百日草炭疽病病原菌的分離鑒定及防治藥劑篩選

李 文, 何月秋, 王佳瑩, 王國良, 王志龍*,

(1. 寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 寧波 315100；2. 寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 寧波 315012；3. 浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100)

百日草Zinnia elegans Jacq. 又名百日菊，是菊科百日菊屬的一年生草本花卉。原產(chǎn)墨西哥，有單瓣、重瓣、卷葉和各種不同花色[1]。百日草喜歡溫暖的環(huán)境，因?yàn)槠溟_花時(shí)間長、花色鮮艷、花形優(yōu)美，在全世界廣泛種植，是園林綠化常用的觀賞花卉[2-3]。百日草上的病害較少，主要以細(xì)菌性葉斑病報(bào)道較多，該病發(fā)病率高，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)90%，嚴(yán)重影響百日草的觀賞價(jià)值[4-6]。而對(duì)于百日草炭疽病，尚未見系統(tǒng)的病原菌鑒定及藥劑防治方面的研究。

2019 年5 月到6 月期間，在浙江省寧波市植物園的百日草種植園區(qū)發(fā)現(xiàn)了一種葉部病害，該病害在苗期和成株期均可發(fā)病，下部葉片先發(fā)病，逐漸擴(kuò)散到上部葉片。葉片發(fā)病后會(huì)產(chǎn)生圓形、多角形或不規(guī)則形灰色或黑褐色病斑，多個(gè)病斑逐漸擴(kuò)大，聯(lián)合形成大的枯死斑。調(diào)查顯示，類似的病害癥狀在寧波植物園、寧波市北侖區(qū)春曉社區(qū)、四明山國家森林公園和寧波市區(qū)種植百日草的路邊花壇均有發(fā)生，個(gè)別養(yǎng)護(hù)管理不到位的區(qū)塊，該病害的發(fā)病率高達(dá)80%。該病造成百日草葉片提早脫落，嚴(yán)重影響花朵的大小，縮短花期，降低百日草花海的觀賞價(jià)值。本研究按照柯赫氏法則對(duì)發(fā)病葉片進(jìn)行病原物的分離、回接，以明確致病菌，然后結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及分子生物學(xué)方法，對(duì)病原菌進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定。同時(shí)，采用菌絲生長率法，測(cè)定了9 種殺菌劑制劑對(duì)該病原菌的殺菌活性，旨在為百日草炭疽病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑及培養(yǎng)基

次氯酸鈉溶液，購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，用蒸餾水定容至1 000 mL。75%肟菌 · 戊唑醇水分散粒劑(WG，總有效成分含量75%，其中戊唑醇50%，肟菌酯25%)、35%氟菌 · 戊唑醇懸浮劑 (SC，總有效成分含量35%，其中戊唑醇17.5%，氟吡菌酰胺17.5%)、75%百菌清可濕性粉劑 (WP)、250 g/L嘧菌酯懸浮劑、50%咪鮮胺可濕性粉劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、10% 丙硫菌唑懸浮劑、500 g/L 氟啶胺懸浮劑和25%溴菌晴可濕性粉劑，分別購買于中國農(nóng)科院植保所中保綠農(nóng)集團(tuán)及先正達(dá) (蘇州) 作物保護(hù)有限公司。

1.2 試劑及儀器

DNA 提取試劑盒以及PCR 擴(kuò)增試劑盒2 × Taq PCR Mix，購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。LEH-70F 恒溫培養(yǎng)箱，浙江華宏一家科技有限公司；S1000 PCR儀，美國Bio-Rad 公司；Leica DM3000 光學(xué)顯微鏡，徠卡顯微系統(tǒng) (上海) 貿(mào)易有限公司。

1.3 病原菌分離及形態(tài)學(xué)鑒定

百日草炭疽病病葉于2019 年5 月24 日到6 月10 日期間采集于寧波植物園、寧波市北侖區(qū)春曉社區(qū)和四明山國家森林公園。每個(gè)采集地選取10 株發(fā)病植物，每株選取一個(gè)發(fā)病早期、具有典型癥狀的葉片。剪取病、健交界部分的組織，先用75%的酒精消毒30 s，用無菌水沖洗3 次；再將葉片浸泡在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的次氯酸鈉溶液中消毒2～3 min 后，用無菌水清洗3 次，置于無菌濾紙上吸干水分。轉(zhuǎn)移至PDA 平板上，置于25 ℃的光照培養(yǎng)箱內(nèi)于12 h/12 h 的光暗周期培養(yǎng)2～3 d。挑取菌落邊緣的菌絲，接種至空白PDA 平板上，置于25 ℃的光照培養(yǎng)箱中于12 h/12 h 的光暗周期下進(jìn)行純化培養(yǎng)。觀察并拍照記錄平板上菌落形態(tài)，通過Leica DM3000 光學(xué)顯微鏡觀察分生孢子及附著胞形態(tài)特征。每個(gè)菌株隨機(jī)觀察10 個(gè)視野，每個(gè)視野10～20 個(gè)分生孢子。測(cè)量分生孢子大小，并于斜面上保存分離得到的菌株。

1.4 病原菌致病性測(cè)定

參考Wang 等的方法[7]，從分離保存的菌株中隨機(jī)選擇3 個(gè)，于PDA 平板活化，25 ℃下黑暗培養(yǎng)7 d。收集分生孢子，用無菌水制成1 × 106個(gè)/mL的分生孢子懸浮液，噴灑在60 d 大小的健康百日草上，每個(gè)菌株處理10 株，然后置于25 ℃的光照培養(yǎng)箱內(nèi)于12/12 的光暗周期下保濕培養(yǎng)，并于接種后7～15 d 記錄發(fā)病情況。以噴灑無菌水的處理作為對(duì)照，每個(gè)處理3 次重復(fù)。對(duì)接種后15 d發(fā)病的葉片進(jìn)行再一次的病原菌分離。從形態(tài)學(xué)以及分子生物學(xué)兩方面，與之前接種的菌株進(jìn)行比對(duì)。

1.5 病原菌分子生物學(xué)分析

從分離保存的菌株中隨機(jī)選擇3 個(gè)菌株 (F1、F3 和F5) 進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。刮取在PDA 平板上生長了5 d 的菌絲，用真菌基因組DNA 提取試劑盒進(jìn)行DNA 的提取，參考相關(guān)文獻(xiàn)中的基因[8-12]，合成肌動(dòng)蛋白基因 (actin gene, ACT)、幾丁質(zhì)合酶基因 (chitin synthase A gene, CHS)、磷酸甘油醛脫氫酶基因 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (ribosomal internal transcribed spacer, ITS)、錳超氧化物歧化酶 (manganesesuperoxide dismutase, SOD2)、谷氨酰胺合酶 (glutamine synthatase-GS)、微管蛋白 (beta-tubulin-TUB2) 以及鈣調(diào)蛋白 (calmodulin, CaM) 8 個(gè)基因引物 (表1)，以提取的DNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系 (50 μL) 及程序如下：DNA 2.5 μL、上下游引物各2.5 μL、2 × Taq PCR Master Mix 25 μL，用無菌水補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

將PCR 產(chǎn)物送杭州擎科生物有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果上傳至GenBank，對(duì)應(yīng)的序列號(hào)見表2。從GenBank 下載標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)應(yīng)的序列 (表2)，用MEGA7 進(jìn)行8 個(gè)基因序列的聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析，用最大似然法 (Maximum Likelihood method, ML)以JTT 為模型構(gòu)建進(jìn)化樹，其中，該進(jìn)化樹的步長設(shè)為1 000[13]。

表1 PCR 擴(kuò)增引物Table1 PCR primers used in this study

1.6 殺菌活性測(cè)定

采用菌絲生長率法[14]測(cè)定殺菌劑制劑對(duì)百日草炭疽病菌的殺菌活性，參考鄧潔、楊曉琦等的方法選取9 種常見用于炭疽病防治的殺菌劑[15-16]，各殺菌劑制劑濃度見表3。以空白PDA 平板作為對(duì)照。從活化5 d 的菌落邊緣打孔，分別接種到含有不同濃度殺菌劑的PDA 平板中央，25 ℃的培養(yǎng)箱黑暗條件下培養(yǎng)5 d。然后用十字交叉法測(cè)量菌落的直徑，每個(gè)處理重復(fù)3 次。根據(jù)菌落直徑計(jì)算菌絲生長抑制率，用DPS 軟件計(jì)算出毒力回歸方程和有效抑制中濃度 (EC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 百日草炭疽病病原菌分離

百日草炭疽病于早春在百日草幼苗的葉片上開始發(fā)病，隨著植株的生長，逐漸由下部葉片向上蔓延。葉片發(fā)病后會(huì)產(chǎn)生圓形、多角形或不規(guī)則形灰色或黑褐色病斑，多個(gè)病斑逐漸擴(kuò)大，聯(lián)合形成大的枯死斑 (圖1)。經(jīng)柯赫氏法則分離得到15 株分離物，其菌落形態(tài)相同，分別編號(hào)為F1～F15。

2.2 百日草炭疽病分離物致病性檢測(cè)

隨機(jī)選擇3 株分離物，將其分生孢子懸浮液噴灑在健康的百日草植株上，接種10 d 后發(fā)現(xiàn)圓形、多角形病斑，15 d 后病斑擴(kuò)大，內(nèi)部灰色或黑褐色，對(duì)照無任何癥狀 (圖2a～2c)。對(duì)發(fā)病葉片再次進(jìn)行病原物的分離、純化，得到了與接種菌株相同的真菌。結(jié)果表明分離獲得的分離物確實(shí)為百日草炭疽病的致病菌。

表2 本研究所用菌株信息Table2 Bacterial strains used in this study

表3 不同殺菌劑制劑在培養(yǎng)基中的濃度梯度Table3 Concentration of fungicide in the medium

2.3 百日草炭疽病菌形態(tài)學(xué)鑒定

分離得到的15 株炭疽病菌具有一致的形態(tài)特征，菌絲生長初期為白色，中央絨狀平鋪，后期在菌落中央形成橘紅色的分生孢子堆。分生孢子單胞、無隔膜，橢圓形或卵圓形，兩端鈍圓，大小為 (15.6～17.3) μm × (4.6～5.1) μm (n = 50) (圖3)，符合Colletotrichum 的特征[17]。

2.4 百日草炭疽病菌分子生物學(xué)鑒定

為了進(jìn)一步明確分離物的種類，對(duì)分離的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。選取菌株F3，以C.gloeosporioides 特異性鑒定通用的8 個(gè)序列 (ACT、CHS、GAPDH、ITS、SOD2、GS、CaM 和TUB2)通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得相應(yīng)的目的片段。將8 個(gè)基因序列與C. gloeosporioides 家族中的其他23 個(gè)菌株的對(duì)應(yīng)序列進(jìn)行串聯(lián)，并在MEGA7.0版本中構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明，分離得到的菌株與C. siamense 聚在一起，同源性高達(dá)99%，屬于同一種真菌 (圖4)。結(jié)合分離物的形態(tài)學(xué)特征，明確該病原菌為暹羅刺盤孢菌Colletotrichum siamense。

2.5 9 種殺菌劑制劑對(duì)暹羅刺盤孢菌的殺菌活性測(cè)定

菌絲生長速率法測(cè)定結(jié)果 (表4) 表明，在9 種常用殺菌劑制劑中，500 g/L 氟啶胺懸浮劑和50%咪鮮胺可濕性粉劑對(duì)供試菌株菌絲生長的抑制作用最強(qiáng)，EC50值分別為0.002 9 和0.034 2 mg/L，而10% 丙硫菌唑懸浮劑抑制作用較弱。結(jié)果表明，500 g/L 氟啶胺懸浮劑和50%咪鮮胺可濕性粉劑可用于該病的化學(xué)防治。

表4 9 種殺菌劑制劑對(duì)暹羅刺盤孢菌的殺菌活性Table4 Antibiotic activities of 9 fungicides to C. siamense

3 小結(jié)與討論

百日草因其花色鮮艷、花期長，被廣泛栽培于城市綠地、公園[2-3]，但在浙江省寧波市多個(gè)百日草種植地已觀察到炭疽病的發(fā)生。本研究通過對(duì)百日草病葉系統(tǒng)性的觀察、病原菌的分離、致病性測(cè)定以及形態(tài)學(xué)分子生物學(xué)鑒定，證明引起百日草炭疽病的病原菌為暹羅刺盤孢菌Colletotrichum siamense。通過文獻(xiàn)查閱，由C. siamense 引起的炭疽病癥狀在多種植物上發(fā)現(xiàn)，包括香蕉和澳洲堅(jiān)果，但尚未見該病原物在百日草上的報(bào)道[18-19]。

本研究調(diào)查表明，炭疽病在百日草葉片上的擴(kuò)展，會(huì)嚴(yán)重影響百日草的正常生長，引起百日草葉片提早脫落，造成開花提早、花朵較小以及開花期縮短。炭疽病是植物上的一類重要真菌性病害，在多種園林植物以及作物上均有發(fā)生，對(duì)于炭疽病的防治，也有相關(guān)研究報(bào)道。劉霞等[20]研究結(jié)果顯示，咪鮮胺、戊唑醇和三唑酮對(duì)核桃炭疽病菌C. gloeosporioides 的防效比較好，其EC50值分別為0.07、1.45 和3.04 mg/L。胡曉穎等比較了5 種殺菌劑對(duì)桃炭疽病菌C. gloeosporioides的毒力，結(jié)果顯示，氟啶胺對(duì)桃樹炭疽病具有很好的防治效果[21]。也有報(bào)道顯示，咪鮮胺對(duì)柑橘葉片的炭疽病防治效果高達(dá)63% 以上，是防治該病的優(yōu)良藥劑[22]。咪鮮胺防治其他炭疽病，如草莓炭疽病的試驗(yàn)結(jié)果顯示，草莓炭疽病菌C. fructicola 對(duì)咪鮮胺非常敏感，EC50值為0.039 6 mg/L[23]。本研究結(jié)果顯示，500 g/L 氟啶胺懸浮劑和50%咪鮮胺可濕性粉劑對(duì)百日草炭疽病菌的EC50值分別為0.002 91 和0.034 2 mg/L，具有較高的殺菌活性，而75%肟菌 · 戊唑醇水分散粒劑、35%氟菌 · 戊唑醇懸浮劑以及10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑對(duì)百日草炭疽病也有較好的防治效果。氟啶胺屬于吡啶胺類殺菌劑，無內(nèi)吸和治療的作用，是一種保護(hù)性殺菌劑，可在百日草幼苗出土后噴灑，用作百日草幼苗炭疽病的預(yù)防。而咪鮮胺通過抑制麥角甾醇的生物合成，從而破壞病原菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能，達(dá)到抑制菌絲的生長的效果，可以和氟啶胺交替使用，在百日草成株期進(jìn)行病害的防治。75%肟菌 · 戊唑醇水分散粒劑、35%氟菌 · 戊唑醇懸浮劑和10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑的抑菌效果較好，75%肟菌 · 戊唑醇水分散粒劑和35%氟菌 · 戊唑醇懸浮劑均是混配劑，成本較高。苯醚甲環(huán)唑?qū)儆谌蝾悮⒕鷦?，通過抑制麥角甾醇合成，來達(dá)到殺菌的效果。雖然另外一種殺菌劑丙硫菌唑也能夠抑制麥角甾醇的合成，但它對(duì)百日草炭疽病的防效較差，說明雖然殺菌的原理相同，但不同的農(nóng)藥對(duì)百日草炭疽病的防效差異較大，需要通過科學(xué)的試驗(yàn)，來指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐。嘧菌酯是一種線粒體呼吸抑制劑，其主要抑制真菌分生孢子萌發(fā)，而對(duì)真菌菌絲生長的抑制效果不佳。本研究結(jié)果顯示，質(zhì)量濃度低至1 mg/L 的嘧菌酯懸浮劑即能夠強(qiáng)烈抑制百日草炭疽病菌分生孢子的形成，該藥劑是9 種農(nóng)藥制劑中唯一抑制分生孢子形成的藥劑 (圖S1)，因此，250 g/L 嘧菌酯懸浮劑也可以用于百日草炭疽病的防治。生產(chǎn)上常用的殺菌劑75%百菌清可濕性粉劑、25%溴菌晴可濕性粉劑及10%丙硫菌唑懸浮劑對(duì)該菌無顯著抑制作用，不作為該病害的有效化學(xué)防治手段。本研究結(jié)果和其他報(bào)道的炭疽病防治藥劑相比，500 g/L 氟啶胺懸浮劑和50%咪鮮胺可濕性粉劑兩種藥劑有著更加優(yōu)良的防治效果，可以為田間防治百日草炭疽病提供參考。