宋樹娟　范琳　王振國

【摘要】 目的：探討谷氨酸脫氫酶1（glutamate dehydrogenase 1，GLUD1）在肝細(xì)胞癌患者中的表達特點。方法：在TCGA數(shù)據(jù)庫中下載343例肝細(xì)胞癌患者臨床數(shù)據(jù)及RNA表達數(shù)據(jù)，比較不同年齡、不同種族及不同腫瘤分期患者的GLUD1表達水平;按照GLUD1表達水平將患者排序，并分為高表達組（n=171）和低表達組（n=172），比較兩組患者生存時間。結(jié)果：GLUD1表達水平與年齡無相關(guān)性（r=-0.102，P>0.05）。不同種族間GLUD1表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者GLUD1表達水平分別為（13.51±0.38）、（13.29±0.54）、（13.16±0.79）、（13.65±0.51），四組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.915，P=0.007）;Ⅱ、Ⅲ期患者的GLUD1表達水平均低于Ⅰ期，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。GLUD1高表達組患者的中位生存時間長于GLUD1低表達組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：GLUD1高表達患者的腫瘤級別較低、生存期較長。

【關(guān)鍵詞】 肝細(xì)胞癌 谷氨酸脫氫酶1 富集分析

Research on Expression Characteristics of GLUD1 in Patients with Hepatocellular Carcinoma/SONG Shujuan， FAN Lin， WANG Zhenguo. //Medical Innovation of China， 2021， 18（15）： -143

[Abstract] Objective：? To investigate the expression characteristics of GLUD1 in patients with hepatocellular carcinoma （HCC）. Method： The clinical data and RNA expression data of 343 patients with hepatocellular carcinoma were downloaded from TCGA database， and the GLUD1 expression levels of patients with different ages， races and tumor stages were compared， and the patients were sorted according to the expression level of GLUD1， and divided into high expression group （n=171） and low expression group （n=172）， and the survival time of two groups was compared. Result： There was no correlation between GLUD1 expression and age （r=-0.102， P>0.05）. There was no significant difference in the expression level of GLUD1 among different races （P>0.05）. The expression levels of GLUD1 in Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ and Ⅳ stage patients were （13.51±0.38）， （13.29±0.54）， （13.16±0.79） and （13.65±0.51）， respectively， and the differences among four groups was statistically significant （F=3.915， P=0.007）; the expression levels of GLUD1 in both Ⅱ and Ⅲ stage patients were lower than that in Ⅰ stage patients， the differences were statistically significant （P<0.05）. The median survival time of patients in the group with high GLUD1 expression was longer than that in the group with low GLUD1 expression， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Patients with high expression of GLUD1 have lower tumor grade and longer survival time.

[Key words] Hepatocellular carcinoma Glutamate dehydrogenase 1 Analysis of enrichment

First-author’s address： Qingdao Third People’s Hospital， Qingdao 266000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.15.034

肝癌在全球范圍內(nèi)每年導(dǎo)致超過70萬人死亡，致死率在所有惡性腫瘤中排在第三位[1-3]，可見肝癌的防治形勢嚴(yán)峻[4]。但隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展涉及多條信號通路，發(fā)病機制復(fù)雜[5-6]，因此尋找出能夠提示肝癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物，并針對該靶基因制定早期治療方案對于提高肝癌的治療效果意義顯著。谷氨酸脫氫酶1（Glutamate dehydrogenase 1，GLUD1）可將L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸，是谷氨酰胺代謝途徑中的關(guān)鍵酶[7-8]。谷氨酰胺與自噬和炎癥因子的分泌密切相關(guān)，研究表明抑制谷氨酰胺合成可使巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞募集的能力增強，削弱癌細(xì)胞運動的能力[9]。Craze等[10]在乳腺癌相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，GLUD1低表達與患者遠(yuǎn)期預(yù)后不良相關(guān)。但是在肝細(xì)胞癌中，GLUD1與患者預(yù)后的相關(guān)性尚未闡明，為此本研究通過文獻[11]的癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫分析GLUD1對肝細(xì)胞癌患者腫瘤分期及生存率的影響，從而為肝細(xì)胞癌的預(yù)后判斷和治療提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從TCGA數(shù)據(jù)庫下載肝細(xì)胞癌患者數(shù)據(jù)集RNASeq和Clinical，共343例，平均年齡（67.12±8.36）歲;其中男196例，女147例;白種人176例，黃種人102例，黑種人64例，印第安人1例;Ⅰ期139例，Ⅱ期106例，Ⅲ期95例，Ⅳ期3例。

1.2 方法

1.2.1 比較GLUD1表達水平與種族、年齡的相關(guān)性 將每例患者GLUD1表達水平作為橫坐標(biāo)，年齡作為縱坐標(biāo)繪制散點圖，比較GLUD1表達水平與年齡的相關(guān)性。將患者分為亞洲人、黑種人和白種人三組，比較不同種族之間GLUD1表達差異。

1.2.2 不同腫瘤分期患者GLUD1中表達差異 將患者根據(jù)腫瘤分期歸入不同組別，比較不同分期患者GLUD1表達差異。

1.2.3 生存曲線分析 按照GLUD1表達水平由高到低排序，將排在前50%的患者設(shè)為高表達組（n=171），剩余患者設(shè)為低表達組（n=172），繪制生存曲線。

1.2.4 富集分析 將GLUD1基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，找到與其相關(guān)性最高的10個上下游基因，并進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)采用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性檢驗，生存時間的比較使用Breslow分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GLUD1表達水平與年齡的相關(guān)性及不同種族間GLUD1表達水平變化 GLUD1表達水平與年齡無相關(guān)性（r=-0.102，P=0.927），見圖1;印第安人、黃種人、黑種人、白種人的GLUD1表達水平分別為13.41、（13.35±2.98）、（13.70±1.55）、（13.24±3.60），不同種族間GLUD1表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.720，P>0.05），見圖2。

2.2 GLUD1表達水平對生存時間的影響 GLUD1高表達組患者的中位生存時間為1 014 d，長于GLUD1低表達組的872 d，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ=43.64，P<0.001），見圖3。

2.3 不同腫瘤分期患者GLUD1表達水平比較 Ⅰ、

Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者GLUD1表達水平分別為（13.51±0.38）、（13.29±0.54）、（13.16±0.79）、（13.65±0.51），四者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.915，P=0.007）;Ⅱ、Ⅲ期患者GLUD1表達水平均低于Ⅰ期，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其余組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖4。

2.4 富集分析 與GLUD1最為密切相關(guān)的10個上下游基因分別是丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶2、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶1、異檸檬酸脫氫酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶2、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脫氫酶2、NAD依賴蛋白脂酰胺酶sirtuin-4、谷氨酰胺酶腎臟異構(gòu)體、谷氨酰胺酶肝臟異構(gòu)體、δ-1-吡咯啉-5-羧酸脫氫酶。其主要富集的生物學(xué)進程為二羧酸代謝過程，主要富集的分子功能為輔酶結(jié)合，主要富集的細(xì)胞組分為線粒體基質(zhì)。主要富集的信號通路為丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝以及精氨酸生物合成。

3 討論

GLUD1是一種線粒體酶，主要存在于肝臟、腎臟及心肌線粒體中，在谷氨酰胺代謝中起關(guān)鍵作用。GLUD1高表達可促進谷氨酰胺的分解，降低細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺的含量[12]。谷氨酰胺與炎癥因子的分泌和自噬密切相關(guān)[13]，抑制谷氨酰胺合成可使M2極化的巨噬細(xì)胞向M1樣表型傾斜，增強巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞募集的能力，抑制癌細(xì)胞運動能力[14]。已有研究表明GLUD1在急性髓系白血病、乳腺癌等腫瘤中表達異常[10]，但GLUD1在肝細(xì)胞癌中的作用，特別是與患者遠(yuǎn)期生存率的相關(guān)性研究鮮有報道。本研究通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫中肝細(xì)胞癌患者的臨床數(shù)據(jù)，探討GLUD1對肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的影響，從而為肝細(xì)胞癌的預(yù)后判斷及臨床治療策略的制定提供一定參考。

本研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ期患者GLUD1表達水平高于Ⅱ、Ⅲ期患者（P<0.05），且GLUD1高表達組患者的中位生存時間長于GLUD1低表達組（P<0.05），表明在肝細(xì)胞癌中GLUD1高表達可提示患者預(yù)后相對良好。這可能由于在腫瘤早期，細(xì)胞對能量需求增加，谷氨酰胺作為能量代謝中的重要底物可出現(xiàn)代償性表達升高，在正反饋的作用下GLUD1隨之升高。但隨著腫瘤進展，腫瘤細(xì)胞能量需求進一步升高，但線粒體功能逐漸退化，能量代謝失代償，從而出現(xiàn)GLUD1表達水平降低。

為了進一步探討GLUD1具體的作用機制，本研究檢索了與GLUD1最為密切相關(guān)的10個上下游基因，及其富集水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10個基因均為能量代謝中重要的酶或輔酶，其中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶2催化丙氨酸和2-氧戊二酸之間的可逆轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，生成丙酮酸和谷氨酸，屬于Ⅰ類磷酸吡哆醛依賴的氨基轉(zhuǎn)移酶家族[15]。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶參與了發(fā)育過程中肝臟葡萄糖的合成和脂肪細(xì)胞甘油的合成，以L-半胱氨酸為底物，調(diào)節(jié)硫化氫的重要來源—巰基丙酮酸的水平[16]。異檸檬酸脫氫酶能與丙酮酸脫氫酶復(fù)合物緊密結(jié)合或相互作用，屬于異檸檬酸和異丙基蘋果酸脫氫酶家族[17-18]。谷氨酰胺合成酶可催化谷氨酰胺和4-氨基丁酸的產(chǎn)生[19]。NAD依賴蛋白脂酰胺酶sirtuin-4可催化ADP-核糖基轉(zhuǎn)移到靶蛋白上，抑制GLUD1酶活性[20]。δ-1-吡咯烷-5-羧酸脫氫酶可催化從脯氨酸或鳥氨酸衍生的δ-1-吡咯烷-5-羧酸到谷氨酸的不可逆轉(zhuǎn)化，這是連接尿素和三羧酸循環(huán)的途徑中必要的一步[21]。富集分析可見GLUD1相關(guān)上下游基因主要參與線粒體中的能量代謝通路。線粒體在調(diào)控細(xì)胞能量代謝的過程中發(fā)揮重要作用，既往研究可見由于腫瘤細(xì)胞快速增殖需要大量的蛋白質(zhì)、脂類等生物大分子，其自身的能量代謝顯著高于正常的細(xì)胞[22]，在其腫瘤進展的過程中亦可觀察到廣泛的脂肪酸代謝、糖代謝和氨基酸代謝異常[23]。與此同時，能量代謝過程中產(chǎn)生的活性氧族和鈣離子穩(wěn)態(tài)異常同樣可作用于腫瘤細(xì)胞，影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[24]。這提示線粒體內(nèi)的物質(zhì)能量代謝通路是GLUD1影響肝細(xì)胞癌進展的潛在機制。

綜上所述，本研究通過數(shù)據(jù)挖掘，發(fā)現(xiàn)GLUD1高表達患者的腫瘤級別較低、生存期較長，這為肝細(xì)胞癌的早期預(yù)后判斷與治療提供了參考。

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（收稿日期：2020-09-16） （本文編輯：張爽）