柑橘脅迫響應基因WRKY47的克隆與表達分析

沈丹　楊莉　胡威　匡柳青　郭文芳　盧婷　劉德春　劉勇

摘要： 以檸檬[Citrus limon （L.） Burm.f.]、甜橙[Citrus sinensis （L.） Osbeck]、蘆柑（Citrus reticulata Blanco）、金柑[Fortunella japonica （Thunb.） Swingle]為試驗材料，基于甜橙基因組數(shù)據(jù)庫中的甜橙基因堿基序列，利用RT-PCR方法克隆獲得4個WRKY家族基因ClWRKY47、CsWRKY47、CrWRKY47和FjWRKY47的cDNA全長堿基序列。序列分析結果表明，這4個基因的cDNA全長都是1 567 bp，開放閱讀框為1 506 bp，編碼501個氨基酸。氨基酸序列和結構分析結果顯示，這4個基因編碼的蛋白質屬于Group IIa+IIb類WRKY蛋白。進化樹分析結果顯示，所克隆的4個柑橘WRKY蛋白與克萊門柚WRKY47蛋白的親緣關系最近。對CsWRKY47啟動子順式作用元件預測分析，發(fā)現(xiàn)CsWRKY47啟動子包含脫落酸響應元件（ABRE）、茉莉酸甲酯響應元件（CGTCA-motiF）、抗氧化響應元件（ARE）、參與干旱誘導的MYB結合位點（MBS）等多個與脅迫相關的順式作用元件。實時熒光定量表達分析結果表明，檸檬ClWRKY47和甜橙CsWRKY47能被高鹽、干旱、低溫脅迫誘導表達;蘆柑CrWRKY47在干旱和低溫脅迫下誘導表達，高鹽脅迫下表達量下調;金柑FjWRKY47 在高鹽脅迫下誘導表達，干旱和低溫脅迫下下調表達。為進一步開展柑橘脅迫相關基因WRKY47的功能鑒定奠定了基礎。

關鍵詞： 柑橘;WRKY;非生物脅迫;基因克隆;表達分析

中圖分類號： Q785 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）01-0129-10

Cloning and expression analysis of stress response gene WRKY47 in citrus

SHEN Dan， YANG Li， HU Wei， KUANG Liu-qing， GUO Wen-fang， LU Ting， LIU De-chun， LIU Yong

（College of Agriculture， Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045， China）

Abstract： Based on the Citrus sinensis gene base sequences contained in the sweet orange genome database， the cDNAs sequences of four WRKY family genes ClWRKY47， CsWRKY47， CrWRKY47 and FjWRKY47 were cloned from lemon [Citrus limon （L.） Burm.f.]， sweet orange [Citrus sinensis （L.） Osbeck]， ponkan （Citrus reticulata Blanco） and kumquat [Fortunella japonica （Thunb.） Swingle] by RT-PCR， respectively. The results of sequence analysis showed that the cDNA of these four genes were 1 567 bp in length， the open reading frame （ORF） was 1 506 bp， and 501 amino acids were encoded. The results of amino acid sequence and structure analysis demonstrated that the proteins encoded by these four genes belonged to the Group IIa+IIb WRKY protein. Phylogenetic tree analysis results indicated that the four citrus WRKY proteins were closely related to the Citrus clementine WRKY47 protein. Predictive cis-acting element analysis of CsWRKY47 promoter revealed that CsWRKY47 promoter contained abscisic acid response element （ABRE）， methyljasmonic acid response element （CGTCA-motiF）， anaerobic response element （ARE）， MYB binding site involved in drought-response （MBS） and many other stress-related cis-acting elements. Real-time fluorescence quantitative PCR analysis suggested that the expression levels of ClWRKY47 and CsWRKY47 were induced by drought， low temperature and high salt. Besides， the expression of CrWRKY47 was induced under drought and low temperature stress， but suppressed under high salt stress. However， the expression level of FjWRKY47 was upregulated under high salt stress and suppressed under drought and low temperature stress. These results lay a foundation for further functional identification of the stress-related gene WRKY47 in citrus.

Key words： citrus;WRKY;abiotic stress;gene cloning;expression analysis

植物的生長發(fā)育過程很大程度上受環(huán)境的影響，其中非生物脅迫主要為干旱、高鹽以及低溫。在非生物脅迫信號的感知以及生理和生化反應上，植物自身已經(jīng)進化出應對脅迫的各種復雜的響應機制。簡單的說，植物可以通過一系列脅迫信號轉導和調控相關基因來響應非生物脅迫[1-2]。這些非生物脅迫響應基因按功能可以分為兩大類，即調控型基因和功能型基因。調控基因編碼的轉錄因子（TFs）可以轉導脅迫信號并調控功能基因的表達，而這些功能基因在減輕植物遭受脅迫帶來的損害中起著直接作用[3]。

研究發(fā)現(xiàn)， bZIP、WRKY、NAC、AP2/ERF和MYB等轉錄因子家族都與植物響應逆境的過程相關 [4]。WRKY是植物中最重要的轉錄因子家族之一。該家族蛋白質包含1到2個由約60個氨基酸組成的高度保守的WRKY DNA結合結構域，還含有C2H2或C2HC鋅指結構，可與DNA序列W-box（TTGACC/T）結合，調控下游基因表達[2]。自1994年首次在甜薯中克隆出1個WRKY 家族轉錄因子基因SPF1之后[5]，又陸續(xù)在高等植物以及低等植物（如苔蘚）中克隆出多個WRKY 家族基因[6]。在克隆出來的植物WRKY家族基因中，已有許多被驗證能夠響應非生物脅迫，并在這個過程中發(fā)揮調控作用 [7]。如Qiu等[8]利用Northern blotting技術，對克隆獲得的13個水稻W(wǎng)RKY基因進行分析，發(fā)現(xiàn)在這13個水稻W(wǎng)RKY基因中有10個基因能夠被非生物脅迫（高鹽、高溫、干旱和低溫）誘導表達。Jiang等[9]通過芯片譜分析法對高鹽處理后的擬南芥根系進行分析，發(fā)現(xiàn)有18個WRKY家族基因能夠被高鹽處理誘導表達。同時，單個WRKY家族基因可以被多種非生物脅迫誘導表達。例如櫻桃砧木PcWRKY1基因在滲透脅迫和高鹽脅迫下均能被誘導表達[10];芍藥PLWRKY13可以被低溫、高溫、干旱和鹽脅迫同時誘導表達，并且正向調節(jié)牡丹中番茄紅素的產(chǎn)生[11]。擬南芥AtWRKY47基因可以被硒脅迫、鎘脅迫誘導表達，并且AtWRKY47功能缺失型突變體對硒脅迫表現(xiàn)更敏感，但是對鎘脅迫更耐受，其過表達植株也對鎘脅迫表現(xiàn)出高度耐受[12-13]。前人研究結果表明，水稻OsWRKY47功能缺失型突變體對干旱脅迫敏感并且產(chǎn)量下降，而OsWRKR47過表達植株對干旱脅迫更耐受，說明OsWRKY47基因是干旱脅迫響應的正調控因子[14]。

柑橘是世界上最重要的水果種類之一，中國柑橘種植面積和產(chǎn)量一直在不斷增長，但其產(chǎn)業(yè)發(fā)展一直受到非生物脅迫的影響和制約。目前，柑橘中的WRKY基因研究還不多，對柑橘WRKY47基因的研究未見報道。因此，本研究從檸檬、甜橙、金柑、蘆柑4個不同柑橘種類中克隆得到WRKY47基因，對克隆出的基因的堿基序列及其編碼蛋白質進行生物信息學分析，并使用實時熒光定量PCR分析這4個基因在非生物脅迫（高鹽、干旱和低溫）下的時空表達模式差異，以期為柑橘抗逆分子育種提供候選基因資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及材料的處理

將檸檬[Citrus limon （L.） Burm.f.]、甜橙[Citrus sinensis （L.） Osbeck]、蘆柑（Citrus reticulata Blanco）、金柑[Fortunella japonica （Thunb.） Swingle]種子消毒催芽后分別播種于MS固體培養(yǎng)基中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)28 d左右，再轉移至Hoagland培養(yǎng)液中預培養(yǎng)2～3 d，然后進行脅迫處理。高鹽、干旱處理時將4種幼苗分別轉移至含有250 mmol/L NaCI、20% PEG-6000的Hoagland液體培養(yǎng)基中常溫培養(yǎng)。低溫處理時幼苗轉移到干凈的Hoagland液體培養(yǎng)基中并置于4 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每種材料取18～24個植株進行脅迫處理，然后分別于處理0 h（CK），1 h、3 h、6 h、12 h、24 h時取其葉片，-80 ℃儲存，備用。

1.2 葉片總RNA提取及反轉錄

檸檬、甜橙、蘆柑、金柑葉片總RNA提取方法采用Trizol法。RNA含量用超微量分光光度計檢測， RNA提取質量用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用日本TOYOBO公司生產(chǎn)的ReverTra Ace-α-TM試劑盒將提取的總RNA反轉錄成cDNA，存放于-20 ℃，備用。

1.3 ClWRKY47、 CsWRKY47 、CrWRKY47和 FjWRKY47基因克隆

由華中農(nóng)業(yè)大學構建的甜橙基因組數(shù)據(jù)庫中含有大量甜橙基因序列，通過序列搜索和拼接獲得包含完整開放閱讀框（ORF）的CsWRKY47轉錄因子基因序列?；谠撔蛄杏肞rimer Premier5.0軟件設計了1對基因特異性引物CsWRKY47-F和CsWRKY47-R（表1）。以獲得的4個物種的葉片cDNA為模板，通過PCR擴增獲得ClWRKY47、CsWRKY47、CrWRKY47、FjWRKY47基因堿基序列全長。PCR擴增程序參考郭文芳[15]的方法，退火溫度56 ℃ 30 s。擴增產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠中進行電泳分離，切膠回收后的PCR目的片段用DNA回收試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品]回收并純化，然后與pMD18-T載體連接[寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司產(chǎn)品]并轉化到大腸桿菌中，菌液PCR鑒定為陽性克隆后送上海生物工程有限公司測序。

1.4 生物信息學分析

利用NCBI 中的ORF Finder工具對測序獲得的ClWRKY47、CsWRKY47、CrWRKY47、FjWRKY47基因的cDNA堿基序列進行分析，確定這4個基因的開放閱讀框和所編碼的氨基酸序列，并對其堿基序列進行比對;利用ExPASy ProtParam在線分析工具對蛋白質氨基酸序列及理化性質進行分析;使用DNAMAN軟件進行蛋白質一致性分析和不同植物蛋白質間的多序列比對分析;利用InterProScan在線軟件分析蛋白質結構功能域;采用MEGA5軟件構建4種蛋白質與其他植物蛋白質間的系統(tǒng)進化樹;通過PlantCARE在線網(wǎng)站進行基因的啟動子順式作用元件預測分析;采用TMpred預測基因編碼蛋白質的跨膜結構;通過ProtScale在線軟件預測蛋白質親疏水性;采用在線軟件PSORT II對蛋白質進行亞細胞定位分析;利用SOPMA軟件預測蛋白質的二級結構并用SWISS-MODEL軟件進行蛋白質三級結構預測建模。

1.5 實時熒光定量PCR

采用Primer Premier 5.0設計CsWRKY47基因的實時定量引物CsWRKY47-Fq和CsWRKY47-Rq，內參基因為柑橘CsActin基因（表1）。非生物脅迫處理后4個物種WRAKY47基因的表達量在BIO-RAD CFX9 6熒光定量PCR儀上進行檢測。qRT-PCR反應體系的總體積為20.0 μl：10.0 μl熒光染料[寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司產(chǎn)品]、8.0 μl ddH2O、1.0 μl F/R引物、1.0 μl總cDNA。qRT-PCR反應程序參照文獻[15]。每處理樣品設3次重復。相對表達量用2-△△Ct方法計算。

2 結果與分析

2.1 CsWRKY47的克隆與分析

以甜橙為材料，通過RT-PCR擴增克隆獲得CsWRKY47基因堿基序列。測序和生物信息學分析結果顯示，該基因cDNA堿基序列全長1 567 bp，開放閱讀框（ORF）為1 506 bp，編碼501個氨基酸。ExPASy ProtParam在線分析結果顯示，CsWRKY47蛋白分子式為C2 327H3 727N699O757S25，其氨基酸組成有20種，理論等電點（PI）為8.58，PI值大于7說明該蛋白質可能為堿性蛋白質;預測相對分子質量約為54 410，脂肪系數(shù)為64.93，不穩(wěn)定指數(shù)為49.48，總平均親水性為-0.637，一般總平均親水性的值小于0為親水蛋白質，因此推測該蛋白質屬于弱穩(wěn)定性親水蛋白質。通過ProtScale在線軟件預測CsWRKY47蛋白親疏水性，進一步證明其為親水性蛋白質（圖1A）。

采用TMpred預測蛋白質跨膜結構，結果顯示，CsWRKY47蛋白N端343～363、376～396、461～480這3個位點處具有跨膜結構。PSORT II在線軟件預測結果表明，CsWRKY47蛋白亞細胞定位于細胞核上的可能性最高。利用SOPMA軟件預測CsWRKY47蛋白的二級結構，結果顯示，該蛋白質具有27.94% α-螺旋、8.18%延伸鏈、2.59% β-折疊以及61.28%無規(guī)則卷曲（圖1B）。使用SWISS-MODEL搜索并獲得CsWRKY47蛋白同源模型，推測出該蛋白質可能的4個三級結構模型（圖1C）。通過NetPhos 2.0 Serve預測CsWRKY47蛋白磷酸化位點，結果表明，CsWRKY47蛋白含有26個絲氨酸（Ser）以及2個蘇氨酸（Thr）磷酸化位點。

2.2 CsWRKY47基因啟動子序列預測分析

將從甜橙基因組數(shù)據(jù)庫獲取的CsWRKY47基因起始密碼子ATG上游1 500 bp的DNA堿基序列作為該基因的啟動子序列，并通過PlantCARE在線分析網(wǎng)站對該基因啟動子序列進行順式作用元件預測分析，分析結果（表2）顯示，CsWRKY47基因啟動子除了含有16個CAAT-box和30個TATA-box 2種基本的順式作用元件外，還含有多個光響應元件，如G-Box、Sp1、TCCC-motif等;另外在DNA雙鏈上分別有1個WRKY結構域專一結合的W-box元件，同時還包含多個與脅迫相關的順式作用元件，如8個脫落酸響應元件（ABRE）、4個茉莉酸甲酯響應元件（CGTCA-motiF）、1個赤霉素響應元件（TATC-box）、1個抗氧化響應元件（ARE）、4個參與干旱誘導的MYB結合位點（MBS）等。

2.3 不同種類柑橘WRKY47蛋白的同源性及進化分析

為了解不同種類柑橘中WRKY47蛋白的差異和功能，通過RT-PCR擴增，分別從檸檬、蘆柑、金柑3個柑橘種類中克隆出WRKY47基因，并分別命名為ClWRKY47、 CrWRKY47和FjWRKY47。測序結果表明，這3個基因的堿基序列與CsWRKY47的cDNA堿基序列長度一致，均為1 567 bp，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)開放閱讀框為1 506 bp并且編碼501個氨基酸;對4個基因的堿基序列進行比對發(fā)現(xiàn)，這4個基因cDNA堿基序列有16個堿基存在差異，相似性達99.68%（圖2）。

通過NCBI數(shù)據(jù)庫將ClWRKY47 、CsWRKY47、CrWRKY47、FjWRKY47的堿基序列翻譯成氨基酸序列，并用DNAman對這4條氨基酸序列進行比對，結果顯示，這4條氨基酸序列有7個位點存在差異，序列一致性達99.55%。進一步通過與其他植物WRKY47蛋白進行多序列比對分析（圖3）發(fā)現(xiàn)，這4個蛋白質在N端267～333位點都含有1個高度保守的WRKY結構域，并且在該結構域的N末端有1個WRKYGQK保守氨基酸序列和1個C端鋅指結構基序C2H2（CX4-5CX22-23HX1H），說明這4個蛋白質都屬于WRKY轉錄因子家族的Group IIa+IIb類。

為了驗證ClWRKY47、CsWRKY47、CrWRKY47和FjWRKY47的蛋白質進化關系，使用MEGA 6.0軟件中的最大似然法構建系統(tǒng)進化樹，結果（圖4）顯示，這4個新蛋白質與克萊門柚WRKY47（XP_006444621.1）蛋白親緣關系最近，并且都聚集在同一分支上，與龍眼WRKY47（AEO31517.2）蛋白親緣關系較近，與葡萄WRKY47（XP_002281194.1）蛋白親緣關系最遠。

2.4 非生物脅迫處理對不同種類柑橘WRKY47基因表達的影響

分別對甜橙、檸檬、蘆柑和金柑分別進行250 mmol/L NaCl、20% PEG-6000和4 ℃低溫處理，取其葉片進行實時熒光定量表達分析。由圖5a可知，250 mmol/L NaCl脅迫處理植株時，甜橙CsWRKY47在葉片中表達量逐漸升高，24 h時達到最大值，為對照的3倍左右，整體變化較大;檸檬ClWRKY47表達量在1 h時最低，此后逐漸升高，在6 h時達到最高，整體變化趨勢為先升后降;蘆柑CrWRKY47在高鹽處理后，與對照相比，整體表達是下調的，表達量表現(xiàn)出受高鹽處理的抑制;金柑FjWRKY47表達量整體呈現(xiàn)緩慢升高的趨勢，在6 h時達到最大值。

由圖5b可知，20% PEG6000模擬干旱脅迫處理時，甜橙CsWRKY47表達量在24 h內緩慢升高，在6 h和24 h時出現(xiàn)2次表達高峰;檸檬ClWRKY47的表達量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在6 h時表達量達到最高;蘆柑CrWRKY47在24 h內表達量變化趨勢較平緩，在1 h、6 h以及12 h時表達量高于對照;金柑FjWRKY47對干旱脅迫也有響應，但其表達量低于對照，表明干旱脅迫對金柑FjWRKY47的表達有一定的抑制作用。

由圖5c可知，4 ℃低溫處理時，甜橙CsWRKY47表達量整體呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在12 h時表達量最高，為對照的2.7倍左右;檸檬ClWRKY47表達量與對照相比總體上變化不大，但在1 h和6 h時其表達量高于對照，說明低溫能誘導其表達;蘆柑CrWRKY47表達量在前12 h處于緩慢升高的趨勢，但在24 h時表達量降低到最低;金柑FjWRKY47的表達量在24 h內都低于對照，說明低溫脅迫抑制FjWRKY47的表達。

以上結果表明，在高鹽、干旱和低溫處理下，ClWRKY47、CsWRKY47、CrWRKY47和FjWRKY47的表達量都發(fā)生了改變。檸檬ClWRKY47和甜橙CsWRKY47均能被3種非生物脅迫誘導表達;蘆柑CrWRKY47在干旱和低溫脅迫下也能被誘導表達，但在高鹽脅迫下表達量下調;金柑FjWRKY47 可以響應高鹽脅迫，但在干旱和低溫脅迫下，表達都低于對照，尤其是低溫脅迫下，F(xiàn)jWRKY47明顯下調表達。

3 討論

WRKY家族轉錄因子具有調控植物生長發(fā)育和響應非生物脅迫等多種功能。但是，目前有關柑橘中WRKY轉錄因子的研究較少。為了初步驗證柑橘中WRKY47基因對逆境的響應機制以及在不同柑橘種類中的差異，我們從檸檬、甜橙、蘆柑、金柑中分別克隆出ClWRKY47、CsWRKY47、CrWRKY47和FjWRKY47基因。根據(jù)所含有的保守結構域的差異，WRKY轉錄因子可分為Group I、Group II和Group III 3類[16]。Group II最初又被分為IIa、IIb、IIc、IId和IIe 5個亞組，但最近的系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明，IIa和IIb，IId和IIe分別被合并為IIa +IIb和IId+IIe [17]。在本研究中，多序列比對分析結果表明，這4種蛋白質與其他植物WRKY47蛋白都具有高度保守的WRKY結構域和C2H2鋅指結構，這與前人研究結果[2]相吻合。同時，有研究結果表明，AtWRKY47蛋白屬于Group IIb 類[11]，推測ClWRKY47、CsWRKY47、CrWRKY47和FjWRKY47蛋白屬于WRKY轉錄因子家族的Group IIa+IIb類。此外，通過系統(tǒng)進化樹可以明顯看出這4個蛋白質具有種屬特異性，與克萊門柚WRKY47蛋白這個同屬植物蛋白質親緣關系最近且都聚集在進化樹的同一個分支上，這與植物系統(tǒng)分類學的進化趨勢是一致的。另外，通過對甜橙CsWRKY47氨基酸序列的分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質定位在細胞核上的可能性最高，符合轉錄因子的一般特征，即亞細胞定位于細胞核上[18-20]，該結果還需要通過試驗進一步驗證。

順式作用元件存在于基因的啟動子中，一般是由5～20個堿基序列組成的特異性DNA序列，具有轉錄調節(jié)功能 [21]。對玉米基因ZmCIPK10和ZmZIP71啟動子序列進行分析，發(fā)現(xiàn)兩者啟動子序列中含有大量的逆境相關元件，如脫落酸、低溫等響應元件，進一步通過非生物脅迫處理植株后，發(fā)現(xiàn)在干旱、低溫和高鹽脅迫下，ZmCIPK10和ZmZIP71基因表達量上升，表明兩者在植物應對逆境的過程中起調控作用[22-23]。在本試驗中，對CsWRKY47基因啟動子順式作用元件進行預測分析，結果表明，該基因啟動子包含多個光響應元件和植物逆境脅迫應答相關作用元件。由此推測，CsWRKY47基因可能受到光、激素及其他非生物脅迫的誘導，參與了植物非生物脅迫響應過程。歐芹在受到病原菌侵染時，PcWRKY1基因在短時間內會迅速表達且表達量顯著增加，對其啟動子序列分析發(fā)現(xiàn)，其自身啟動子具有3個W-box元件， PcWRKYl蛋白不僅可以通過自身的啟動子W-box元件與其他WRKY蛋白結合以行使功能，還可以通過該元件與自身結合并形成自我調節(jié)[24] 。本研究中，CsWRKY47基因啟動子也含有W-box元件，猜測CsWRKY47蛋白可能可以與自身啟動子結合以自我調節(jié)，或者與其他WRKY蛋白結合以調控其對逆境的響應表達。

前人研究結果表明，WRKY轉錄因子在植物響應非生物脅迫中扮演著重要的角色，例如在擬南芥中，AtWRKY25和AtWRKY33的表達受到NaCl和干旱處理的誘導并顯著提高[25];蔡榮號等[26]在模式植物擬南芥中通過異源表達玉米ZmWRKY114基因發(fā)現(xiàn)轉基因植株在高鹽脅迫下綠苗率低于野生型植株，并且其根系生長也受到了抑制，ZmWRKY114基因在調控植物應對高鹽脅迫的過程中可能起負調控作用。Zou等[27]對擬南芥的研究結果證實低溫誘導了野生型擬南芥中AtWRKY34基因的表達。本研究結果表明，檸檬ClWRKY47和甜橙CsWRKY47都能被3種非生物脅迫誘導表達，但是蘆柑CrWRKY47與金柑FjWRKY47對不同的脅迫表現(xiàn)出了差異表達。蘆柑CrWRKY47在鹽脅迫后表達下調，在干旱和低溫脅迫下表達上調，金柑FjWRKY47在鹽脅迫后上調表達，在干旱和低溫脅迫后表達下調。植物在應對干旱脅迫和高鹽脅迫的過程中，有很多基因參與響應脅迫，并在這2個脅迫過程中同一個基因起著相反的作用[28-29];也有基因在調控植物應對鹽脅迫、低溫脅迫和機械損傷過程中作用相反，例如楊樹中，PtrWRKY75基因和PtrWRKY80基因的表達能被鹽脅迫誘導，從而上調表達，但這2個基因對低溫脅迫和機械損傷沒有響應;PtrWRKY61基因和PtrWRKY88基因則特異性響應鹽脅迫和機械傷害，對低溫脅迫不響應[30]。因此，蘆柑CrWRKY47與金柑FjWRKY47在不同的非生物脅迫處理后出現(xiàn)差異表達的原因可能是蘆柑和金柑這2個柑橘種類自身遺傳特性導致的，也可能是由于植物在不同的脅迫條件下，與不同柑橘種類WRKY47基因啟動子結合的上游調控因子不同導致的。

綜上所述，本研究克隆獲得的ClWRKY47、CsWRKY47、CrWRKY47和FjWRKY47基因編碼的轉錄因子屬于WRKY轉錄因子家族的Group IIa+IIb類。順式作用元件預測發(fā)現(xiàn)CsWRKY47基因啟動子含有多種逆境相關元件。qRT-RCR表達分析結果揭示，CrWRKY47與FjWRKY47對不同非生物脅迫的響應不同。這些結果表明柑橘WRKY47可以響應多種非生物脅迫，可能在柑橘抵御非生物脅迫過程中發(fā)揮重要的作用。

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（責任編輯：陳海霞）

收稿日期：2020-10-13

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2019YFD1000100）;國家自然科學基金項目（31701896）;江西省自然科學基金面上項目（20202BAB205001）;江西省柑橘產(chǎn)業(yè)技術體系項目（JXARS-07-栽培崗位）

作者簡介：沈 丹（1996-），女，江蘇溧陽人，碩士研究生，研究方向為果樹抗逆生理。（E-mail）sd17751769221@163.com

通訊作者：劉德春，（E-mail）ldc873380800@163.com;劉 勇，（E-mail）liuyongjxau@163.com