楊亞琴 馮慧慧 劉進璽 馬 瑩 董小海 曹 秀 鐘紅艦

（河南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室(鄭州)，河南鄭州450002）

伏馬毒素（Fumonisin）是20 世紀80 年代末發(fā)現(xiàn)的一類主要由串珠鐮刀菌、多育鐮刀菌和輪狀鐮刀菌在一定溫度和濕度條件下產(chǎn)生的水溶性次級代謝物，是由不同多氫醇和丙三羧酸組成的結構類似的雙酯化合物[1-2]。已發(fā)現(xiàn)的28種伏馬毒素類似物中，B族伏馬毒素是野生型菌株產(chǎn)量最豐富的，主要以伏馬毒素B1（FB1）、伏馬毒素B2（FB2）、伏馬毒素B3（FB3）形式存在。研究表明，伏馬毒素具有很強的神經(jīng)毒性、肺毒性、免疫毒性和致癌性等[3～5]，世界衛(wèi)生組織（WHO）癌癥研究機構（IARC）于1993 年就已將其劃為2B 類致癌物。伏馬毒素普遍存在于玉米、小麥、水稻等谷類作物中，而谷類作物及其制品作為飼料的重要來源，致使伏馬毒素成為污染飼料的主要真菌毒素之一，對動物和人類健康均產(chǎn)生潛在危害[6-8]。目前，我國對飼料原料玉米及其加工產(chǎn)品中FB1 和FB2 總量的限量值為60 mg/kg；飼料產(chǎn)品豬、兔、馬配合飼料中FB1 和FB2總量的限量值為5 mg/kg，家禽配合飼料限量值為20 mg/kg，魚配合飼料限量值為10 mg/kg；而小麥及其制品中伏馬毒素的限量則未做明確規(guī)定[9]。

伏馬毒素的常用分析方法有酶聯(lián)免疫法[10]、氣相色譜法[11]、液相色譜法[12～14]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-16]等。其中，酶聯(lián)免疫法操作簡單、快速，但其準確度較低；氣相色譜法一般需要前處理過程中對目標化合物進行衍生化反應，方法穩(wěn)定性較差；液相色譜法通常采用柱前或柱后衍生的方法進行測定，樣品提取液多采用免疫親和柱進行凈化，分析成本偏高；而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其選擇性好、抗干擾能力強、靈敏度高等特點，已成為近年來谷類作物中真菌毒素測定的主要研究方法[17-19]。本研究選取飼料用玉米和小麥麩皮為對象，針對樣品基質(zhì)的特點，采用分散固相萃取凈化管和PRIME HLB固相萃取柱有效去除玉米和小麥麩皮樣品中碳水化合物、蛋白質(zhì)、磷脂、植物纖維等干擾物，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀準確進行FB1、FB2和FB3的定性定量分析。該方法操作便捷，凈化效果好，回收率和靈敏度高，適用于玉米和小麥麩皮樣品中伏馬毒素的批量檢測分析，易于在農(nóng)產(chǎn)品和飼料分析檢測領域推廣應用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Shimadzu LCMS-8050 型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（日本島津公司）；PGC 4502i電子天平[精確至0.01 g，英國艾德姆衡器（武漢）有限公司]；HY-6型雙層搖瓶機（金壇市醫(yī)療儀器廠）；飛鴿GL-21B型高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；QGC-36T氮氣吹干儀（上海泉島公司）；SKQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SK-1快速混勻器（金壇市白塔新寶儀器廠）；Milli-Q超純水發(fā)生器（美國Millipore公司）。

伏馬毒素（FB1、FB2、FB3）標準溶液（50 μg/mL）（青島普瑞邦生物工程有限公司）；甲醇、乙腈：色譜純（德國默克股份兩合公司）；甲酸：分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；分散固相萃取凈化管（含500 mg五水硫酸鎂、250 mg 氯化鈉、250 mg 檸檬酸三鈉和250 mg C18）（吳橋津楊過濾器材廠）；PRIME HLB 固相萃取柱（60 mg/3 mL）（美國Waters公司）；實驗室用水為Milli-Q超純水；玉米與小麥麩皮樣品，市售。

1.2 樣品前處理

稱取5 g粉碎后的樣品，放入50 mL具塞塑料離心管中，加入15 mL水浸泡1 h，加入15 mL 2%甲酸乙腈溶液，充分混勻1 min，室溫下超聲提取10 min、振蕩提取30 min，然后于5 000 r/min離心5 min。

取5 mL提取液至分散固相萃取凈化管，渦旋2 min，于5 000 r/min離心5 min，準確吸取上層清液2 mL，40 ℃氮吹至干，用1 mL甲醇超聲復溶，過經(jīng)0.5 mL甲醇潤濕后的PRIME HLB固相萃取柱凈化，收集流出液，相同體積加水混勻后，過0.22 μm微孔濾膜待上機測定。

1.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱，Waters CORTECS UPLC C18柱（50 mm×2.1 mm, 1.6 μm）；柱溫：40 ℃；進樣體積：1 μL；流動相A：甲醇；流動相B：含5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序：0～1 min，10% A；1～2 min，10%～38% A；2～5 min，38%～45% A；5～10 min，45%～90% A；10～11 min，90% A；11～11.5 min，90%～10%A；11.5～16 min，10% A；流速為0.3 mL/min。

電噴霧離子源，正離子模式（ESI+）；掃描方式：多反應監(jiān)測（MRM）；離子化電壓：4 kV；霧化氣流速3 L/min；干燥氣流速10 L/min；加熱氣流速10 L/min；脫溶劑管溫度250 ℃；接口溫度300 ℃；加熱模塊溫度400 ℃；碰撞誘導電離氣體壓力270 kPa；質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

2 結果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化（見表1）

試驗采用電噴霧離子源正離子模式（ESI+）掃描分析3種伏馬毒素化合物。通過對質(zhì)量濃度為500 ng/mL的3種化合物標準溶液分別進行全掃描得到[M+H]+前體離子，再對前體離子進行二級質(zhì)譜掃描，通過優(yōu)化條件得到產(chǎn)物離子及相應的電壓、碰撞能量等參數(shù)，使每種化合物的前體離子與特征產(chǎn)物離子產(chǎn)生的離子對強度達到最大，選擇其中相對豐度最強的產(chǎn)物離子作為定量離子，優(yōu)化后的參數(shù)見表1。

2.2 色譜條件優(yōu)化（見圖1）

采用質(zhì)量濃度為50 ng/mL的溶劑混合標準溶液，保持其他儀器條件不變，比較了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-含5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液3種流動相體系在相同液相分離程序下，目標化合物的出峰情況。通過對比，使用甲醇-含5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液流動相體系產(chǎn)生的峰形要優(yōu)于使用甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液流動相體系產(chǎn)生的峰形。伏馬毒素在電噴霧離子源正離子模式（ESI+）下產(chǎn)生的是[M+H]+離子，在甲醇和水體系中添加容易揮發(fā)的甲酸有助于伏馬毒素的離子化，適量乙酸銨的加入能有效地改善伏馬毒素的峰形。因此，試驗最終采用甲醇-含5 mmol/L 乙酸銨的0.1%甲酸水溶液作為流動相，在1.3 試驗梯度洗脫程序條件下，3 種伏馬毒素化合物的分離效果良好，色譜圖峰形對稱且靈敏度高，如圖1所示。

表1 FB1、FB2、FB3的質(zhì)譜參數(shù)

圖1 FB1、FB2、FB3混合標準溶液（50 ng/mL）色譜

2.3 提取溶劑的選擇（見圖2）

乙腈-水混合提取液在過量氯化鈉等無機鹽存在時，根據(jù)鹽析效應乙腈和水發(fā)生兩相分離，水溶性雜質(zhì)溶于水相、目標化合物溶于乙腈相，以達到初步分離凈化的目的。本試驗在相同空白基質(zhì)樣品中添加3 種伏馬毒素（添加濃度為100 μg/kg），考察了經(jīng)水浸泡后，相同體積乙腈、0.5%甲酸乙腈、2%甲酸乙腈3種提取溶劑對玉米和小麥麩皮樣品中的伏馬毒素目標化合物的提取效果。按照1.2 前處理步驟，樣品提取液經(jīng)分散固相萃取凈化管凈化后，吸取上層乙腈相吹干，甲醇復溶直接過PRIME HLB固相萃取柱，去除玉米和小麥麩皮樣品中的蛋白質(zhì)、磷脂等干擾物，相同體積加水混勻后上機。測定結果表明，隨著水-乙腈溶液中甲酸含量的增加，玉米和小麥麩皮樣品中伏馬毒素的回收率均呈現(xiàn)上升趨勢，如圖2。因此，本試驗最終選擇水-2%甲酸乙腈（50∶50，V/V）作為樣品中伏馬毒素測定的提取溶劑。

圖2 不同提取溶劑對玉米（上）和小麥麩皮（下）中3種伏馬毒素（添加濃度100 μg/kg）回收率的影響

2.4 線性范圍、檢出限及定量限（見圖3、表2）

取適量的伏馬毒素（FB1、FB2、FB3）標準溶液，分別用空白玉米和小麥麩皮樣品基質(zhì)溶液配制成質(zhì)量濃度分別為1.0、2.5、5.0、10、25、50、100、250 ng/mL的系列混合標準工作溶液。以質(zhì)量濃度為橫坐標（X，ng/mL），目標物定量離子對的峰面積為縱坐標（Y）繪制基質(zhì)標準曲線（見圖3）。結果表明，玉米基質(zhì)溶液中，3 種伏馬毒素目標物在1.0～250 ng/mL 濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性，F(xiàn)B1、FB2、FB3 的相關系數(shù)（R2）分別為0.999 2、0.999 3、0.999 2；小麥麩皮基質(zhì)溶液中，3種伏馬毒素目標物在1.0～250 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性關系亦表現(xiàn)良好，F(xiàn)B1、FB2、FB3 的相關系數(shù)（R2）分別為0.999 6、0.999 1、0.999 3（見表2）。由于不同基質(zhì)溶液中，3 種伏馬毒素在相同濃度下的信號響應差異明顯，在進行實際樣品含量測定時，要選擇相同基質(zhì)的基質(zhì)標準曲線準確定量評價。當陽性樣品中目標物的上機濃度大于此線性范圍上限時，應采取減小稱樣量或?qū)δ繕朔治鑫镞M行稀釋處理后重新進行測定。

圖3 3種伏馬毒素的玉米和小麥麩皮基質(zhì)溶液標準曲線

采用向空白玉米和小麥麩皮樣品中逐級降低加入標液濃度的方法來確定檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。以3 倍信噪比（S/N=3）對應的目標物濃度作為檢出限，以10倍信噪比（S/N=10）對應的目標物濃度作為定量限，3種伏馬毒素在玉米和小麥麩皮樣品中的方法檢出限均為1.0 μg/kg，方法定量限均為3.0 μg/kg，滿足飼料中伏馬毒素的分析要求[20]。

2.5 方法回收率與精密度（見表3）

在確定的試驗條件下，分別向空白玉米和小麥麩皮樣品中添加FB1、FB2、FB3混合標準溶液至3.0、20、100 μg/kg 3個濃度水平，每個添加濃度水平重復3次，進行方法回收率與精密度測定（表3）。3種伏馬毒素在玉米基質(zhì)中3 個添加濃度水平的回收率范圍在83.65%～107.3%，相對標準偏差RSD 范圍在2.03%～7.00%；在小麥麩皮基質(zhì)中3 個添加濃度水平的回收率范圍在88.79%～103.5%，RSD范圍在1.41%～8.98%，表明方法準確可靠，重復性良好。

2.6 實際樣品檢測

應用本研究所建立的測定方法對當?shù)厥袌錾腺徺I的15個玉米、15個小麥麩皮樣品中FB1、FB2和FB3進行了檢測。結果顯示，玉米樣品中3種伏馬毒素均全部檢出，以總量計，其含量水平范圍在266～5 830 μg/kg。小麥麩皮樣品中FB1 檢出7 個、FB2 檢出4 個、FB3 檢出5 個，伏馬毒素總檢出率為46.67%，檢出樣品中伏馬毒素總量的污染水平范圍在13.9～170 μg/kg。參考我國飼料產(chǎn)品中FB1 和FB2 總量的限量值范圍（5～60 mg/kg）[9]，除1 個玉米樣品伏馬毒素總量5.83 mg/kg超出飼料產(chǎn)品最低限量值外，其余29 個檢測樣品均滿足飼料標準的限量要求。

3 討論

本研究在參考文獻的基礎上，通過對儀器條件、提取溶劑的選擇與優(yōu)化，確定了飼料用玉米和小麥麩皮中伏馬毒素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。樣品經(jīng)水-2%甲酸乙腈（50∶50，V/V）提取，分散固相萃取凈化管鹽析效應下去除提取液中的水溶性雜質(zhì)，上層乙腈提取液用甲醇進行溶劑轉(zhuǎn)換后，過PRIME HLB固相萃取柱以除去蛋白質(zhì)、磷脂等干擾物，流出液同體積加水混勻后采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進行分析，基質(zhì)標準曲線外標法定量。相較于國家標準的檢測方法[15，20]，該方法減少了操作步驟和有機溶劑的使用，重現(xiàn)性好、靈敏度高，完全符合我國對飼料中伏馬毒素含量的檢測要求，且方法檢測效率高，適合批量樣品的處理與分析。

4 結論

本研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀建立了飼料用玉米和小麥麩皮中3種伏馬毒素的測定方法。結果顯示，該方法中伏馬毒素（FB1、FB2 和FB3）的檢出限均為1.0 μg/kg，定量限均為3.0 μg/kg，在3.0、20、100 μg/kg 3個添加濃度水平下，玉米和小麥麩皮樣品平均回收率在83.65%～107.3%之間，RSD在1.41%～8.98%之間，能夠滿足飼料用玉米和小麥麩皮中伏馬毒素的檢測要求，亦可為其他飼料基質(zhì)中伏馬毒素含量的測定提供參考。

表2 玉米和小麥麩皮基質(zhì)溶液中3種伏馬毒素的線性方程、濃度范圍及相關系數(shù)

表3 玉米和小麥麩皮中3種伏馬毒素的回收率和相對標準偏差（n=3）