楊 威，郭健敏，陳文培，雷夏凌，柳 璐，韓 玲

（1.廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司，廣東省藥物非臨床評價研究企業(yè)重點實驗室，國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心中藥非臨床評價分中心，廣東省創(chuàng)新藥物評價與研究工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510990；2.國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，北京 100022；3.香港科技大學(xué)，香港 999077）

生殖毒性研究是藥物非臨床安全性評價的重要內(nèi)容，是創(chuàng)新藥物研發(fā)中的必經(jīng)環(huán)節(jié)。國內(nèi)外對傳統(tǒng)小分子化藥和中藥等進行藥物評價時，多采用經(jīng)典的三段式動物試驗評價法。經(jīng)典方法使用動物數(shù)量多，試驗周期長，試驗費用高，增大了藥物研發(fā)的風(fēng)險。為彌補經(jīng)典方法的不足，生殖毒性替代試驗方法應(yīng)運而生。歐洲替代方法驗證中心（Euro?pean Centre for the Validation of Alternative Method，ECVAM）于1996-2000年驗證并推薦3個替代試驗，分別為胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESC）試驗（ESC test，EST）、胚胎細(xì)胞微團培養(yǎng)（embryonic cell micromass culture，MM）試驗和全胚胎培養(yǎng)（whole embryo culture，WEC）試驗，以評估其區(qū)分無胚胎毒性、弱胚胎毒性和強胚胎毒性藥物的準(zhǔn)確性［1］。驗證結(jié)果表明，3種體外胚胎毒性試驗?zāi)軌驅(qū)⒕哂信咛ザ拘缘幕衔镞M行分類（無、弱或強胚胎毒性），準(zhǔn)確性分別達78%，70%和80%，而且三者對強胚胎毒性化合物的靈敏度高達100%。3種體外胚胎毒性試驗的可重復(fù)性是可接受的。

2009-2016年，多項研究［2-4］對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性模型的評價方法進行了驗證。22種已知胚胎毒性的化合物的驗證結(jié)果表明，所有化合物的斑馬魚試驗結(jié)果與傳統(tǒng)動物試驗及臨床表現(xiàn)一致［2］，靈敏度為100%，特異性為100%，提示斑馬魚胚胎發(fā)育毒性模型可用于區(qū)分致畸性和非致畸性化合物，斑馬魚胚胎發(fā)育毒性試驗可作為發(fā)育毒性評價的又一替代試驗。

中藥應(yīng)用歷史悠久，隨著中藥國際化浪潮的掀起，現(xiàn)代中藥研發(fā)和毒性評價循證于“臨床-非臨床-臨床-上市后研究”模式而實現(xiàn)全程式中藥安全評價和監(jiān)管。全程式中藥安全評價和監(jiān)管提出，對研究薄弱的特殊毒性如生殖毒性、遺傳毒性和致癌試驗等，更應(yīng)該貫徹執(zhí)行“動物試驗發(fā)現(xiàn)潛在毒性-臨床試驗繼續(xù)完成毒理學(xué)研究-上市后再評價”的評價監(jiān)管策略［5］。受歷史和科技條件的限制，多數(shù)中藥在應(yīng)用于人體之前并未按要求進行嚴(yán)格的生殖毒性評價。國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心于2008-2016年受理審評的792個中藥新藥品種，僅5.3%提供了生殖毒性研究資料［6］。即使是《中華人民共和國藥典》（2015版）收錄的83味毒性中藥，亦只是部分進行了生殖毒性評價［7］。人體生殖毒性宏觀水平檢查的不足以及倫理上的限制，均意味著特定生殖毒性臨床試驗的難實現(xiàn)性以及非臨床研究的迫切需求［8］。隨著國家對中藥新藥研發(fā)重視程度的提高（如即將到來的經(jīng)典名方研究），必將推動中藥安全性評價要求和水平的提高，也必將研發(fā)出更多安全有效的中藥新藥。

無論是目前臨床上正在使用的中藥或是創(chuàng)新中藥新藥，若是均按經(jīng)典方法進行全面的生殖毒性評價，無疑將會耗費大量的資源。但若采用替代試驗對中藥進行生殖毒性研究，并優(yōu)先對替代試驗中發(fā)現(xiàn)有毒性的中藥進行全面的生殖毒性評價；對替代試驗中未見明顯生殖毒性的中藥延后進行生殖毒性研究，這樣則非常有利于推動中藥生殖評價和中藥生殖毒性背景數(shù)據(jù)庫的建立。本文就常見的4種生殖毒性替代方法及其在中藥評價中的應(yīng)用進行綜述。

1 胚胎干細(xì)胞試驗

1.1 原理和方法

ESC是早期胚胎中分離出來的一類細(xì)胞，具有可體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性。無論在體外還是體內(nèi)環(huán)境，ESC在特定條件下均能被誘導(dǎo)分化為機體幾乎所有類型的細(xì)胞。驗證的EST是通過檢測受試物對ESC D3細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的過程的影響，結(jié)合受試物對ESC與纖維母細(xì)胞3T3細(xì)胞毒性實驗的結(jié)果，判斷受試物對胚胎發(fā)育的毒性［9］。

ESC試驗包括細(xì)胞毒性試驗和分化試驗。細(xì)胞毒性試驗使用小鼠纖維母細(xì)胞系3T3細(xì)胞和未分化的小鼠ESC D3細(xì)胞，以源自濃度-反應(yīng)曲線的3T3半數(shù)抑制濃度（3T3 50% inhibitory concentra?tion，IC503T3）和IC50D3為終點反映細(xì)胞毒性。分化試驗使用小鼠D3細(xì)胞，以源自濃度-反應(yīng)曲線的D3半數(shù)抑制分化濃度（D3 50% inhibited differenti?ation，ID50D3）為終點來反映細(xì)胞毒性。將上述終點參數(shù)代入判別函數(shù)進行計算，對受試物進行無胚胎毒性、弱胚胎毒性和強胚胎毒性分類。

1.2 優(yōu)缺點和改進方法

ESC獨有的特點是能夠在體外分化成胚胎的所有成分，包括形成每一個胚胎層（如外胚層、中胚層和內(nèi)胚層）以及這些胚體細(xì)胞后續(xù)的分化。因此，這個模型能評估多種與胚胎發(fā)育相關(guān)的事件。優(yōu)點是它可直接評估受試物對胚胎干細(xì)胞分化程度和對體細(xì)胞的毒性和（或）促增殖作用［10］。缺點是試驗系統(tǒng)使用的是小鼠細(xì)胞系，外推到人有不確定性；另外，其終點為形態(tài)學(xué)終點，要求操作人員有非常好的辨別心肌細(xì)胞搏動的經(jīng)驗，檢測通量相對較低。

針對以上局限性有學(xué)者提出改進。例如，試驗系統(tǒng)可使用人ESC源多能干細(xì)胞，減少外推的不確定性，也可把胚胎發(fā)育不同階段進行細(xì)分類，在ESC定向分化過程中給予毒性物質(zhì)干預(yù)建立特異性EST，也可使用人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，其具有與人ESC相同的分化能力且不涉及生物學(xué)倫理問題［11］。檢測終點方面可使用分子生物學(xué)技術(shù)檢測分化基因標(biāo)志物（如心肌細(xì)胞特異肌球蛋白重鏈蛋白）的表達［9］，也可同時檢測藥物對非心肌細(xì)胞分化（成骨分化、軟骨分化和神經(jīng)分化等）的抑制作用［12］。另外，胚胎毒性物質(zhì)作用引起小鼠D3胚胎干細(xì)胞分化細(xì)胞的場電位、心肌跳動結(jié)果具有一致性［13］，因此可通過檢測場電位而實現(xiàn)高通量篩查。

1.3 在中藥胚胎及發(fā)育毒性評價中的應(yīng)用

Li等［14］運用EST評估了白術(shù)、板藍根、黃連和芫花的胚胎毒性。測得白術(shù)的終點IC503T3，IC50ESC和ID50ESC分別為4.82，42.42和37.67 g·L-1，板藍根的終點結(jié)果分別為1.76，27.68和15.00 g·L-1，黃連的終點結(jié)果分別為0.40，2.73和1.06 g·L-1，芫花的終點結(jié)果分別為0.51，0.75和1.15 g·L-1。分類結(jié)果表明，白術(shù)和板藍根無胚胎毒性，黃連為弱胚胎毒性，芫花表現(xiàn)出強烈的胚胎毒性。張崴等［15］采用EST，通過實時定量PCR技術(shù)測定分化心肌細(xì)胞β肌凝蛋白重鏈mRNA評估黃芩苷的胚胎毒性。結(jié)果表明，黃芩苷具有弱胚胎毒性。夏荃等［16］基于EST評價川芎水煎液的胚胎毒性，發(fā)現(xiàn)川芎水煎液具有弱胚胎毒性；而該課題組前期進行的在體生殖毒性試驗結(jié)果也顯示，小鼠在攝入川芎32 g·kg-1劑量（相當(dāng)于臨床劑量的16倍）時存在死胎和吸收胎增加及胸骨和四肢骨骼發(fā)育畸形的情況；以上結(jié)果表明，川芎具有胚胎發(fā)育毒性。張志偉［17］用生半夏對Wistar大鼠連續(xù)ig給予3 d，獲取含藥血清以制備不同配伍的含藥血清，繼而對小鼠ESC進行干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生半夏粉劑組ESC增殖活性被顯著抑制，生半夏湯劑和粉劑可促進ESC晚期凋亡。以上結(jié)果表明，生半夏粉在劑量為每天3.45 g·kg-1時具有顯著的胚胎毒性，而干姜人參半夏湯或粉劑無明顯的胚胎毒性，作者推測這可能是通過“生姜解半夏毒”的作用機制實現(xiàn)的。

2 胚胎細(xì)胞微團培養(yǎng)試驗

2.1 原理和方法

MM試驗通過觀察培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)、集落形成數(shù)量、基質(zhì)變化和超微結(jié)構(gòu)變化評價外源性化學(xué)物質(zhì)對胚胎是否存在毒性作用，是介于單細(xì)胞培養(yǎng)和器官培養(yǎng)之間的一種體外實驗技術(shù)［18］。

ECVAM驗證的MM試驗使用的是大鼠肢芽細(xì)胞微團。在大鼠孕14 d時取出胚胎，顯微鏡下分離四肢肢芽，制備單細(xì)胞懸液，與受試藥物共培養(yǎng)，以阿利新藍染色法和中性紅染料攝入法測定活細(xì)胞總數(shù)、分化細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞團數(shù)，評估肢芽細(xì)胞的生長和分化。MM試驗以抑制阿利新藍染色ID50和降低中性紅攝取IC50為終點［18］，計算所得判別值，預(yù)測受試物的胚胎毒性并分類。

2.2 優(yōu)缺點和改進方法

MM試驗周期短，操作相對簡單，作為體外試驗也具有干預(yù)條件可控等優(yōu)點，但在ECVAM驗證的3種方法中其準(zhǔn)確性相對較低，原因可能為驗證的MM試驗使用的是肢芽微團，側(cè)重于枝芽細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化，更適用于區(qū)分強致畸毒性、弱致畸毒性和無致畸毒性物質(zhì)［19］。選擇對生命影響程度不同的組織細(xì)胞微團進行研究，能對受試物的胚胎毒性（心肌等）、致畸毒性（骨和上顎等）進行預(yù)判和致畸部位辯別［10］。

2.3 在中藥胚胎及發(fā)育毒性評價中的應(yīng)用

MM試驗在中藥胚胎毒性研究方面具有非常明顯的優(yōu)勢，因其不僅能觀察受試物的直接影響，還可研究代謝產(chǎn)物的毒性。將受試物和（或）代謝活化系統(tǒng)加至細(xì)胞培養(yǎng)液中，可觀察受試物體外代謝產(chǎn)物的細(xì)胞毒性和致畸性［20］；也可將妊娠大鼠暴露受試物一段時間后，取出微團細(xì)胞進行培養(yǎng)，觀察受試物體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的細(xì)胞毒性和致畸性［21］。

劉星等［22］ig給予雄性SD大鼠菟絲子10，20和40 g·kg-1，制備菟絲子含藥血清。體外培養(yǎng)大鼠胚胎前肢芽器官和后肢芽細(xì)胞微團，培養(yǎng)過程中加入含藥血清干預(yù)。結(jié)果表明，與陰性對照組相比，菟絲子40 g·kg-1組指突不明顯，掌指骨發(fā)育分化較差，形成集落數(shù)少，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2表達水平低，表明菟絲子40 g·kg-1含藥血清可抑制大鼠肢芽軟骨的發(fā)育和肢芽細(xì)胞的分化，菟絲子存在潛在的胚胎發(fā)育毒性。李麗娟等［23］取孕13 d小鼠胚胎后肢芽制備單細(xì)胞混懸液，加入相當(dāng)于406.25，1625.00和3250.00 mg生藥·L-1的續(xù)斷水煎液，結(jié)果在所采用的劑量范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)續(xù)斷對胚胎肢芽細(xì)胞生長發(fā)育的毒性，反而發(fā)現(xiàn)各劑量均不同程度地促進肢芽細(xì)胞的增殖和分化，并抑制肢芽細(xì)胞壞死和凋亡。韋興邦等［24］用不同比例的布依族經(jīng)方神闕散含藥血清干預(yù)正常大鼠中腦微團細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)含神闕散代謝產(chǎn)物的大鼠血清對中腦微團細(xì)胞的分化和增殖均未產(chǎn)生影響，從而初步判斷在其試驗劑量下神闕散無致畸毒性。

3 全胚胎培養(yǎng)試驗

3.1 原理和方法

WEC試驗以正處于器官形成期的胚胎為研究對象，此期的胚體組織對外在的物理和化學(xué)等因素極為敏感。ECVAM驗證的WEC試驗是在大鼠妊娠第10天，取體節(jié)數(shù)為1～5的胚胎在大鼠血清中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)48 h，以胚胎心跳和血液循環(huán)為胚胎存活指標(biāo)，卵黃囊直徑、顱臀長和體長、體節(jié)數(shù)及胚胎質(zhì)量作為配套胚胎生長發(fā)育指標(biāo)，按Brown&Fabro定義的改良評分系統(tǒng)對包括17項器官分化形態(tài)指標(biāo)進行評分。每濃度和對照孔分別收集7個胚胎的數(shù)據(jù)，以對照組的平均總形態(tài)學(xué)得分（total morpho?logical score，TMS，為評分系統(tǒng)中所有器官分?jǐn)?shù)的總和）為100%，計算各濃度的TMS。同時記錄每組胚胎畸形的數(shù)量和特征，計算各濃度組畸形或死亡胚胎的比例。WEC試驗有2個預(yù)測模型（prediction model，PM），PM1以畸形或死亡胚胎的無效應(yīng)濃度（ICNOEC）、IC50和ICmax為終點；在此基礎(chǔ)上，PM2補充3T3細(xì)胞毒性指標(biāo)IC503T3［25］。

3.2 優(yōu)缺點和改進方法

WEC試驗是一個完整的生物體模型系統(tǒng)，其優(yōu)點是比體內(nèi)試驗的相似度高，試驗周期短，評價效率高。Zhu等［26］使用沙利度胺初步驗證兔胚胎的WEC試驗，仍需要多類別的確證生殖毒性藥物進行驗證。WEC試驗不足之處為其隔離了母體影響（代謝和毒性），無法呈現(xiàn)母體-胎兒相互作用。可選擇性地加入母體因素到培養(yǎng)系統(tǒng)以彌補母體影響的缺失［10］，還可增加功能性終點、細(xì)胞死亡標(biāo)志物和形態(tài)學(xué)改變標(biāo)志物等。

3.3 在中藥胚胎及發(fā)育毒性評價中的應(yīng)用

肖凱［27］將10.5日齡大鼠胚胎與含不同濃度生草烏的大鼠血清培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)生草烏濃度≥1.25 g生藥·L-1具有抑制組織器官分化的毒性作用，濃度≥2.5 g生藥·L-1具有影響胚胎生長發(fā)育的毒性作用，且毒性效應(yīng)均具有劑量相關(guān)性。柳鵬等［28］將8.5日齡小鼠胚胎于含不同濃度人參皂苷Rb1的大鼠血清中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1濃度≥30 mg·L-1對胚胎多個組織器官的分化有明顯抑制作用，其中40 mg·L-1即使胚胎體節(jié)數(shù)量減少，50 mg·L-1時卵黃囊直徑和頭長也明顯縮短。該研究結(jié)果表明，人參皂苷Rb1在暴露劑量≥30 mg·L-1時具有一定的發(fā)育毒性，且認(rèn)為其發(fā)育毒性的作用機制可能是對卵黃囊胎盤結(jié)構(gòu)和功能的影響。

吡咯里西啶生物堿廣泛存在于世界上6000余種植物中。止咳化痰中藥款冬花含有13種吡咯里西啶生物堿，其中克氏千里光堿含量最高［29］。韓佳寅等［30-31］運用WEC試驗評價克氏千里光堿、千里光菲靈堿和倒千里光堿的胚胎毒性。結(jié)果表明，克氏千里光堿和千里光菲靈堿濃度≥25 mg·L-1時對胚胎的生長發(fā)育和形態(tài)分化均具有毒性；倒千里光堿濃度≥12.5 mg·L-1時抑制器官組織分化，濃度≥25 mg·L-1時影響胚胎生長發(fā)育。上述結(jié)果與該課題組前期研究千里光水提物、總生物堿提取物以及含千里光的中藥復(fù)方千柏鼻炎片對大鼠均有一定的致畸作用的結(jié)果一致，揭示總生物堿可能是含吡咯里西啶生物堿類植物的主要致畸成分群。

4 斑馬魚胚胎發(fā)育毒性模型

4.1 原理和方法

斑馬魚是除人和小鼠外的第3種模式動物。斑馬魚基因與人類基因的相似度高達87%，且其胚胎在母體外發(fā)育，胚胎小，發(fā)育時間很短〔受精后24 h（postfertilization 24 h，24 hpf）原代神經(jīng)元細(xì)胞開始分化，48 hpf后形成腦室，72 hpf整個器官形成期完成，6 d后形成所有的神經(jīng)系統(tǒng)〕，因此斑馬魚可作為評價藥物潛在胚胎發(fā)育毒性的理想模型［3］。

試驗時將雌雄斑馬魚按1∶2的比例交配，顯微鏡下剔除未受精的胚胎備用。將受試藥物先放入培養(yǎng)箱中預(yù)溫，然后在1～2 hpf內(nèi)選取發(fā)育正常且一致的胚胎，每孔放入15～20只，置28～29℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 hpf選出發(fā)育正常的胚胎并置裝有待測藥物的24孔板中，每孔1只，每板設(shè)2個濃度。繼續(xù)置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至144 hpf。在24，48，72和144 hpf用顯微鏡對眼、尾部延伸、心臟搏動、血液循環(huán)和自主游動等進行觀察，記錄死亡數(shù)和畸形數(shù)。正常胚胎用0表示，畸形胚胎用1表示，計算致死率和致畸率［3］。

4.2 優(yōu)缺點和改進方法

斑馬魚最明顯的優(yōu)勢為其強大的繁殖能力，短期內(nèi)可提供大量樣本，試驗成本相對較低。斑馬魚胚胎生長速度快，發(fā)育時間短，可在短的試驗周期內(nèi)覆蓋胚胎發(fā)育的全過程；并且胚胎透明，易于觀察，可進行靶器官的篩選。此外，斑馬魚具有一個非常獨特的優(yōu)勢，即48 hpf內(nèi)即可完成受試物心臟毒性測試，靈敏度達到ECVAM對替代毒性試驗推薦原則中“極好”的范疇［32］。吸收、分布、代謝和排泄是影響藥物毒性的關(guān)鍵因素。盡管斑馬魚肝表達與人體代謝相似的細(xì)胞色素P450酶如CYP3A4，但酶功能及其代謝藥物的過程與人體的差異還有待研究。最近研究報道，改良的斑馬魚試驗?zāi)軐衔锏闹禄芰M行定量預(yù)測及分級，預(yù)測能力達88%［33-35］。但驗證化合物數(shù)量有限，有待更多的驗證。

4.3 在中藥胚胎及發(fā)育毒性評價中的應(yīng)用

斑馬魚已廣泛應(yīng)用于環(huán)境毒物的監(jiān)測，近年來也被用于藥物毒理包括中藥胚胎發(fā)育毒性的研究。馬錢子堿是消腫止痛中藥馬錢子的有效成分，也是其毒性成分。張啟春等［36］運用斑馬魚模型評估馬錢子堿的致畸性和毒性作用。結(jié)果表明，馬錢子堿在濃度≥100 μmol·L-1時，斑馬魚胚胎孵化率明顯降低，其中 200 μmol·L-1可導(dǎo)致魚卵脊柱側(cè)彎、心包水腫和黑色素少等畸形現(xiàn)象。陳錫強等［37］觀察蒼耳子水提取物對斑馬魚發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)蒼耳子水提取物孵育濃度達到7.5 mg·L-1時開始呈現(xiàn)致胚胎死亡的毒性作用；≥11.25 mg·L-1時抑制斑馬魚的孵化，特別是15 mg·L-1時斑馬魚出現(xiàn)心臟積液和翹尾等畸形現(xiàn)象。該研究還發(fā)現(xiàn)，蒼耳子提取物0.93 mg·L-1明顯提高心率，而當(dāng)＞7.5 mg·L-1時顯著降低心率。董永新等［38］將斑馬魚胚胎浸入含不同濃度桔?？傇碥仗崛∥锶芤褐叙B(yǎng)殖，顯微鏡下觀察死亡和畸形。結(jié)果表明，高劑量（8 mg·L-1）組致死率和致畸率分別達80%和28%?；沃饕憩F(xiàn)為心包水腫、心前區(qū)血液淤積、軀干發(fā)育停滯和橫紋肌結(jié)構(gòu)改變等。

5 結(jié)語

中藥的開發(fā)和利用是中藥現(xiàn)代化的重要內(nèi)容之一，但中藥生殖毒性的研究目前處于嚴(yán)重滯后狀態(tài)，目前絕大多數(shù)中藥尚未按要求進行全面的生殖毒性研究。然而若將所有中藥均按經(jīng)典的三段式生殖毒性試驗進行評價，這將會是一個比較漫長且耗費非常大的工作。若能采用經(jīng)過驗證的體外替代試驗預(yù)先進行評價，將會給中藥生殖毒性的評價帶來事半功倍的效果。因此，按GLP要求建立經(jīng)過驗證的生殖毒性替代試驗體系是國內(nèi)的發(fā)展趨勢，也是快速解決中藥生殖毒性評價的新途徑。

由于中藥的化學(xué)成分復(fù)雜，體內(nèi)吸收代謝過程受眾多因素干擾，采取體外給藥的方式又存在無吸收代謝過程等問題，極大地增加了研究難度。鑒于這種情況，如果在體外替代試驗中使用含藥血清代替中藥粗提物，則能比較接近地反映藥物在體內(nèi)的狀態(tài)，發(fā)揮藥效的活性成分基本與體內(nèi)保持一致［22］。但為確保含藥血清的質(zhì)量，在制備含藥血清時應(yīng)使用合適的方法對血清相關(guān)成分進行測定，在可能的情況下將其與其他毒性試驗中毒代動力學(xué)試驗數(shù)據(jù)和（或）藥動學(xué)數(shù)據(jù)進行對比，以確保用于替代試驗的含藥血清的質(zhì)量符合要求。

浙江中醫(yī)藥大學(xué)團隊?wèi)?yīng)用已知胚胎毒性的10種中藥評價EST、MM試驗和WEC試驗在中藥胚胎毒性預(yù)測的準(zhǔn)確性和靈敏度時提出，應(yīng)用多個替代模型而非單個替代測試能更準(zhǔn)確預(yù)測受試中藥的毒性［39］，這也提示選擇體外替代試驗時需考慮并區(qū)分胚胎毒性和致畸性，正確選擇組合策略［40］。而在不能獲取同類或者相似成分藥物的安全性資料的情況下，可考慮根據(jù)需要逐步增加模型復(fù)雜性的測試策略［41］。例如，第一階段使用短周期細(xì)胞試驗檢測藥物對早期分化階段的影響；第二階段用長周期細(xì)胞胚胎毒性試驗檢測藥物對晚期分化階段的影響；第三階段使用胚胎試驗，根據(jù)胚胎的分子和形態(tài)變化檢測藥物胚胎毒性。

生殖毒性評價是涉及親代兩性、多階段的復(fù)雜問題，體外替代試驗因預(yù)測模型相對簡單，也存在體內(nèi)外代謝差異等一定的局限性，但體外替代試驗具有便捷高效的優(yōu)勢。近年來隨著各種新技術(shù)的出現(xiàn)以及人們對試驗節(jié)點拆分組合的思考，體外替代試驗在實踐中也有了新的改進和發(fā)展，也將會越來越多地用于藥物篩選、補充試驗和機制研究。