wan alleviates hepatic fibrosis by inhibiting ACE/Ang II/AT-1R signaling pathway and enhancing ACE2/Ang 1-7/Mas signaling pathway in hepatic fibrosis rat models. Am J Transl Res， 2020， 12（2）：592-601.

[22]Luvuno M， Khathi A， Mabandla MV. Diet-induced prediabetes：effects of exercise treatment on risk factors for cardiovascular complications. Nutr Metab （Lond）， 2021， 18（1）：45-55.

[23]Staniic' J， Koric'anac G， C'ulafic' T， et al. Low intensity exercise prevents disturbances in rat cardiac insulin signaling and endothelial nitric oxide synthase induced by high fructose diet. Mol Cell Endocrinol， 2016， 420（16）：97-104.

[24]Fouret G， Gaillet S， Lecomte J， et al. 20-Week follow-up of hepatic steatosis installation and liver mitochondrial structure and activity and their interrelation in rats fed a high-fat-high-fructose diet. Br J Nutr， 2018， 119（4）：368-380.

[25]Frantz ED， Penna-de-Carvalho A， Batista Tde M， et al. Comparative effects of the renin-angiotensin system blockers on nonalcoholic fatty liver disease and insulin resistance in C57BL/6 mice. Metab Syndr Relat Disord， 2014， 12（4）：191-201.

[26]Shim KY， Eom YW， Kim MY， et al. Role of the renin-angiotensin system in hepatic fibrosis and portal hypertension. Korean J Intern Med， 2018， 33（3）：453-461.

[27]Cao X， Yang FY， Xin Z， et al. The ACE2/Ang-（1-7）/Mas axis can inhibit hepatic insulin resistance. Mol Cell Endocrinol， 2014， 393（1-2）：30-38.

[28]Santos SH， Fernandes LR， Mario EG， et al. Mas deficiency in FVB/N mice produces marked changes in lipid and glycemic metabolism. Diabetes， 2008， 57（2）：340-347.

[29]Souza-Mello V. Hepatic structural enhancement and insulin resistance amelioration due to AT1 receptor blockade. World J Hepatol， 2017， 9（2）：74-79.

[30]Schultz A， Neil D， Aguila MB， et al. Hepatic adverse effects of fructose consumption independent of overweight/obesity. Int J Mol Sci， 2013， 14（11）：21873-21886.

[31]Von Ah Morano AE， Dorneles GP， Peres A， et al. The role of glucose homeostasis on immune function in response to exercise：The impact of low or higher energetic conditions. J Cell Physiol， 2020， 235（4）：3169-3188.

[32]Bidwell AJ， Fairchild TJ， Redmond J， et al. Physical activity offsets the negative effects of a high-fructose diet. Med Sci Sports Exerc， 2014， 46（11）：2091-2098.

[33]Beier JI， Banales JM. Pyroptosis：An inflammatory link between NAFLD and NASH with potential therapeutic implications. J Hepatol， 2018， 68（4）：643-645.

[34]Alipourfard I， Datukishvili N， Mikeladze D. TNF-α downregulation modifies insulin receptor substrate 1 （IRS-1） in metabolic signaling of diabetic insulin-resistant hepatocytes. Mediators Inflamm， 2019， 35（14）：356-368.

[35]Moreno M， Ramalho LN， Sancho-Bru P， et al. Atorvastatin attenuates angiotensin II-induced inflammatory actions in the liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol， 2009， 296（2）：G147-156.