劉 琦 趙靈燕 程佳穎 周旭穎 隋 靜 高玉敏

腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要機(jī)制之一是免疫監(jiān)視功能的損害[1]，而與免疫系統(tǒng)有直接聯(lián)系腫瘤之一是腎癌(renal cell cancer，RCC)。全球每年有超過(guò)10萬(wàn)人死于腎腫瘤[2]，其中>90%是腎癌；我國(guó)腎癌發(fā)病死亡水平較低，但較以往有巨大上升[3]。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4)基因存在于編碼免疫調(diào)節(jié)分子的染色體2q33上，由四個(gè)外顯子組成，它們編碼不同的功能結(jié)構(gòu)域：先導(dǎo)序列、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域[4]。此前的研究證據(jù)表明，CTLA-4在T細(xì)胞增殖和活化的負(fù)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，通過(guò)其在T調(diào)節(jié)細(xì)胞上的組成性表達(dá)間接控制效應(yīng)T細(xì)胞[5]。然而，CTLA4也可能提高T細(xì)胞活化閾值，從而抑制抗腫瘤免疫，增加腫瘤易感性[6]。CTLA-4中的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與自身免疫性疾病和癌癥的易感性有關(guān)[7-8]。

此前的研究證實(shí)了CTLA-4基因多態(tài)性與多種癌癥[8-12]的易感性相關(guān)。到目前為止國(guó)內(nèi)鮮有研究顯示CTLA-4基因多態(tài)性與腎癌的關(guān)系。本研究將探討CTLA-4基因rs5742909、rs231775位點(diǎn)與腎癌易感性的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

采用病例對(duì)照研究方法，于2018年至2019年分別收集內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院和內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院新發(fā)腎癌患者96例，均經(jīng)病理組織學(xué)確診，并以問(wèn)卷調(diào)查的形式記錄人口學(xué)資料，排除其他腫瘤史者、患血液病及自身免疫病者、轉(zhuǎn)移而來(lái)的腎癌者、術(shù)前放療者。按照1∶1匹配原則，選擇對(duì)照人群96例，為同時(shí)期前來(lái)該醫(yī)院體檢中心期體檢的健康人群，均無(wú)惡性腫瘤史、血液病及自身免疫病史者。兩組人群性別、民族匹配，年齡相差3歲，且彼此之間無(wú)血緣關(guān)系。所有研究對(duì)象均簽署書(shū)面知情同意書(shū)，本研究獲內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 基因分型 按照DNA快速提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)的步驟從靜脈血中提取基因組DNA，并經(jīng)紫外線(xiàn)分光光度計(jì)定量。上海生工生物工程股份公司預(yù)先設(shè)計(jì)了引物，對(duì)CTLA-4基因rs5742909、rs231775兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，采用多重高溫連接酶檢測(cè)反應(yīng)技術(shù)(imLDR)技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行分型檢測(cè)。產(chǎn)物由上海天昊生物科技有限公司測(cè)序確認(rèn)。

1.2.2 Hardy-Weinberg平衡 CTLA-4基因rs574290-9、rs231775位點(diǎn)在腎癌組和對(duì)照組人群中分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P=0.298、0.686)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用擬合優(yōu)度χ2進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，以方差分析或者χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)病例組與對(duì)照組之間的人口分布的特征及基因型頻率的差異，使用多因素條件Logistic回歸模型計(jì)算比值比(odds ratio，OR)和相應(yīng)的95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)來(lái)評(píng)估各基因型及有關(guān)因素與腎癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。連鎖不平衡及單倍型分析使用SHEsis在線(xiàn)軟件。P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)處理均使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象基本情況

病例組年齡為(59.6±11.1)歲，男性59例，女性37例；對(duì)照組年齡為(60.2±11.2)歲，男性58例，女性38例。兩組間性別、年齡、葷素搭配、食用水果分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；飲用牛奶和體育鍛煉行為的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。

表1 病例組和對(duì)照組的一般情況比較(例，%)

2.2 基因型及等位基因頻率分布

rs5742909、rs231775位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在兩組的分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 條件Logistic回歸

將兩個(gè)位點(diǎn)及兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的飲用牛奶、體育鍛煉因素納入Logistic回歸模型中(表3)。結(jié)果表明，rs5742909位點(diǎn)及飲用牛奶進(jìn)入模型，rs231775位點(diǎn)、體育鍛煉因素被剔除。其中飲用牛奶因素P=0.015，OR(95% CI)為2.65(1.212～5.779)，提示幾乎不飲用牛奶為患腎癌的危險(xiǎn)因素。另外，在對(duì)照組中，rs5742909位點(diǎn)C等位基因的頻率較高[P=0.006，OR=0.443，95%CI 為(0.237～0.792)]；而在病例組中，rs231775位點(diǎn)A等位基因更為常見(jiàn)[P=0.009，Or=1.781，95%CI為(1.154～2.749)](表3)。

表2 CTLA-4基因2個(gè)位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在病例組與對(duì)照組中的分布(例，%)

表3 Logistic回歸模型分析膀胱癌危險(xiǎn)因素(例，%)

2.4 位點(diǎn)連鎖不平衡及單倍型分析

結(jié)果顯示，rs5742909與rs231775間的D’值為0.967，提示這兩個(gè)位點(diǎn)間存在強(qiáng)連鎖不平衡關(guān)系。CTLA-4基因兩個(gè)位點(diǎn)單倍型頻率分布比較可得，C-G和T-A兩個(gè)單倍型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007、0.008)，在C-G和T-A單倍型分布下，患病風(fēng)險(xiǎn)分別為其他單倍型的0.556倍[OR(95%CI)為0.556(0.360～0.858)]和2.230倍[OR(95%CI)為2.230(1.216～4.089)，見(jiàn)表4。

表4 CTLA-4基因單倍型頻率分布差異(例，%)

3 討論

腎癌的發(fā)生發(fā)展涉及多種因素的參與作用，環(huán)境因素與遺傳因素的交互或共同作用是大多數(shù)腫瘤的病因，但暴露于相同環(huán)境的人群只有少數(shù)個(gè)體發(fā)病，提示個(gè)體的遺傳易感因素起更重要作用[3]。研究表明，慢性感染和炎癥是癌癥的主要病因，當(dāng)炎癥免疫反應(yīng)與腫瘤發(fā)生有關(guān)時(shí)，CTLA-4在活化的T細(xì)胞上的存在起著“關(guān)閉開(kāi)關(guān)”的作用，以保持免疫系統(tǒng)處于正常狀態(tài)。CTLA-4可以被認(rèn)為是1種“雙刃劍”，只有其最佳表達(dá)才能保證高效同時(shí)無(wú)害的免疫應(yīng)答。CTLA-4基因在易患癌癥及自身免疫疾病的遺傳和環(huán)境易感性個(gè)體中的異常表達(dá)可能增加疾病發(fā)生和發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)[13]?？紤]到單核苷酸多態(tài)性在CTLA-4基因表達(dá)蛋白質(zhì)功能中的意義，假設(shè)這些SNPs參與腎癌的發(fā)生和發(fā)展。

基因多態(tài)性與乳腺癌、宮頸癌和慢性淋巴細(xì)胞白血病等多種惡性腫瘤的易感性有關(guān)[13]，但在腎癌中研究甚少。本研究評(píng)估了CTLA-4基因rs5742909與rs231775位點(diǎn)與中國(guó)漢族人腎癌易感性的關(guān)系，兩位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在兩組的分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但Logistic回歸結(jié)果尚未發(fā)現(xiàn)兩位點(diǎn)與腎癌易感性相關(guān)，rs5742909位點(diǎn)C等位基因在對(duì)照組中的分布頻率顯著高于病例組，可能與腎癌患病風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)[P=0.006，OR(95% CI)為0.443(0.237～0.792)]。rs231775位點(diǎn)A等位基因在病例組的分布頻率顯著高于對(duì)照組，可能與腎癌患病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[P=0.009，OR(95% CI)為1.781(1.154～2.749)]。

另外，本研究分析了病例組人群和對(duì)照人群在某些生活習(xí)慣如葷素搭配、飲用牛奶、食用水果、體育鍛煉情況的差異，Logistic回歸模型顯示，幾乎不喝牛奶或?yàn)槟I癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可使其患病風(fēng)險(xiǎn)增加2.646倍[(95%CI) 為(1.212～5.779)]。

本研究還分析了單倍型與腎癌的相關(guān)性，構(gòu)建了CTLA-4基因2個(gè)位點(diǎn)的單倍型。C-G是對(duì)照組中最常見(jiàn)的單倍型，在病例組與對(duì)照組頻率分別為60.8%和74%，這種單倍型與腎癌患病風(fēng)險(xiǎn)降低約0.5倍相關(guān)。而在病例組中，T-A單倍型的頻率約為19%，而對(duì)照組不到10%，此單倍型與患腎癌的風(fēng)險(xiǎn)增加約2.5倍相關(guān)。即提示rs5742909C-rs231775G可能是腎癌患病的保護(hù)因素[OR(95%CI)為0.556 (0.360～0.858)]，而rs5742909T-rs231775A或?yàn)槟I癌患病的危險(xiǎn)因素[OR(95%CI)為2.230(1.216～4.089)]。

腎癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，因此尋找影響腎癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、進(jìn)展和療效的因素至關(guān)重要。本研究局限性在于樣本量較小，可能沒(méi)有足夠的統(tǒng)計(jì)能力探索兩者之間的真實(shí)關(guān)系。數(shù)據(jù)顯示CTLA-4多態(tài)性與中國(guó)人群腎癌患病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)，進(jìn)一步研究更大的群體規(guī)模、多中心的臨床研究，結(jié)合臨床指標(biāo)，從多角度闡明遺傳變異在CTLA-4基因和腎癌中的作用。