朱海佳 崔群香 成紅林 趙妍 何蕓 邵英 錢麗君 柏文軍

摘 要 以茄子花藥培養(yǎng)再生的單倍體植株D5為實(shí)驗(yàn)材料，采用壓片法和冷凍切片法對(duì)其花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂過程及雄配子體的形態(tài)和活力等進(jìn)行觀察，綜合比較分析不同發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞學(xué)及形態(tài)特征，并用D4、D8和D23單倍體植株對(duì)減數(shù)分裂及其結(jié)束的特征進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明：D5體細(xì)胞染色體數(shù)目為12，證實(shí)其為單倍體植株;茄子單倍體花粉母細(xì)胞的胞質(zhì)分裂方式屬于同時(shí)型，四分體以正四面體型或十字交叉型為主;分裂末期常形成大小不一的小孢子，綜合證實(shí)單倍體高度不育的特點(diǎn)。D5單倍體植株花粉活力僅15%，且有活力的花粉形狀不整齊;其果實(shí)褐變速度快且結(jié)實(shí)率低。單倍體植株花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程與花蕾大小有密切聯(lián)系，當(dāng)花柄基部至合抱的花瓣前端長(zhǎng)度較花萼筒長(zhǎng)度短1～2 mm時(shí)，是觀察D4、D5、D8和D23茄子花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的最佳時(shí)期，此期的花蕾形態(tài)特征是花瓣筒端粗度明顯小于花萼片基部的花蕾粗度，花萼前端的個(gè)別裂片開始與其他裂片分離;當(dāng)從花萼側(cè)面觀察到花瓣筒時(shí)，減數(shù)分裂均已經(jīng)完成。

關(guān)鍵詞 茄子;單倍體植株;花粉母細(xì)胞;形態(tài)觀察;減數(shù)分裂

茄子（Solanum melongena L.）是世界范圍內(nèi)廣泛種植的重要蔬菜作物，在亞洲蔬菜生產(chǎn)中具有十分重要的地位[1]。中國茄子栽培歷史久遠(yuǎn)，是茄子次生起源地，茄子類型和品種眾多[2]。茄子果實(shí)營養(yǎng)豐富，其中富含的維生素E、維生素P和龍葵堿等成分可以起到抗氧化等保健作用[3]。

自Guha和Maheshwari[4]在1964年通過花藥培養(yǎng)獲得首例單倍體植株以來，運(yùn)用單倍體技術(shù)逐漸成為育種上的熱點(diǎn)[5]。在茄子上，Raina和Iyer[6]首次通過花藥培養(yǎng)途徑獲得單倍體植株。研究表明單倍體植物常常高度不育，如細(xì)胞學(xué)鑒定表明甜瓜單倍體植株的雄花和雌花均敗育[7]，西葫蘆單倍體植株也出現(xiàn)花粉敗育的現(xiàn)象[8]。單倍體具有較高的研究?jī)r(jià)值，但有性繁殖保存困難，需要加倍成二倍體后才能有效保存和研究利用。茄子單倍體植株加倍困難，盡管能夠利用扦插等方式進(jìn)行繁殖，但繁殖系數(shù)很低，且對(duì)保存環(huán)境要求高，因此極大地限制了茄子單倍體的研究和利用。

研究發(fā)現(xiàn)，茄子單倍體植株間性狀差異明顯，只有部分單倍體植株能夠結(jié)實(shí)，且僅極少量植株的果實(shí)中有成熟度較高的不育種子。為了探討茄子單倍體植株難以座果和種子敗育的原因，從而有針對(duì)性地采取措施，提高花粉和卵細(xì)胞活力、種子活力，實(shí)現(xiàn)自交繁殖，有必要對(duì)單倍體植株的小孢子產(chǎn)生和雄配子體發(fā)育過程進(jìn)行詳細(xì)觀察分析。

目前，關(guān)于茄子單倍體植株減數(shù)分裂、雄配子體發(fā)育過程及花粉活力的研究未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以花藥培養(yǎng)再生的茄子二倍體植株84-1自交后產(chǎn)生的單倍體植株D5為試材，采用冷凍切片法和壓片法等對(duì)其花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂和雄配子體發(fā)育過程進(jìn)行觀察，以揭示其花粉和種子活力降低的原因，試圖為單倍體植株的有效利用提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試材料為本實(shí)驗(yàn)室培育保存的單倍體植株D5，該植株春夏季開花但不結(jié)實(shí)，而可在秋季低溫環(huán)境下座果。為探索總結(jié)從D5植株獲得的減數(shù)分裂結(jié)束前后的花蕾特征，選擇由花藥培養(yǎng)直接再生出的單倍體植株D4、D8和D23的花蕾，用壓片法和染色法進(jìn)行觀察。

1.2 花蕾形態(tài)觀察

為了探究花蕾形態(tài)與細(xì)胞發(fā)育階段間的聯(lián)系，采集D5、D8和D23植株上不同大小的花蕾，并將其編號(hào)。用游標(biāo)卡尺測(cè)定D5花蕾總長(zhǎng)、萼筒長(zhǎng)、花萼基部至抱合的花瓣前端長(zhǎng)度、花萼最粗部位的直徑、合生花瓣直徑等，并通過冷凍切片法觀察其細(xì)胞發(fā)育時(shí)期，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)D5植株的花蕾減數(shù)分裂前后的形態(tài)特征，并用D4、D8和D23植株上的花蕾進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)選取不同形態(tài)的花蕾，用壓片法（方法見“1.5”）觀察花藥中與生殖相關(guān)的細(xì)胞發(fā)育時(shí)期，然后進(jìn)行對(duì)應(yīng)分析（方法見“1.5”）。

1.3 細(xì)胞發(fā)育時(shí)期鑒定

對(duì)D5各個(gè)發(fā)育時(shí)期的花藥進(jìn)行冷凍切片法觀測(cè)。冷凍切片法采用新鮮的花藥，使用包埋劑將花藥覆蓋并完全冷凍后，置于切片機(jī)上切片，將切片轉(zhuǎn)移到載玻片上，用卡寶品紅染色，隨后用Nikon 80i光學(xué)顯微鏡觀察鑒定。

1.4 花粉活力的測(cè)定

取D5植株上盛開花朵的花粉，置于載玻片上，參照申書興[9]的方法，用TTC染色法測(cè)定花粉的活力。其中被染成紫紅色的花粉為有活力的花粉，無法被染色的花粉為無活力的花粉。計(jì)數(shù)5個(gè)視野里的花粉粒（總數(shù)不少于1 000粒），根據(jù)染色結(jié)果計(jì)算花粉的活力（染色花粉粒數(shù)/花粉?？倲?shù)×100%）。

1.5 減數(shù)分裂鑒定和染色體計(jì)數(shù)

使用壓片法對(duì)D4、D8和D23各個(gè)發(fā)育時(shí)期的花藥進(jìn)行觀測(cè)，并對(duì)D5進(jìn)行減數(shù)分裂鑒定和染色體計(jì)數(shù)，參照申書興[9]的方法，采用卡諾固定液固定花藥，卡寶品紅染色液染色觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 花蕾形態(tài)及細(xì)胞發(fā)育階段鑒定

D5花蕾測(cè)定結(jié)果見表1。觀察發(fā)現(xiàn)，4號(hào)和5號(hào)花蕾中，花粉母細(xì)胞處于減數(shù)分裂時(shí)期，6號(hào)之后的花蕾，都處于小孢子發(fā)育時(shí)期。茄子花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程與花蕾大小有密切關(guān)系，當(dāng)花萼基部至合抱的花瓣前端長(zhǎng)度比其至花萼筒長(zhǎng)度短1～2 mm時(shí)，觀察減數(shù)分裂效果較好，此時(shí)花萼裂片前端基本抱合，僅個(gè)別裂片與其他裂片分離。當(dāng)多數(shù)花萼裂片開始分離時(shí)，則減數(shù)分裂結(jié)束，進(jìn)入小孢子發(fā)育階段。

用D4、D8和D23驗(yàn)證的結(jié)果見圖1和表2。圖1中黑色箭頭所示的D4花蕾中的母細(xì)胞處于減數(shù)分裂時(shí)期，而其余花蕾均已經(jīng)進(jìn)入小孢子及隨后的發(fā)育階段;白色箭頭所示的花蕾盡管與D4上采摘的最小花蕾大小相似，但其已經(jīng)完成減數(shù)分裂，仔細(xì)觀察發(fā)現(xiàn)其花瓣筒已經(jīng)露出花萼筒，其余所有花瓣筒超出花萼筒的花蕾均已經(jīng)完成減數(shù)分裂。D8植株上采摘的1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、7號(hào)和8號(hào)這5個(gè)花蕾中花粉母細(xì)胞處于減數(shù)分裂時(shí)期，其余11個(gè)花蕾均完成分裂;D23植株上的1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)和10號(hào)這4個(gè)花蕾處于減數(shù)分裂時(shí)期，其余6個(gè)花蕾中的花粉母細(xì)胞均完成分裂。形態(tài)特征與發(fā)育時(shí)期的相關(guān)性，D4、D8、D23植株與D5植株類似：花萼裂片前端基本抱合，僅個(gè)別裂片與其他裂片分離時(shí)處于減數(shù)分裂時(shí)期;當(dāng)多數(shù)花萼裂片開始分離時(shí)，則減數(shù)分裂結(jié)束，進(jìn)入小孢子發(fā)育階段。該指標(biāo)是否適用于二倍體茄子的花蕾有待于驗(yàn)證。

2.2 單倍體花藥、小孢子和花粉形態(tài)鑒定

對(duì)花藥和花粉進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，單倍體的花藥結(jié)構(gòu)正常（圖2-1），但花粉母細(xì)胞由于減數(shù)分裂不正常，產(chǎn)生不正常的四分體，甚至“二分體”（圖2-2， 2-4， 2-5）。小孢子多數(shù)不能正常發(fā)育（圖2-3， 2-6），僅觀察到單核靠邊期（圖2-7）和少量二核花粉，多數(shù)小孢子解體（圖2-3），最終只有少量的花粉發(fā)育成具有3萌發(fā)溝的形態(tài)正常的成熟花粉（圖2-8）。

2.3 單倍體植株的花粉活力鑒定

花粉經(jīng)TTC染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，花粉粒的大小和形狀有明顯的不同。其中有活力的花粉粒邊緣為紅色，中部為黃褐色，而非活性花粉則全部為黃褐色（見圖3， 箭頭示有活力的花粉）。通過計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，有活力的花粉占15%，形狀和大小差異較大，其結(jié)出果實(shí)數(shù)量少，果實(shí)褐變速度快，果實(shí)無籽，不能產(chǎn)生后代。

2.4 單倍體植株D5減數(shù)分裂過程及染色體數(shù)目鑒定

由于冷凍切片采取的花蕾僅切到減數(shù)分裂前期、四分體和小孢子時(shí)期的花藥，因此鑒定染色體數(shù)目及對(duì)減數(shù)分裂整個(gè)過程的觀察，主要依據(jù)壓片觀察的結(jié)果。壓片結(jié)果顯示，單倍體植株D5染色體復(fù)制正常，但聯(lián)會(huì)開始即出現(xiàn)與二倍體不同的現(xiàn)象，中期Ⅰ單價(jià)體在細(xì)胞中的排列位置分散（見圖4-4），但能夠清楚地區(qū)分出12個(gè)單價(jià)體（見圖5-1， 5-2， 5-3），因此D5植株的體細(xì)胞染色體數(shù)目為12，證明該植株確實(shí)為單倍體。

由圖5可知，單倍體植株D5減數(shù)分裂過程不正常，并不一定產(chǎn)生具有4個(gè)細(xì)胞的四分體（圖5-14， 示5核花粉母細(xì)胞），可能產(chǎn)生各種類型的“四分體”（圖5-18）。

2.5 D5植株花粉敗育的原因

在觀察單倍體植株D5的減數(shù)分裂過程中發(fā)現(xiàn)：中期Ⅰ細(xì)胞中有12個(gè)單價(jià)體，證實(shí)該植株確實(shí)為單倍體植株;但中期Ⅰ的12個(gè)單價(jià)體并未排列在赤道面附近，且排列紊亂，染色體聚成2團(tuán)或3團(tuán)，或各自分散（見圖5-1至5-7）;根據(jù)中期Ⅱ染色體分布情況（見圖5-14， 5-15）推測(cè)，后期I以單價(jià)體分離為主（見圖5-7至5-12），存在個(gè)別單價(jià)體染色單體分離現(xiàn)象（見圖5-13）;單價(jià)體分離形式各異，以5/7分離多見，圖5-15表示5/7分離的中期Ⅱ，圖5-16和圖5-17表示后期Ⅱ，顯示后期Ⅱ存在非染色單體分離現(xiàn)象，導(dǎo)致四分體中染色體數(shù)目嚴(yán)重失衡，產(chǎn)生形態(tài)不正常的四分體（見圖5-18），甚至是二分體。

從減數(shù)分裂中期Ⅰ開始，D5植株的減數(shù)分裂就出現(xiàn)不正常，未發(fā)現(xiàn)正常的后期Ⅰ細(xì)胞，說明植株敗育時(shí)期在四分體形成以前，因此敗育比較徹底。推測(cè)有活力的花粉主要來源于后期I 按照12/0或11/1分離的花粉母細(xì)胞。這兩類分離方式占花粉母細(xì)胞的比例為2/7，約產(chǎn)生1/7有活力的花粉，與觀察統(tǒng)計(jì)出的花粉活力數(shù)值15%較為接近。

3 討論

單倍體是進(jìn)行體細(xì)胞遺傳研究和突變育種的理想材料，花藥和小孢子培養(yǎng)技術(shù)則是獲得單倍體的重要途徑[10-11]。油菜小孢子培養(yǎng)獲得的單倍體可應(yīng)用于雙單倍體育種、誘變育種和轉(zhuǎn)基因育種等研究[12]。相對(duì)于正常植株，單倍體植株僅含有半數(shù)的染色體，因此單倍體植株比正常植株在形態(tài)上較為矮小，且生育率低;同時(shí)在后代遺傳及生理生化上也表現(xiàn)出一定的差異[13-14]。

張新宇等研究表明山羊豆屬植物減數(shù)分裂過程存在一定規(guī)律，與花蕾大小和顏色密切相關(guān)[15]。草本植物關(guān)蒼術(shù)的減數(shù)分裂與花蕾大小有密切關(guān)系，在花蕾長(zhǎng)4～12 mm時(shí)，花粉母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂時(shí)期[16]。本研究發(fā)現(xiàn)茄子花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程也與花蕾大小有密切關(guān)系，當(dāng)花柄基部至合抱的花瓣前端長(zhǎng)度比花柄基部至花萼筒長(zhǎng)度短1～2 mm時(shí)，觀察減數(shù)分裂效果較好，此期花蕾的形態(tài)特征是花萼裂片前端基本抱合，僅個(gè)別裂片與其他裂片分離，可以以此作為減數(shù)分裂觀測(cè)取材的依據(jù)，也是進(jìn)行秋水仙素處理花蕾誘導(dǎo)染色體數(shù)目加倍的最佳時(shí)期;而當(dāng)多數(shù)花萼裂片開始分離時(shí)，則減數(shù)分裂結(jié)束，進(jìn)入小孢子發(fā)育階段，對(duì)于二倍體或多倍體植株，這是采摘花蕾進(jìn)行花藥或小孢子培養(yǎng)的最小花蕾指標(biāo)，但該指標(biāo)是否適用于所有不同倍性的茄子植株，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)單倍體茄子植株由于減數(shù)分裂不正常，不能形成正常的小孢子，因此不適宜進(jìn)行花藥培養(yǎng)或小孢子培養(yǎng)。

本研究所用的D5單倍體植株春季不結(jié)實(shí)，至秋季11月開始坐果，其花粉活力極低（15%）。切片觀察顯示單倍體茄子的胞質(zhì)分裂方式屬于同時(shí)型，后期II以單價(jià)體分離為主，也存在染色單體分離現(xiàn)象，這可能是造成該單倍體植株不育的主要原因。分裂末期常形成大小不一的小孢子，且多數(shù)小孢子處于單核靠邊期，其后發(fā)育即表現(xiàn)不正常，逐漸解體敗育，證實(shí)單倍體高度不育的特點(diǎn)。張彩霞等研究表明減數(shù)分裂過程中多分孢子、落后染色體等異?，F(xiàn)象會(huì)不同程度地促使小孢子中遺傳物質(zhì)不均衡，從而形成沒有育性的孢子，這是引起花粉育性低的重要原因[17]。本研究所用的D5植株春季不能結(jié)實(shí)，是否與花粉活力更低有關(guān)，需要測(cè)定全生育期花粉活力才能驗(yàn)證;另外探討環(huán)境等對(duì)花粉活力的影響，并采取措施提高花粉活力，使單倍體植株能夠通過有性繁殖加倍為二倍體，是提高茄子單倍體植株保存和利用效率的新思路和新途徑，值得進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：丁志祥）