基于網(wǎng)絡藥理學方法探討尿毒靈復方治療糖尿病腎病的作用機制

黃樂宇 ，袁小紅 ，2＊＊

（1. 廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院 廣州 510120；2. 廣東省中醫(yī)院科學院 廣州 510006）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是比較典型的糖尿病微血管并發(fā)癥，其發(fā)病機制復雜，多種致病因素相互影響，其主要成因是患者的血糖持續(xù)升高、腎臟微血管發(fā)生病變而引起腎小球硬化，同時更是導致患者產(chǎn)生終末期腎病的重要原因[1]。其基本病理特征是腎小球毛細血管基底膜增厚，系膜基質(zhì)增生與腎小球硬化，臨床主要表現(xiàn)為蛋白尿、高血壓、水腫以及不同程度的腎功能損害[2]。隨著糖尿病的發(fā)病率不斷升高，DN 的發(fā)病率也呈上升趨勢。西方國家DN的發(fā)病率，占據(jù)了終末期腎病的近44%[3]?，F(xiàn)代西醫(yī)治療DN，基本以降糖、調(diào)脂，配合應用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）、血管緊張素受體拮抗劑（angiotensin receptor blocker，ARB）類藥物進行冶療[4]，但是不能完全阻斷DN 的發(fā)生和發(fā)展，中醫(yī)藥在治療DN 上有其獨特的優(yōu)勢，能夠顯著改善患者癥狀，有效減少尿蛋白，改善腎功能，從而延緩DN進程[5]。

中藥復方尿毒靈是廣東省中醫(yī)院黃春林教授長期以來治療糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)、慢性腎衰竭(chronic renal failure，CRF)、腎纖維化的有效方劑。該方為院內(nèi)制劑，主要由黃芪、大黃、三七、淫羊藿等中藥組成[6]，臨床研究表明該方可降低DN 患者的尿蛋白、尿白蛋白排泄率，同時可在一定程度上改善糖脂代謝紊亂，起到保護腎臟，延緩DN 和腎纖維化進程的作用[7]。中藥治療疾病是通過多成分作用于多靶點的錯綜復雜的過程，尿毒靈復方治療DN 也是如此，前期的研究結(jié)果表明，尿毒靈能夠抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞增殖[8]，阻止甚至逆轉(zhuǎn)腎小管上皮細胞的轉(zhuǎn)分化作用[6]，但這只是尿毒靈作用機制的一小部分，尚需要不斷地挖掘，深入研究。

網(wǎng)絡藥理學作為一門結(jié)合系統(tǒng)生物學及計算機技術的新興學科，目前已經(jīng)廣泛應用于中藥復方研究，多數(shù)復雜疾病都與復雜的生物網(wǎng)絡緊密相關，單靶點的干預策略對此多有不足，因此，以網(wǎng)絡為特點的復雜病證適宜于“多靶點”的組合干預[9]。為了更全面地探討尿毒靈的作用機制，本研究運用網(wǎng)絡藥理學的方法，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出尿毒靈中可能的活性成分，并將目標成分對應的靶點與DN 疾病靶點進行匹配，從而檢索出尿毒靈治療DN 的關鍵靶點，構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡，預測尿毒靈的活性成分及作用的靶點和通路，為進一步的作用機制研究提供依據(jù)。

1 方法

1.1 糖尿病腎病差異性表達基因的收集

應用 GeneCards（https://www.genecards.org/）、TTD數(shù)據(jù)庫（http://systemsdock. unit. oist. jp/iddp/home/index）、CTD 數(shù)據(jù)庫（http://ctdbase.org/）、DisGeNET 數(shù)據(jù) 庫 (http://www. disgenet. org/web/DisGeNET/menu/search)、DrugBank 疾病靶點篩選數(shù)據(jù)庫（https://www.drugbank.ca/），以“diabetic nephropathy”為檢索詞獲取DN 靶點。刪除重復冗雜的基因和假陽性基因，合并5個數(shù)據(jù)庫所獲得的數(shù)據(jù)，將最后篩選出的靶點基因全稱輸入DrugBank獲取基因簡稱和Uniprot ID。

1.2 尿毒靈復方中化學成分及預測靶點的收集

使用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）選擇與尿毒靈有關的化學成分，結(jié)合文獻報道，以藥物口服生物利用度（OB）≧30%，類藥性（DL）≧ 0.18 作為篩選條件[10-12]。借助蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Uniprot），限定物種為“人”，將收集到的靶點蛋白名稱轉(zhuǎn)換成基因的ID名稱。

1.3 “尿毒靈化學成分-作用靶點”網(wǎng)絡的構(gòu)建

將尿毒靈的預測靶點與DN 差異性表達基因取交集，所得交集靶點即為尿毒靈作用于DN 的預測靶點。利用Cytoscape 軟件構(gòu)建中藥化學成分-作用靶點網(wǎng)絡，探究預測靶點與化學成分之間的相互作用。

1.4 PPI 網(wǎng)絡的構(gòu)建及關鍵靶點篩選

在 STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）中分析蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的相互作用，導入交集靶點，得到尿毒靈作用于DN 的靶蛋白相互作用網(wǎng)絡。利用Cytoscape 軟件構(gòu)建網(wǎng)絡圖并對其進行分析，以自由度（Degree）、介數(shù)（Betweenness）、中心性（Closeness）都大于平均值作為關鍵靶點的篩選條件。

1.5 GO分析和KEGG通路富集分析

將交集靶點導入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo Sapiens”，設定閾值P＜ 0.01，進行GO 生物過程富集分析。設定閾值P ＜0.05，進行KEGG 通路富集分析。GO 富集分析結(jié)果以柱狀圖形式進行可視化展示，KEGG通路富集以氣泡圖的形式進行可視化展示。

1.6 整體研究思路

研究過程見圖1。

2 結(jié)果

2.1 DN相關差異性表達基因檢索結(jié)果

在 CTD、TTD、DISGENET 3 個 數(shù) 據(jù) 庫 中 以“diabetic nephropathy”為檢索詞獲取 DN 靶點，在DrugBank 數(shù)據(jù)庫中通過反向搜索藥物治療疾病靶點，排除未經(jīng)驗證的靶點，分別獲得靶點36 個、17 個、52個、475 個，刪除重復冗雜的基因共獲得基因靶點528個，將528個疾病靶點與GeneCard 搜索得到的2391個疾病靶點取交集，共獲得211 個疾病靶點,將靶點信息進行基因名和Uniprot ID的標準化。

2.2 候選化合物及靶點的篩選

收集尿毒靈中所含的化合物，在TCMSP 中，根據(jù)篩選閾值，共得到候選化合物67 個，其中10 個候選化合物無靶點，重復靶點僅保留1個，將靶點信息進行基因名標準化，共獲得152個化合物靶點。

2.3 成分-靶點網(wǎng)絡構(gòu)建及分析結(jié)果

圖1 整體研究思路

表1 尿毒靈中篩選出的與DN靶點相關的39個候選化合物成分

利用Bioinformatics & Evolutionary Genomics 平臺將化合物基因靶點與疾病基因靶點進行匹配并繪制韋恩圖（圖2），得到46個共同靶點基因，對應尿毒靈復方中的39 個候選化合物，化合物信息見表1。利用Cytoscape 作圖軟件繪制中藥化合物-靶點作用網(wǎng)絡，網(wǎng)絡中有85 個節(jié)點（其中化合物節(jié)點39 個，靶基因節(jié)點46 個）和323 條邊（圖3）。對靶點網(wǎng)絡進行分析，節(jié)點代表尿毒靈中的化學成分與潛在作用靶點；邊展現(xiàn)了化學成分和其作用靶點之間的相互聯(lián)系，根據(jù)網(wǎng)絡關系圖篩選出尿毒靈作用于DN 的目標化合物。以度值大小排序，前10 位化合物見表1，分別為槲皮素（quercetin），其次為山柰酚（kaempferol），β-谷甾醇（beta-sitosterol），木 犀 草 素（luteolin），7-O-methylisomucronulatol，豆甾醇（stigmasterol），蘆薈大黃素（aloe-emodin），異鼠李素（isorhamnetin），脫水淫羊藿素（Anhydroicaritin），C-Homoerythrinan,推測這些化合物可能是尿毒靈治療DN的關鍵化合物。

圖2 疾病靶點與化合物靶點基因的匹配

2.4 “尿毒靈-DN交集靶點”PPI網(wǎng)絡的構(gòu)建及關鍵靶點篩選

中藥治療疾病的機制是一個復雜的過程，不僅僅是通過直接地作用于信號通路，在靶點和通路之間可能存在一定程度的信號轉(zhuǎn)換。因此，對交集靶點進行PPI 網(wǎng)絡分析，以探究靶點之間相互作用的關系。如圖4所示，網(wǎng)絡中有45個靶點發(fā)生蛋白相互作用（1個靶點未發(fā)生蛋白相互作用），341 條邊表示蛋白的相互作用。利用Cytoscape 軟件對網(wǎng)絡進行分析，網(wǎng)絡中節(jié)點的平均自由度為15.2，平均介數(shù)為0.019，平均中心度數(shù)0.655，3 個數(shù)值均超過平均值的靶點有13 個（表2），推測這些靶點可能是尿毒靈治療DN 的關鍵靶點。

2.5 GO功能分析

選取P 值排名前10 的相關功能信息（表3、圖5）。結(jié)果顯示尿毒靈活性成分主要富集在應對藥物反應、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、ERK1和ERK2級聯(lián)的正向調(diào)節(jié)、細胞增殖的正向調(diào)控、以DNA 為模板轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、基因表達的正向調(diào)控、對雌二醇的反應、凋亡過程的負調(diào)節(jié)、成纖維細胞增殖的正向調(diào)控等生物過程中；分子功能方面參與了酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚體活性、藥物結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合類固醇激素受體活性、染色質(zhì)結(jié)合、細胞因子活性等；與細胞外間隙、質(zhì)膜、胞外區(qū)等細胞組成相關。

圖3 化合物-靶點網(wǎng)絡圖

圖4 尿毒靈治療DN靶蛋白PPI網(wǎng)絡圖

表2 尿毒靈治療DN的13個可能關鍵靶點的基本信息

2.6 KEGG通路富集分析結(jié)果

經(jīng)過KEGG 通路富集分析，顯示該46 個靶點顯著富集在78 條通路上（P＜ 0.05），其中與DN 相關的前5條通路分別為HIF-1 信號通路、TNF 信號通路、PI3KAkt 信號通路、MAPK 信號通路、VEGF 信號通路等（圖6），其中，PI3K-Akt信號通路的富集基因數(shù)最多，為12個基因；富集程度最高的通路為HIF-1 信號通路，富集的基因數(shù)為9 個，提示尿毒靈可能是通過以上多條通路作用于DN。

表3 藥物-疾病交集基因具有的功能信息

3 討論

DN 是糖尿病嚴重的并發(fā)癥之一，據(jù)估計，糖尿病導致的終末期腎病（end-stage renal disease，ESRD）占全世界發(fā)病患者的30%-47%[13]。其發(fā)病機制復雜，主要涉及血流動力學改變、細胞凋亡、炎癥刺激、氧化應激等各個方面[14]。近年來，中醫(yī)藥在防治DN 發(fā)生發(fā)展、改善腎功能惡化等方面均取得了較大進展。

廣東省名老中醫(yī)黃春林教授認為腎虛血瘀是DN發(fā)病的核心病機，腎主水液，腎臟蒸騰氣化作用的正常發(fā)揮取決于腎陽充沛與否，扶助腎元方可療其根本。針對DN 基本病機，由黃芪，大黃，淫羊藿，三七等中藥組成了尿毒靈方劑應用于臨床，方中黃芪配伍淫羊藿共為君藥，既能補氣健脾，又行溫腎助陽除濕之效。臣藥大黃活血通腑瀉濁，三七化瘀生新，以上四味藥合用，共奏益氣助陽、化瘀泄?jié)嶂?。嚴雪[7]對尿毒靈顆粒對于早中期DN 患者的臨床療效進行了初步的觀察與探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)尿毒靈顆?？梢燥@著改善早中期DN 患者的中醫(yī)臨床癥狀，能夠降低DN 患者的尿蛋白、尿白蛋白排泄率，并且在一定程度上改善糖脂代謝紊亂，起到延緩DN進展的作用。李顯波[15]在尿毒靈對DN 腎功能不全的臨床和實驗研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)尿毒靈治療后，DN 腎功能不全患者的臨床癥狀改善明顯，血肌酐和尿素氮水平降低，尿毒靈治療終末期DN療效確切，有效率達到86.67%。動物實驗研究表明尿毒靈可明顯改善DN 大鼠的癥狀，降低血肌酐和尿素氮，糾正脂質(zhì)代謝紊亂，減少蛋白尿的排泄，改善血液高凝狀態(tài)的作用。還能夠抑制腎組織中細胞外基質(zhì)的積聚，減少體內(nèi)尿素氮和肌酐的來源，延緩腎功能惡化的進程等[16-18]。細胞實驗結(jié)果表明，尿毒靈對高糖刺激的腎小球系膜細胞以及對TGF-β1 誘導的HK-2細胞均具有一定的保護作用。

圖5 GO富集分析柱狀圖

DN 的發(fā)病機制錯綜復雜，而尿毒靈的化學成分也很復雜，因此，其療效是多成分綜合作用的體系。網(wǎng)絡藥理學作為一門系統(tǒng)性的學科，可以構(gòu)建虛擬的多對多的復雜網(wǎng)絡體系，其以整體性、系統(tǒng)性、藥物相互作用的角度對復方中各中藥進行剖析，與中醫(yī)藥多成分、多靶點的特點不謀而合，是研究中藥復方物質(zhì)基礎的有力輔助篩選工具。為了更深入地探討尿毒靈的作用機制及藥效物質(zhì)基礎，本實驗以網(wǎng)絡藥理學的方法進行虛擬篩選，探討尿毒靈治療DN 的藥效成分和作用機制，為進一步的研究提供方向。

圖6 尿毒靈治療DN關鍵靶點參與的通路富集信息

構(gòu)建尿毒靈及DN的交集靶點PPI網(wǎng)絡，對網(wǎng)絡進行分析，得到 VEGFA，TP53，NOS3，TNF，RELA，IL-1β，IL-6，PPARG，CASP3，EGFR，PTGS2，AR，SOD1 等13 個關鍵靶點。據(jù)有關研究報道，VEGFA 在DN 動物腎臟中處于高表達的水平，干擾其表達后腎功能得到明顯改善[19]。microRNA-770-5p 通過靶向 TP53 調(diào)節(jié)凋亡抑制劑1 而調(diào)節(jié)足細胞凋亡，進而參與DN 的發(fā)展[20]。也有研究初步發(fā)現(xiàn)，NOS3 基因多態(tài)性可能與DN 易感性有關[21]。相關臨床研究發(fā)現(xiàn)，DN 組患者的TNF-α顯著高于 T2DM 組，推測 TNF-α可能與 DN 的發(fā)生發(fā)展有關[22]。在高糖刺激下糖尿病大鼠腎小球系膜細胞的p65，IL-1β，IL-6 增加[23-24]。過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR-γ）的蛋白含量及mRNA 水平變化在DN 患者血清中明顯降低，其下調(diào)與TGF-β1 水平的上調(diào)具有明顯負相關性，說明可能參與了DN 的發(fā)病進程[25]。報道發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-424 可以改善 DN 癥狀，通過降低Caspase-3 和bax 的表達水平以及增加bcl-2 的水平，顯著降低組織細胞的凋亡率[26]。徐政[27]發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）通過介導氧化應激與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激水平來調(diào)控DN。前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）是前列腺素生物合成中的關鍵酶，前列腺素E1 能夠改善早期DN 患者血管內(nèi)皮功能[28]。睪酮通過雄激素受體（androgen receptor，AR）改善波動性高糖導致人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷的作用減弱[29]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一種廣泛存在于生物體中的抗氧化因子，對抗氧化應激有著關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)DN 患者SOD 明顯低于健康對照組，SOD在輔助診斷2型DN方面具有較高的靈敏度和特異性，可將SOD 作為臨床早期診斷2型DN的輔助指標[30]。

度值是度量節(jié)點局部中心性的重要參數(shù)，指節(jié)點的直接鄰節(jié)點數(shù)目，認為一個節(jié)點的直接相連的節(jié)點數(shù)目越多，該節(jié)點的影響力就越大，用該參數(shù)衡量節(jié)點重要性簡單直觀。其中，中心節(jié)點為少量連接度很高的節(jié)點。它們作為網(wǎng)絡樞紐往往參與重要的生命活動，同時發(fā)揮著關鍵的生物學功能，對維系相互作用網(wǎng)絡的穩(wěn)定性起至關重要的作用[31]。從尿毒靈的成分-靶點網(wǎng)絡關系圖中，推測出復方中度值最高的前10個化合物依次為槲皮素，山奈酚，β-谷甾醇，木犀草素，7-O-methylisomucronulatol，豆甾醇，蘆薈大黃素，異鼠李素，脫水淫羊藿素等，說明這些化合物可能是尿毒靈治療DN 的潛在活性成分。其中的大多數(shù)成分在腎病的治療方面已用文獻報道，如王艷橋[32]發(fā)現(xiàn)槲皮素可以抑制高糖培養(yǎng)狀態(tài)下腎小球系膜細胞（glomerular mesangial cells，GMCs）的增殖，并具有時間、劑量依賴效應。山奈酚可以抑制GMCs 異常增殖與細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度分泌，進而延緩了腎小球硬化的進程，起到治療DN 的作用[33]。木犀草素能夠通過上調(diào)Nrf2 激活抗氧化酶SOD、HO-1、γ-GCS 的表達，對 STZ 誘導的 DN 小鼠發(fā)揮腎臟保護作用[34]。另有文獻報道，用豆甾醇處理過的糖尿病大鼠，血清葡萄糖水平、尿酸、肌酐和血脂水平上產(chǎn)生顯著的衰減；此外，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和脂質(zhì)過氧化反應水平均有改善，且腎臟中晚期糖基化產(chǎn)物的形成也明顯減少[35]。異鼠李素能夠劑量依賴性抑制糖尿病大鼠腎組織中NF-κB 系統(tǒng)的過度活化，降低炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1 和 TGF-β1 的蛋白和mRNA 水平[36]。對所得的成分-靶點網(wǎng)絡進行分析，結(jié)合文獻報道，槲皮素可通過抑制NF-κB 激活降低炎癥環(huán)境中IL-1β的含量[37]。山奈酚能夠通過靶向VEGF 從而抑制人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞增殖[38]，在β-谷甾醇和豆甾醇對小鼠急性結(jié)腸炎的治療作用研究中，馮思敏等發(fā)現(xiàn)豆甾醇和β-谷甾醇顯著降低結(jié)腸組織炎癥因子IL-6 和環(huán)氧合酶COX-2 的mRNA 表達，另外豆甾醇還能顯著抑制IL-1β的表達[39]。木犀草素能夠通過降低IL-6、TNF-α及p65 蛋白表達水平來降低大腸埃希菌對呼吸道上皮細胞的毒性[40]。蘆薈大黃素通過抑制Notch-1/AKT/NF-κB 信號通路從而誘導胃癌SGC-7901 細胞凋亡[41]。本文的研究結(jié)果與文獻報道結(jié)果基本一致，說明該預測的結(jié)果可信程度比較高，其預測結(jié)果可作為進一步研究的思路和方向。

對交集靶點進行GO 功能和KEGG 通路富集分析，結(jié)果顯示，尿毒靈對治療DN 的生物過程主要富集在對一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控，成纖維細胞增殖的正向調(diào)控等。作用的信號通路主要涉及HIF-1信號通路、TNF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK信號通路、VEGF 信號通路等。據(jù)文獻報道，高糖環(huán)境下HIF1α-KIM1 信號通路能夠通過調(diào)控FN、COL-Ⅰ等相關蛋白的表達影響糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生和發(fā)展[42]。黃芪甲苷聯(lián)合氯沙坦能通過調(diào)控PI3K/Akt/NF-κB 信號通路改善糖尿病大鼠的腎組織損傷狀況，延緩DN 的發(fā)生發(fā)展[43]。劉桐菊等[44]采用酶聯(lián)免疫吸附測定檢測高糖環(huán)境下腎系膜細胞上清液中VEGF 的質(zhì)量濃度，發(fā)現(xiàn)各給藥組VEGF 的質(zhì)量濃度顯著下降，推測糖腎安干預DN 的作用機制可能與降低VEGF質(zhì)量濃度有關。下一步可以從上述信號通路入手開展相應的實驗研究。

尿毒靈是臨床上治療DN 的有效方劑，但是由于化學成分復雜多樣，其作用機制尚未完全闡明。本研究借助網(wǎng)絡藥理學挖掘出尿毒靈作用于DN 可能的潛在靶點和作用機制，同時也為中藥在治療DN 方面的研究提供更多的參考方向，避免了進一步研究的盲目性。但是該方法也存在一定的局限性，如采用TCMSP數(shù)據(jù)庫收集藥物成分和對應靶點，庫中的藥物成分信息來源鏈接PubChem 數(shù)據(jù)庫，靶點信息來源鏈接DrugBank 數(shù)據(jù)庫，可能存在檢索到的化合物不全、一些數(shù)據(jù)來源信息無法匹配等問題，并且TCMSP數(shù)據(jù)庫中的中藥種類只涉及500 種植物藥，尚未擴大到動物藥和礦物藥[45]，且數(shù)據(jù)庫的信息來源于發(fā)表的文獻，因此，對疾病研究得越深入，對處方中中藥及其化合物的研究越多，所篩選得到的結(jié)果就越可靠，其準確性與復方的化學成分研究的程度、疾病發(fā)病機制、相關靶點的研究等密切相關，因此，尚需對預測靶點通路做進一步的實驗驗證。