基于AMPK/PPARα/STAT3途徑探討姜黃素對血管壁巨噬細(xì)胞形成的影響

陳旭 溫賢銘 劉子由

【摘要】 目的：基于腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）途徑探討姜黃素對血管壁巨噬細(xì)胞形成的影響。方法：本研究時間為2020年6-7月，將人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞分為空白對照組、脂多糖（LPS）組、LPS+辛伐他汀組、LPS+姜黃素組，每組20個。將80只小鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型組、辛伐他汀組和姜黃素組，每組20只。比較各組人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞遷移的數(shù)目、HMGB1和MCP-1蛋白表達(dá)水平、AMPK/PPARα/STAT3 mRNA相對表達(dá)量，比較各組小鼠血管壁巨噬細(xì)胞含量。結(jié)果：LPS組細(xì)胞的遷移能力、HMGB1和MCP-1蛋白表達(dá)水平均較空白對照組顯著升高，LPS+辛伐他汀組和LPS+姜黃素組均較LPS組下降，且LPS+姜黃素組明顯低于LPS+辛伐他汀組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。四組細(xì)胞遷移能力、HMGB1和MCP-1蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。LPS組細(xì)胞AMPK和PPARα mRNA、蛋白相對表達(dá)量均較空白對照組顯著降低，而STAT3 mRNA、蛋白相對表達(dá)量升高，LPS+辛伐他汀組和LPS+姜黃素組細(xì)胞AMPK和PPARα mRNA、蛋白相對表達(dá)量均較LPS組升高，STAT3 mRNA、蛋白相對表達(dá)量均降低，且LPS+姜黃素組細(xì)胞AMPK和PPARα mRNA、蛋白相對表達(dá)量均較LPS+辛伐他汀組升高，STAT3 mRNA、蛋白相對表達(dá)量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。體外實(shí)驗(yàn)中四組細(xì)胞AMPK/PPARα/STAT3 mRNA、蛋白相對表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組血管壁巨噬細(xì)胞含量明顯高于空白對照組，辛伐他汀組和姜黃素組均明顯低于模型組，姜黃素組顯著低于辛伐他汀組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。四組血管壁巨噬細(xì)胞含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：姜黃素能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞遷移及血管壁巨噬細(xì)胞的形成過程，可能通過調(diào)節(jié)AMPK/PPARα/STAT3途徑發(fā)揮作用，效果優(yōu)于辛伐他汀。

【關(guān)鍵詞】 腺苷酸活化蛋白激酶 過氧化物酶體增殖物激活受體α 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子3

姜黃素 巨噬細(xì)胞

Effect of Curcumin on Formation of Vascular Wall Macrophages by AMPK/PPARα/STAT3 Pathway/CHEN Xu， WEN Xianming， LIU Ziyou. //Medical Innovation of China， 2021， 18（24）： 0-028

[Abstract] Objective： To investigate the effect of Curcumin on the formation of vascular wall macrophages by adenylate activated protein kinase （AMPK）/peroxisome proliferator activated receptor α （PPARα）/signal transductor and transcriptional activator 3 （STAT3） pathways. Method： The research period was from June to July 2020， human mononuclear cell line THP-1 cells were divided into blank control group， lipopolysaccharide （LPS） group， LPS+Simvastatin group and LPS+Curcumin group， 20 cases in each group. Eighty mice were randomly divided into blank control group， model group， Simvastatin group and Curcumin group， 20 mice in each group. The number of human mononuclear cell line THP-1 cell migration， the protein expression levels of HMGB1 and MCP-1，

and the relative mRNA expression levels of AMPK/PPARα/STAT3 were compared among four groups， the content of macrophages in the blood vessel wall of four group were compared. Result： The migration ability， HMGB1 and MCP-1 protein expression levels of cells in LPS group were significantly increased compared with blank control group， while those in LPS+Simvastatin group and LPS+Curcumin group were decreased compared with LPS group， and LPS+Curcumin group was significantly lower than that in LPS+Simvastatin group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Comparison of cell migration ability， HMGB1 and MCP-1 protein expression levels among four groups， the differences were statistically significant （P<0.05）. The mRNA and protein relative expression levels of AMPK and PPARα in LPS group were significantly decreased compared with blank control group， while the mRNA and protein relative expression levels of STAT3 were increased， the mRNA and protein relative expression levels of AMPK and PPARα in LPS+Simvastatin and LPS+Curcumin groups were increased compared with LPS group， the mRNA and protein relative expression levels of STAT3 were decreased， and the mRNA and protein relative expression levels of AMPK and PPARα in LPS+Curcumin group were increased compared with LPS+Simvastatin group， while the mRNA and protein relative expression levels of STAT3 were decreased， the differences were statistically significant （P<0.05）. Comparison of AMPK/PPARα/STAT3 mRNA and protein relative expression levels among four groups in vitro， the differences were statistically significant （P<0.05）. The content of macrophages in the vascular wall in model group was significantly higher than that in blank control group， and Simvastatin group and Curcumin group were significantly lower than that in model group， and Curcumin group was significantly lower than that in Simvastatin group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Comparison of the content of macrophages in the blood vessel wall among four groups， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Curcumin can significantly inhibit LPS induced THP-1 Cell Migration and the formation of vascular wall macrophages， possibly by regulating AMPK/PPARα/STAT3 pathway plays a role， and the effect is better than simvastatin.

[Key words] Adenylate activated protein kinase Peroxisome proliferator activated receptor α Signal transducer and activator of transcription 3 Curcumin Macrophage

First-author’s address： The First Affiliated Hospital of Gannan Medical College， Ganzhou 341000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.24.006

動脈粥樣硬化是由內(nèi)皮細(xì)胞損傷暴露、誘導(dǎo)循環(huán)血漿中單核細(xì)胞系變形，與暴露的內(nèi)皮細(xì)胞中特定分子錨定并移入血管壁，促進(jìn)巨噬細(xì)胞衍生泡沫細(xì)胞形成，即為粥樣斑塊的早期[1-3]。姜黃素是從中藥姜黃的根莖中提取得到的多酚類化合物，給予姜黃素能夠顯著降低ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化病變中巨噬細(xì)胞的數(shù)量，也能降低兔主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中粘附分子的表達(dá)，提示姜黃素能夠從多個靶點(diǎn)干預(yù)動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展[4-6]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步從腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號通路探討姜黃素對血管壁巨噬細(xì)胞形成的影響機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究時間為2020年6-7月，人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞，由上海生物科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心提供;ApoE-/-小鼠80只，雌性小鼠40只，雄性小鼠40只，將其分為4組，每組10只雌性小鼠和10只雄性小鼠，平均重量（25.56±5.34） g，該小鼠由上海SLAC實(shí)驗(yàn)室提供，姜黃素（西安天豐生物科技有限公司），生產(chǎn)批號：118-39-5，純度≥98%。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1.1 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 將人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞分為空白對照組（n=20個）、脂多糖（LPS）組（5 μg/mL，n=20個）、LPS+辛伐他汀組（LPS 5μg/mL+辛伐他汀5 μmol/L，n=20個）、LPS+姜黃素組（姜黃素80 μmol/L預(yù)處理THP-1細(xì)胞2 h，然后5 μg/mL LPS刺激THP-1細(xì)胞0.5 h，n=20個）。每組各需要20個人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞，將20個單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞放入Transwell小室中，每個Transwell小室中放入一個單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞。采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測THP-1細(xì)胞的遷移能力，ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液腺苷酸活化蛋白激酶（HMGB1）和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）的表達(dá)水平，RT-PCR和Western blot法分別檢測AMPK、PPARα和STAT3 mRNA和蛋白的表達(dá)量。細(xì)胞培養(yǎng)：采用含10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 U/mL鏈霉素的RPIM-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，隔天換液。細(xì)胞接種密度為2×105/mL，用肉豆蔻酸佛波酯刺激24 h。

1.2.1.2 體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn) 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用載脂蛋白E（ApoE）小鼠隨機(jī)分為空白對照組（n=20）、模型組（n=20）、辛伐他汀組（0.2 mg/kg，n=20）和姜黃素組（80 mg/kg，n=20），除空白對照組外，其余各組皮下注射血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）1.44 mg/（kg·d），連續(xù)6周，空白對照組給予等量生理鹽水皮下注射。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，制作主動脈切片。采用CD68免疫組織化學(xué)染色法計(jì)算小鼠血管壁巨噬細(xì)胞的含量。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 Transwell遷移試驗(yàn) 將巨噬細(xì)胞鍍在24孔Transwell小室的下腔內(nèi)，各處理組的THP-1細(xì)胞懸液加入上腔。在×1 000視野下觀察遷移到下腔的THP-1細(xì)胞數(shù)目。

1.2.2.2 RT-PCR法 使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行互補(bǔ)DNA合成，設(shè)置反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，圖像分析儀掃描凝膠密度，分析得到mRNA的相對含量。

1.2.2.3 Western blot法 使用放射免疫沉淀試劑LS提取總蛋白質(zhì)，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離約30 μg蛋白裂解液，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，用抗PPARα、AMPK、STAT3抗體（1︰1 000稀釋度）和GAPDH（1︰2 000稀釋度），然后分別與次級抗體孵育。放射自顯影技術(shù)進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光培養(yǎng)。

1.2.2.4 CD68免疫組織化學(xué)染色法 10%水合氯醛麻醉小鼠，收集主動脈制作成5 μm厚切片，CD68免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀察血管壁巨噬細(xì)胞數(shù)目。

1.3 觀察指標(biāo) 比較各組人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞遷移的數(shù)目;比較各組體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)HMGB1和MCP-1蛋白表達(dá)水平;比較各組體外實(shí)驗(yàn)

AMPK/PPARα/STAT3 mRNA相對表達(dá)量;比較各組小鼠血管壁巨噬細(xì)胞含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析;計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外實(shí)驗(yàn)中四組細(xì)胞遷移能力比較 空白對照組、LPS組、LPS+辛伐他汀組、LPS+姜黃素組細(xì)胞數(shù)目分別為（3.5±1.1）、（15.6±3.4）、（10.2±3.1）、（7.3±2.4）個。LPS組細(xì)胞的遷移能力較空白對照組顯著升高，LPS+辛伐他汀組和LPS+姜黃素組較LPS組下降，且LPS+姜黃素組明顯低于LPS+辛伐他汀組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。四組細(xì)胞遷移能力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=73.889，P=0.000）。

2.2 體外實(shí)驗(yàn)中四組細(xì)胞HMGB1和MCP-1蛋白表達(dá)水平比較 LPS組細(xì)胞HMGB1和MCP-1蛋白表達(dá)水平均較空白對照組顯著升高，LPS+辛伐他汀組和LPS+姜黃素組均較LPS組下降，且LPS+姜黃素組明顯低于LPS+辛伐他汀組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。體外實(shí)驗(yàn)中四組細(xì)胞HMGB1和MCP-1蛋白表達(dá)水平的比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.3 體外實(shí)驗(yàn)中四組細(xì)胞AMPK/PPARα/STAT3 mRNA相對表達(dá)量比較 LPS組細(xì)胞AMPK和PPARα mRNA相對表達(dá)量均較空白對照組顯著降低，而STAT3 mRNA相對表達(dá)量升高，LPS+辛伐他汀組和LPS+姜黃素組細(xì)胞AMPK和PPARα mRNA相對表達(dá)量均較LPS組升高，STAT3 mRNA相對表達(dá)量均降低，且LPS+姜黃素組細(xì)胞AMPK和PPARα mRNA相對表達(dá)量均較LPS+辛伐他汀組升高，STAT3 mRNA相對表達(dá)量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。體外實(shí)驗(yàn)中四組細(xì)胞AMPK/PPARα/STAT3 mRNA相對表達(dá)量的比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.4 體外實(shí)驗(yàn)中四組細(xì)胞AMPK/PPARα/STAT3蛋白相對表達(dá)量的比較 LPS組細(xì)胞AMPK和PPARα蛋白相對表達(dá)量均較空白對照組顯著降低，而STAT3蛋白相對表達(dá)量升高，LPS+辛伐他汀組和LPS+姜黃素組細(xì)胞AMPK和PPARα蛋白相對表達(dá)量均較LPS組升高，STAT3蛋白相對表達(dá)量均降低，且LPS+姜黃素組細(xì)胞AMPK和PPARα蛋白相對表達(dá)量均較LPS+辛伐他汀組升高，STAT3蛋白相對表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。體外實(shí)驗(yàn)中四組細(xì)胞AMPK/PPARα/STAT3蛋白相對表達(dá)量的比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.5 體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)中四組血管壁巨噬細(xì)胞含量的比較 體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)顯示，空白對照組、模型組、辛伐他汀組、姜黃素組的細(xì)胞數(shù)目分別為（3.4±1.1）、（15.6±3.4）、（10.2±3.2）、（7.6±2.5）個。模型組血管壁巨噬細(xì)胞含量明顯高于空白對照組，辛伐他汀組和姜黃素組均明顯低于模型組，姜黃素組顯著低于辛伐他汀組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。四組血管壁巨噬細(xì)胞含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=30.236，P=0.000）。

3 討論

姜黃素通常被用于膳食香料和食品著色劑等方面[7-8]，當(dāng)機(jī)體每日攝入姜黃素450～8 000 mg，持續(xù)1～4個月，可顯著降低收縮壓、血清甘油三酯和低密度脂蛋白水平，降低心血管病發(fā)生風(fēng)險，明顯改善內(nèi)皮功能[9-11]。

本研究結(jié)果提示動脈硬化的單核細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移能力，是粥樣硬化斑塊形成的主要因素。辛伐他汀具有抑制單核細(xì)胞遷移的能力，并且姜黃素的抑制效應(yīng)更強(qiáng)于辛伐他汀[12-14]。HMGB1和MCP-1蛋白均是單核細(xì)胞激活后釋放的主要活性分子，表示單核細(xì)胞吞噬病原體和異物的能力，也是單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞和平滑肌下泡沫樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的主要活性因子[15-17]。AMPK/PPARα/STAT3途徑參與了動脈粥樣硬化的形成過程，同時姜黃素能夠通過抑制AMPK/PPARα/STAT3途徑進(jìn)而影響動脈粥樣硬化的形成[18-20]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組血管壁巨噬細(xì)胞含量明顯高于空白對照組，辛伐他汀組和姜黃素組明顯低于模型組，且姜黃素組顯著低于辛伐他汀組。姜黃素具有減少動脈粥樣硬化不同動物模型中動脈瘤變的發(fā)展作用。

綜上所述，姜黃素能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞遷移及血管壁巨噬細(xì)胞的形成過程，可能通過調(diào)節(jié)AMPK/PPARα/STAT3途徑發(fā)揮作用，效果優(yōu)于辛伐他汀。

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（收稿日期：2020-09-23） （本文編輯：姬思雨）