薛慧，胡永超，王娜，劉志彬，高峰

（華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，河北 唐山 063000）

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RQ-PCR）技術(shù)因其高度敏感性及特異性，已經(jīng)成為微小殘留病（minimal residual disease，MRD）檢測的重要手段［1］，其對基因標(biāo)志物的檢測不僅限于定性分析，而且可以定量分析，為臨床治療提供了重要依據(jù)。本研究選取28例行移植治療的初診為t（8；21）急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）患者（均為高危病例）為研究對象，應(yīng)用RQ-PCR技術(shù)檢測AML1-ETO基因水平，以此代表MRD，指導(dǎo)移植前后治療方案。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月至2018年12月于我院行移植治療且初診為t（8；21）的AML患者28例。其中，男17例，女11例，中位年齡37（14～57）歲。骨髓形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)均符合確診標(biāo)準(zhǔn)［2］，且融合基因分析為AML1-ETO陽性，不伴其他基因突變及染色體異常。

1.2 移植前治療

給予標(biāo)準(zhǔn)的柔紅霉素/去甲氧柔紅霉素/阿克拉霉素+阿糖胞苷誘導(dǎo)治療，經(jīng)1～2個(gè)療程獲得血液學(xué)完全緩解后，給予包含中大劑量阿糖胞苷的鞏固治療。

1.3 RQ-PCR技術(shù)指導(dǎo)高危病例選擇

應(yīng)用RQ-PCR技術(shù)，將骨髓血作為標(biāo)本，以初診時(shí)AML1-ETO基因水平為基線，高危病例選擇標(biāo)準(zhǔn)為2療程鞏固治療后AML1-ETO基因水平比初診時(shí)下降＜3個(gè)對數(shù)級或者AML1-ETO基因陰性后再次轉(zhuǎn)陽。

28例研究對象均符合高危病例，隨機(jī)分為2組：自體造血干細(xì)胞移植（autologous hematopoietic stem cell transplantation，AHSCT）組8例，其中，男5例，女3例，中位年齡40（21～57）歲，均給予改良白消安/環(huán)磷酰胺（北京大學(xué)人民醫(yī)院方案）參考方案［3］。異基因外周血造血干細(xì)胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，Allo-HSCT）組20例，其中，男12例，女8例，中位年齡32（14～56）歲。人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）全相合6例，HLA半相合14例，造血干細(xì)胞來源為親緣供者的外周血，均給予改良白消安/環(huán)磷酰胺±兔抗人免疫球蛋白參考方案［3］。

1.4 AML1-ETO基因水平的檢測方法

1.4.1 提取標(biāo)本RNA：收集患者肝素抗凝的骨髓血2～3 mL，淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞，按照Trizol試劑說明的操作流程，提取細(xì)胞總RNA，紫外線分光光度計(jì)（260 nm）檢測RNA的濃度，置于-80℃冰箱保存。

1.4.2 RNA逆轉(zhuǎn)錄：將樣本RNA稀釋到合適濃度，抽取10 μL加入PCR反應(yīng)管（內(nèi)含逆轉(zhuǎn)錄試劑），震蕩混勻，短暫離心，設(shè)置PCR反應(yīng)程序，將制備的cDNA置于-20 ℃冰箱備用。

1.4.3 反應(yīng)體系：使用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，反應(yīng)體系為10 μL，cDNA 1 μL，TaqMan探針0.2 mol/L，上下游引物各0.1 μmol/L。以ABL1基因?yàn)閮?nèi)參對照，測定AML1-ETO基因與內(nèi)參ABL1基因的拷貝數(shù)比值，以百分?jǐn)?shù)的形式表示，即AML1-ETO/ABL1（%）=（AML1-ETO拷貝數(shù)/ABL1拷貝數(shù)）×100%。

1.5 MRD監(jiān)測時(shí)機(jī)

初診時(shí)，鞏固化療周期結(jié)束血象恢復(fù)后，移植后1、2、3、6、9、12、18、24和36個(gè)月，常規(guī)抽取骨髓血做標(biāo)本，如果出現(xiàn)AML1-ETO基因轉(zhuǎn)陽或水平升高，半月后復(fù)查，如持續(xù)升高則給予干預(yù)或治療，如治療后連續(xù)2次AML1-ETO基因轉(zhuǎn)陰，則恢復(fù)常規(guī)頻率的檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，率的比較用χ2檢驗(yàn)，Kaplan-Meier生存曲線計(jì)算疾病無進(jìn)展生存率（free survival rate，PFS）及總生存率（total survival rate，OS）。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 移植后RQ-PCR技術(shù)指導(dǎo)下的干預(yù)治療

所有研究對象定期檢測骨髓血MRD水平，以MRD≥0.01%作為干預(yù)治療臨界值；移植后MRD轉(zhuǎn)陰指移植后+1月骨髓血MRD定量為0。AHSCT組中，3例移植后MRD持續(xù)陰性患者，未行干預(yù)治療；4例移植后MRD持續(xù)陽性、1例移植后MRD由陰性再次轉(zhuǎn)為陽性患者，給予含中大劑量阿糖胞苷的常規(guī)化療。Allo-HSCT組中，13例移植后MRD持續(xù)陰性患者，未行干預(yù)治療；4例移植后MRD持續(xù)陽性患者，早期給予減停免疫抑制劑、化療+預(yù)防性供者淋巴細(xì)胞輸注（donor lymphocyte infusion，DLI）（親緣供者經(jīng)重組人粒細(xì)胞刺激因子動(dòng)員的外周血干細(xì)胞輸注）；3例移植后MRD由陰性再次轉(zhuǎn)為陽性患者中，2例給予減停免疫抑制劑，1例3年后髓外復(fù)發(fā)患者，給予放化療治療。

2.2 移植后MRD水平與復(fù)發(fā)的關(guān)系

移植后根據(jù)MRD是否轉(zhuǎn)陰分為2組：MRD轉(zhuǎn)陰組共20例患者，其中，2例患者最終血液學(xué)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為10.0%（2/20）；MRD持續(xù)陽性組共8例患者，其中6例患者最終血液學(xué)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為75.0%（6/8）。2組比較，移植后MRD轉(zhuǎn)陰組的血液學(xué)復(fù)發(fā)率明顯低于MRD持續(xù)陽性組（P=0.002）。

2.3 Allo-HSCT組移植后血液學(xué)復(fù)發(fā)的單因素分析

外周血Allo-HSCT后血液學(xué)復(fù)發(fā)與HLA配型、移植后移植物抗宿主?。╣raft versus host disease，GVHD）的發(fā)生無明顯相關(guān)性；與移植后MRD是否轉(zhuǎn)陰有明顯相關(guān)性，MRD未轉(zhuǎn)陰患者有更高的血液學(xué)復(fù)發(fā)率。見表1。

2.4 臨床療效

表1 Allo-HSCT組血液學(xué)復(fù)發(fā)單因素分析

本研究中位隨訪時(shí)間為29（10～78）個(gè)月，隨訪時(shí)間截至2019年12月。AHSCT組中，3例移植后MRD持續(xù)陰性患者均無病生存；5例移植后MRD陽性（包括再次轉(zhuǎn)陽）患者中，3例死亡，2例帶病生存；本組3年P(guān)FS、OS分別為50.0%和72.9%，5年P(guān)FS、OS分別為33.3%和48.6%。Allo-HSCT組中，13例移植后MRD持續(xù)陰性患者均無病生存；7例移植后MRD陽性（包括再次轉(zhuǎn)陽）患者中，4例死亡，2例帶病生存，1例早期減停免疫抑制劑后MRD再次轉(zhuǎn)陰無病生存；本組3年P(guān)FS、OS分別為72.4%和84.4%，5年P(guān)FS、OS分別為64.4%和75.0%。

3 討論

t（8；21）（q22；q22）是AML-M2中最常見的重現(xiàn)性染色體易位，對應(yīng)其改變的AML1-ETO基因［4］在白血病發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用。主鴻鵠等［5］建議進(jìn)行疾病的分層治療，高危復(fù)發(fā)因素包括治療前c-KIT突變、鞏固治療2療程MRD下降＜3個(gè)對數(shù)級、MRD再次轉(zhuǎn)陽，符合以上任意1項(xiàng)危險(xiǎn)因素的患者均建議行Allo-HSCT，以降低復(fù)發(fā)、提高長期生存率。本研究選取28例高危t（8；21）AML患者為研究對象，經(jīng)包括中大劑量阿糖胞苷在內(nèi)的鞏固治療，隨機(jī)選擇不同的移植治療，結(jié)果顯示，Allo-HSCT組3年、5年P(guān)FS、OS明顯優(yōu)于AHSCT，提示有高危復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者更適宜選擇Allo-HSCT，AHSCT可以做為一個(gè)鞏固強(qiáng)化的手段改善預(yù)后，但不能明顯改善患者的長期生存。

本研究中，應(yīng)用RQ-PCR技術(shù)監(jiān)測MRD水平，在移植前篩選高危病例進(jìn)行移植治療，移植后預(yù)防疾病復(fù)發(fā)、指導(dǎo)治療方案選擇。尤其在Allo-PBSC組移植后的指導(dǎo)方案如下：MRD持續(xù)陰性，給予常規(guī)檢測、定期隨訪；MRD持續(xù)陽性，快速減停免疫抑制劑，給予預(yù)防性DLI+化療［6-7］；MRD由陰性再次轉(zhuǎn)陽，首先考慮減停免疫抑制劑［8］，視情況給予預(yù)防性DLI±化療。結(jié)果顯示，7例移植后MRD陽性（包括再次轉(zhuǎn)陽）患者在血液學(xué)復(fù)發(fā)前給予早期干預(yù)，隨訪至今僅4例復(fù)發(fā)死亡，提示在分子學(xué)復(fù)發(fā)或未緩解情況下，早期干預(yù)治療可降低血液學(xué)復(fù)發(fā)率，延長患者生存期。

隨訪至終點(diǎn)時(shí)間，血液學(xué)復(fù)發(fā)患者均臨床死亡，建議對復(fù)發(fā)的高?；颊呒霸邕M(jìn)行干預(yù)治療，而移植后MRD水平在預(yù)測疾病復(fù)發(fā)中也起到了重要的預(yù)測作用［9-10］。本研究結(jié)果顯示，移植后+1月MRD轉(zhuǎn)陰組的血液學(xué)復(fù)發(fā)率明顯低于MRD持續(xù)陽性組（P＜ 0.05）；同時(shí)，進(jìn)一步分析了Allo-HSCT組移植后血液學(xué)復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，結(jié)果顯示，移植后+1月MRD未轉(zhuǎn)陰患者有更高的血液學(xué)復(fù)發(fā)率。

綜上所述，在t（8；21）AML患者治療過程中，應(yīng)用RQ-PCR技術(shù)動(dòng)態(tài)檢測MRD水平，為治療提供了理論基礎(chǔ)和臨床依據(jù)，值得進(jìn)一步深入研究。