響應(yīng)面法優(yōu)化鷹嘴豆異黃酮提取工藝分析

蔣變玲，許雪華，孟康，常冉，陳瓊，韓方凱，段紅

（宿州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000）

鷹嘴豆(Cicer arietinum L)，別名雞豌豆、桃豆，是重要的食用豆類之一，它起源于中東，印度是其最大的生產(chǎn)國(guó)，在我國(guó)西北部廣泛種植[1-3]。鷹嘴豆中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，世界范圍內(nèi)需求量大[4]。

異黃酮是豆科植物家族特有的一類酚類次級(jí)代謝產(chǎn)物，包括鷹嘴豆、大豆、豌豆、蠶豆和扁豆等谷物食品和飼料植物[1]。鷹嘴豆異黃酮具有多種生物活性以及保健功能，其中包括降低心血管疾病和癌癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，抗氧化自由基、治療高脂血癥和糖尿病等[5]。但自然界中的異黃酮含量十分有限，而鷹嘴豆中異黃酮含量十分豐富（0.15～0.53 mg/g），是理想的提取原料[6-8]。

目前，異黃酮的提取方法大多采用溶劑萃取并加以微波、超聲波等方法聯(lián)合提取[9]。而酶法是一種新的提取方法，它通過纖維素酶分解樣品細(xì)胞壁，從而使細(xì)胞壁破壞，降低傳質(zhì)阻力，使內(nèi)容物更易流出[10]。此方法優(yōu)點(diǎn)眾多，酶的結(jié)合位點(diǎn)在適當(dāng)功率的超聲波的振蕩、空化等作用下發(fā)生變化，一定程度上能提高纖維素酶的活性，利用超聲波聯(lián)合酶解，能縮短酶解時(shí)間[11]。利用超聲聯(lián)合酶法提取鷹嘴豆異黃酮，此前未見報(bào)導(dǎo)。因此本研究采用脂鷹嘴豆生豆粉為原料，利用超聲聯(lián)合纖維素酶法提取鷹嘴豆生豆粉中的異黃酮，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選出3個(gè)顯著因素通過響應(yīng)面軟件進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳條件。旨在為從鷹嘴豆中高效提取異黃酮提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

DHG-9145A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-S型恒溫超聲鍋，國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；FA1104B型分析天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；SHZ-D型循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；UV-5100H型紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司。

1.2 材料與試劑

鷹嘴豆生豆粉，新疆天山奇豆生物科技有限公司；鷹嘴豆芽素A標(biāo)準(zhǔn)品，上海如吉生物科技有限公司；纖維素酶（綠色木酶，5.0×104U/g），上海源葉生物。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

參照溫海超等[6]方法，將1.0mg鷹嘴豆芽素A標(biāo)準(zhǔn)品用少量70%乙醇完全溶解，定容至10 mL。再將其梯度稀釋成0、0.000 2、0.000 5、0.001 0、0.001 5、0.002 0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)夜。在波長(zhǎng)241、261、281 nm下測(cè)其吸光度值，以校正吸光度值ΔA為縱坐標(biāo)，鷹嘴豆芽素A為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中ΔA的計(jì)算公式如下

1.3.2 異黃酮提取量的測(cè)定

原料預(yù)處理：鷹嘴豆生豆粉于50℃干燥箱中烘干至恒重，過40目篩備用。

鷹嘴豆異黃酮含量測(cè)定：準(zhǔn)確稱取1.0 g鷹嘴豆生豆粉置于具塞錐形瓶中，以35%乙醇溶液為酶解液，加入不同量的纖維酶，在不同超聲溫度、超聲時(shí)間和液料比條件下進(jìn)行酶解，反應(yīng)完成后向錐形瓶中加入一定量的無水乙醇至最終乙醇濃度為65%以終止酶解反應(yīng)，放入超聲波清洗機(jī)中提取20 min，抽濾后定容至100 mL，取1 mL稀釋10倍，測(cè)其吸光度值，鷹嘴豆異黃酮提取量的公式為

式中：C為根據(jù)鷹嘴豆芽素A計(jì)算得到的異黃酮濃度（μg/mL），V為定容體積（mL），N為稀釋倍數(shù)，M為鷹嘴豆生豆粉質(zhì)量（g）。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 酶添加量對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量的影響

控制其他實(shí)驗(yàn)條件一致，選取超聲溫度55℃，超聲時(shí)間60 min，液料比30∶1，乙醇濃度35%，考察不同酶添加量（以U/g底物表示，200、250、300、350、400 U/g）對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量影響。

1.3.3.2 超聲溫度對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量的影響

控制其他實(shí)驗(yàn)條件一致，選取超聲時(shí)間60 min，纖維素酶加入量為300 U/g，液料比30∶1，乙醇濃度35%，考察不同超聲溫度（45、50、55、60、65℃）對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量的影響。

1.3.3.3 超聲時(shí)間對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量的影響

控制其他實(shí)驗(yàn)條件一致，選取超聲溫度55℃，纖維素酶加入量為300 U/g，液料比30∶1，乙醇濃度35%，考察不同超聲時(shí)間（30、45、60、75、90 min）對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量影響。

1.3.3.4 酶解液液料比對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量的影響

其他實(shí)驗(yàn)條件一致，選取超聲溫度為55℃，超聲時(shí)間為60 min，纖維素酶加入量為300 U/g，乙醇濃度35%，考察不同液料比（表示為酶解液/樣品，10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1）對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量影響。

1.3.3.5 乙醇濃度對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量的影響

其他實(shí)驗(yàn)條件一致，選取超聲溫度為55℃，超聲時(shí)間為60 min，纖維素酶加入量為300 U/g，液料比為30∶1，考察不同乙醇濃度（25%、35%、45%、55%、65%）對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量的影響。

1.3.3.6 超聲功率對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量的影響

其他實(shí)驗(yàn)條件一致，選取超聲溫度為55℃，超聲時(shí)間為60 min，纖維素酶加入量為300 U/g，液料比為30∶1，乙醇濃度35%，考察不同功率（60、70、80、90、100 W）對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量的影響。

1.3.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

經(jīng)SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，選取對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量影響較大的3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Response surface test design

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

利用Design-Expert 8.0和SPSS對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

圖1 鷹嘴豆芽素A標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Chickpea A standard curve

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度和相應(yīng)吸光度值為橫、縱坐標(biāo)，得到回歸方程

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 纖維素酶使用量對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量影響

由圖2可知，纖維素酶使用量在200～300 U/g范圍內(nèi)，鷹嘴豆中異黃酮的提取量逐漸增加，這是由于隨著酶添加量增加，其對(duì)鷹嘴豆細(xì)胞壁的作用逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞壁通透性增大，異黃酮類物質(zhì)更易流出，鷹嘴豆異黃酮提取量增加[10]；當(dāng)纖維素酶添加量為300 U/g時(shí)，異黃酮提取量達(dá)到最大，為1.25 mg/g；繼續(xù)增加纖維素酶的使用量，由于其會(huì)包裹住鷹嘴豆生豆粉顆粒，使鷹嘴豆異黃酮類物質(zhì)難以溶出[12]，鷹嘴豆異黃酮提取量下降。酶添加量不宜過多，故選取250、300、350 U/g進(jìn)行優(yōu)化。

圖2 酶添加量對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量影響Fig.2 Effects of enzyme addition on the extraction of isoflavones

2.2.2 超聲溫度對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量影響

由圖3可知，超聲溫度低于55℃時(shí)，隨著溫度升高，鷹嘴豆異黃酮的提取量逐漸增加；超聲溫度大于55℃時(shí)，鷹嘴豆異黃酮的提取量逐漸減小。這是由于隨著溫度的增加，纖維素酶活性逐漸增大，酶解反應(yīng)加快，異黃酮類物質(zhì)溶出量增多，溫度繼續(xù)升高，纖維素酶肽鏈結(jié)構(gòu)改變，生理活性降低，酶逐漸變性失活[13]，鷹嘴豆異黃酮的提取量下降。超聲溫度不宜過高，故選取50、55、60℃進(jìn)行優(yōu)化。

圖3 超聲溫度對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量影響Fig.3 Effects of ultrasonic enzymatic hydrolysis temperature on the extraction of isoflavones

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量影響

由圖4可知，當(dāng)超聲時(shí)間小于60 min時(shí)，鷹嘴豆異黃酮的提取量增加；當(dāng)超聲時(shí)間大于60 min時(shí)，鷹嘴豆異黃酮的提取量逐漸減小。隨著時(shí)間的增加，酶解反應(yīng)趨于完全，且纖維素酶活性下降，粘液等雜質(zhì)也會(huì)溶出[14]，影響鷹嘴豆異黃酮提取量，使鷹嘴豆異黃酮提取量下降，故選取45、60、75 min優(yōu)化。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量影響Fig.4 Effects of ultrasonic enzymatic hydrolysis time on the extraction of isoflavones

2.2.4 酶解液液料比對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量影響

由圖5可以看出，酶解液液料比在10∶1～30∶1之間，鷹嘴豆異黃酮的提取量增加；當(dāng)酶解液液料比大于30∶1時(shí)，鷹嘴豆異黃酮提取量減少。這是由于液料比升高，增大了鷹嘴豆生豆粉與纖維素酶的接觸面積，加快了酶促反應(yīng)速率，鷹嘴豆異黃酮溶出量增加[15]。而當(dāng)酶解液液料比大于30∶1時(shí)，隨著溶劑的增加，可能使其他物質(zhì)溶出，進(jìn)而影響到鷹嘴豆異黃酮的提取量。

圖5 液料比對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量影響Fig.5 Effects of ratio of material to liquid on the extraction of flavonoids

2.2.5 乙醇濃度對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量的影響

由圖6可知，當(dāng)酶解液的乙醇濃度在25%～35%之間時(shí)，鷹嘴豆異黃酮的提取量有稍微上升趨勢(shì)；當(dāng)乙醇濃度在35%～55%之間，鷹嘴豆異黃酮的提取量顯著降低；當(dāng)乙醇濃度在55%～65%范圍，鷹嘴豆異黃酮的提取量趨于平緩，推測(cè)乙醇濃度的增加會(huì)影響酶的活性，當(dāng)乙醇濃度在65%時(shí)，纖維素酶幾乎完全失活。這與劉長(zhǎng)嬌等人[16]報(bào)道較為一致。

圖6 乙醇濃度對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量影響Fig.6 Effectsof ethanol concentration on theextraction of flavonoids

2.2.5 超聲功率對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量的影響

由圖6可知，高大維等[17]報(bào)道超聲功率對(duì)纖維素的活性有一定的影響。本文發(fā)現(xiàn)，隨超聲功率的增加，鷹嘴豆異黃酮的含量呈波動(dòng)時(shí)下降，在超聲功率為80 W時(shí)，異黃酮提取量最高為1.34 mg/g，而后顯著下降。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Response surface test design and results

根據(jù)Design-Expert 8.0軟件對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，擬合得到方程為

2.3.2 方差分析

由表3可知，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)模型P＜0.01，差異極具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鷹嘴豆異黃酮提取量與3個(gè)變量之間有良好的一致性。失擬項(xiàng)P=0.268 4＞0.05，模型失擬，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明能充分反映實(shí)際情況。決定系數(shù)R2=0.965 5，說明該模型優(yōu)化的響應(yīng)值真實(shí)可靠，本模型可以用于對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。通過表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，C、A2、B2對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量影響極具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由F值可知，超聲時(shí)間對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量影響最大，酶添加量次之，超聲溫度影響最小。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

2.3.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)響應(yīng)面曲面圖中曲線坡度的陡峭程度，判斷各因素對(duì)提取量的影響大小[18]。由表3結(jié)合圖6，圖7和圖8可知，AB、AC、BC之間交互作用均不顯著。

圖6 酶添加量與超聲溫度對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量影響曲面圖Fig.6 Effect of enzyme addition amount and ultrasonic enzymatic hydrolysis temperature on the extraction of isoflavones

圖7 超聲功率對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量影響Fig.7 Effects of ultrasonic power on the extraction of flavonoids

圖7 酶添加量與超聲時(shí)間對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量影響曲面圖Fig.7 Effect of enzyme addition amount and ultrasonic enzymatic hydrolysis time on the extraction of isoflavones

圖8 超聲溫度酶解與時(shí)間對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取量影響曲面圖Fig.8 Ultrasonic enzymatic hydrolysis enzymatic hydrolysis and time on the isoflavone extraction amount

2.3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行分析，鷹嘴豆異黃酮提取量的最佳條件為：酶添加量6.122 mg/g、酶解液30 mL，55.21℃超聲處理44.96 min，在此條件下鷹嘴豆異黃酮提取量為1.320 24 mg/g。為便于實(shí)際操作，修正實(shí)驗(yàn)條件為纖維素酶添加量6.1 mg/g、液液料比1∶30，55℃超聲處理45 min。在此條件下重復(fù)3次，測(cè)得鷹嘴豆異黃酮提取量為1.320 24 mg/g，與預(yù)測(cè)值1.320 76 mg/g接近，證明所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。本文所得異黃酮提取量高于溫海超等[6]（0.150 7 mg/g）、吳敏等[7]（0.529 mg/g）以及程珍等[8]（0.16 mg/g）所測(cè)得的鷹嘴豆中異黃酮含量，因此本實(shí)驗(yàn)的鷹嘴豆異黃酮提取率高于傳統(tǒng)方法。

3 結(jié)論與討論

異黃酮的提取方法較多，酶法主要采用纖維素酶使植物組織細(xì)胞受到破壞，進(jìn)而降低細(xì)胞壁傳質(zhì)阻力，提高提取效率[6]。大量研究表明，超聲聯(lián)合酶法對(duì)鷹嘴豆異黃酮及黃酮的提取效率優(yōu)于同等條件下超聲波、纖維素酶單獨(dú)提取效率，且高于傳統(tǒng)提取方法[19-21]。

超聲聯(lián)合纖維素酶法提取鷹嘴豆異黃酮。結(jié)果表明，酶添加量306.03 U/g，液料比30∶1，55.21℃超聲處理45 min為最佳條件，在這些條件下鷹嘴豆異黃酮的提取量為1.320 24 mg/g，接近預(yù)測(cè)理論值。與傳統(tǒng)方法相比，該方法顯著提高了鷹嘴豆異黃酮的提取量，且該提取工藝操作簡(jiǎn)便、安全環(huán)保，有很好的應(yīng)用前景，為鷹嘴豆異黃酮的提取提供一定的參考。