周 赟 陳 俊 李麗華 孫一洲 陳 蕾

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院眼科，遼寧省沈陽市 110001，電子郵箱：zhyun929@163.com)

β-欖香烯是一種二類非細胞毒性的抗腫瘤藥，從中草藥香茅草中提取而得，毒副作用輕且抗腫瘤譜廣，廣泛應用于肺癌、消化道腫瘤及其他淺表性腫瘤的治療[1-2]。研究證實，β-欖香烯可以通過兩種途徑抑制腫瘤細胞增殖：一是通過上調凋亡相關蛋白的表達，誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡[3-4]，二是通過抑制腫瘤細胞內血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的生成，從而抑制腫瘤細胞生長轉移[5]。許多血管性眼科疾病的視網膜中VEGF表達顯著提高[6]，因此β-欖香烯是否可應用于眼科領域疾病的治療成為研究熱點。耿金等[7]的研究結果顯示，β-欖香烯注射乳可以抑制氧誘導的新生血管模型小鼠視網膜新生血管的發(fā)生和發(fā)展。而β-欖香烯注射乳對糖尿病視網膜病變的治療效果及其對高糖環(huán)境下人視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞的作用鮮見研究報告。本研究將不同濃度的β-欖香烯作用于高糖環(huán)境下體外培養(yǎng)的人RPE細胞，分析β-欖香烯對高糖環(huán)境下人RPE細胞活力及VEGF表達的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料及試劑 人RPE細胞株ARPE-19(ATCC公司，批號：AC337713)，β-欖香烯(大連遠大生物集團)，杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM；?？寺」?，批號：SH30022.01B)，胎牛血清(?？寺」荆枺篠V30087.02)，胰蛋白酶(海克隆公司，批號：SH30042.01B)，MTS溶液(美國Promega公司，批號：CTB169)，人VEGF酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒(達優(yōu)公司，批號：CT579-10)，細胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶(康寧公司)。

1.2 細胞培養(yǎng) 取人RPE細胞株ARPE-19、在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行貼壁培養(yǎng)，用2.5 g/L胰蛋白酶對細胞進行消化傳代，消化時間為2 min。

1.3 MTS法檢測細胞活力 取對數生長期ARPE-19細胞，采用胰蛋白酶進行消化后制成單細胞懸液，以2×104個/mL的細胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，將96孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)過夜使細胞貼壁后，將細胞分為(1)對照組：用含10%胎牛血清的低糖(葡萄糖濃度為5.5 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)ARPE-19細胞；(2)高滲組：用加入27.5 mmol/L甘露醇的低糖(葡萄糖濃度為5.5 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)ARPE-19細胞；(3)高糖組：用含10%胎牛血清的高糖(葡萄糖濃度為33 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)ARPE-19細胞；(4)高糖+不同濃度β-欖香烯組：分別向含10%胎牛血清的高糖(葡萄糖濃度為33 mmol/L) DMEM培養(yǎng)基中加入不同濃度β-欖香烯，β-欖香烯濃度分別為10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL，分別記為高糖+10 μg/mL β-欖香烯組、高糖+20 μg/mL β-欖香烯組、高糖+40 μg/mL β-欖香烯組、高糖+80 μg/mL β-欖香烯組、高糖+160 μg/mL β-欖香烯組。每組設置5個復孔，實驗孔周圍加入無菌磷酸緩沖鹽溶液以減少樣品蒸發(fā)；給予相應干預后將細胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內分別干預12 h、24 h、36 h、48 h后小心吸去上清，在電鏡下觀察細胞密度和形態(tài)，并且選取培養(yǎng)時間為24 h的ARPE-19細胞拍照留存。觀察細胞形態(tài)后每孔加入20 μL MTS溶液，繼續(xù)置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)3 h，采用酶聯免疫檢測儀(博科生物，型號：BIOBASE4001)檢測各孔490 nm波長處的吸光度值。實驗重復3次。

1.4 ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白含量 取對數生長期ARPE-19細胞，以5×105個/孔細胞密度接種于6孔培養(yǎng)板中(培養(yǎng)板每孔放入預先滅菌處理的蓋玻片)，每孔2.5 mL。將6孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)過夜使細胞貼壁后，將細胞分為(1)對照組：用含10%胎牛血清的低糖(葡萄糖濃度為5.5 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)ARPE-19細胞；(2)高糖組：用含10%胎牛血清的高糖(葡萄糖濃度為33 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)ARPE-19細胞；(3)高糖+20 μg/mL β-欖香烯組：向含10%胎牛血清的高糖(葡萄糖濃度為33 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基中加入20 μg/mL β-欖香烯；(4)高糖+40 μg/mL β-欖香烯組：向含10%胎牛血清的高糖(葡萄糖濃度為33 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基中加入40 μg/mL β-欖香烯。給予相應干預后將細胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內分別培養(yǎng)24 h和48 h，收集細胞培養(yǎng)上清液，置于-80℃冰箱內凍存?zhèn)溆?。采用ELISA法測細胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白含量，按照試劑盒說明書進行操作。于酶標儀450 nm波長處讀取吸光度值，并在標準曲線上查出樣本的VEGF水平對應值,實驗重復6次。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。滿足正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，組內比較采用配對t檢驗，方差不齊時比較采用非參數檢驗，重復測量計量資料的比較采用重復測量方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組ARPE-19細胞的鏡下形態(tài)變化 鏡下可見，對照組ARPE-19細胞以長梭形或三角形為主，胞體不透明，細胞排列緊密； 高滲組ARPE-19細胞形態(tài)和對照組類似；高糖組ARPE-19細胞排列稀疏，胞體變薄，胞內空泡變多，不規(guī)則細胞增多，形態(tài)表現多樣；高糖+10 μg/mL β-欖香烯組、高糖+20 μg/mL β-欖香烯組、高糖+40 μg/mL β-欖香烯組的ARPE-19細胞形態(tài)明顯優(yōu)于高糖組，排列較高糖組緊密，細胞形態(tài)為梭形；高糖+80 μg/mL β-欖香烯組 ARPE-19細胞形態(tài)與高糖組類似；高糖+160 μg/mL β-欖香烯組ARPE-19細胞明顯腫脹變形，空泡增多，排列稀疏。見圖1。

對照組 高滲組 高糖組 高糖+10 μg/mL β-欖香烯組

2.2 β-欖香烯對高糖環(huán)境下ARPE-19細胞活力的影響 8組ARPE細胞活力吸光度值比較，差異有統(tǒng)計學意義(F組間=15.990，P組間<0.001)，均有隨時間變化的趨勢(F時間=159.870，P時間<0.001),分組與時間存在交互效應(F交互=2.520，P交互=0.003)。其中在作用12 h、24 h、36 h、48 h時，高糖組ARPE細胞活力吸光度值較對照組下降(P<0.05)；在作用24 h、36 h、48 h時，高糖+10 μg/mLβ-欖香烯組、高糖+20 μg/mL β-欖香烯組、高糖+40 μg/mL β-欖香烯組、高糖+80 μg/mL β-欖香烯組ARPE細胞活力吸光度值較高糖組升高(P<0.05)。見表1。我們發(fā)現作用時間為24 h，β-欖香烯作用濃度為20 μg/mL時ARPE細胞的吸光度值大于其他組細胞(P<0.05)，因此后續(xù)ELISA檢測選定的β-欖香烯作用時間為24 h和48 h，作用濃度為20 μg/mL、40 μg/mL。

表1 各時間點8組ARPE細胞活力吸光度值(x±s)

2.3 β-欖香烯對高糖環(huán)境下ARPE細胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白表達的影響 在作用24 h、48 h時，4組ARPE細胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。高糖組、高糖+20 μg/mL β-欖香烯組、對照組、高糖+40 μg/mL β-欖香烯組ARPE細胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白表達水平依次降低(均P<0.05)。見表2。各組作用48 h時ARPE細胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白表達量均高于作用24 h的表達量(均P<0.05)。

表2 各組ARPE細胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白相對表達量的比較(x±s)

3 討 論

隨著人們生活方式的改變和社會經濟的高速發(fā)展，近年來糖尿病的發(fā)病率和患病率呈持續(xù)增長趨勢[8]。眾所周知，糖尿病以及隨之而來的各種并發(fā)癥嚴重危害人類健康，其中，糖尿病性視網膜病變是糖尿病最常見且最嚴重的慢性微血管并發(fā)癥之一，每年因其導致失明的患者超過10 000例[9]。糖尿病性視網膜病變的基本病理改變是血-視網膜屏障破壞、新生血管和纖維增殖膜的生成，其進一步發(fā)展可引起玻璃體積血和牽拉性視網膜脫離，嚴重影響視力，甚至導致失明，而干預視網膜新生血管的發(fā)生和發(fā)展是目前臨床面臨的難題。VEGF是目前發(fā)現的作用最強的眼部新生血管形成促進因子[10]，在糖尿病性視網膜病變的發(fā)生和發(fā)展中起著非常重要的作用。在長期的高糖刺激下，視網膜各層的細胞結構和功能產生一系列的病理生理改變，其中RPE細胞是病變的中心環(huán)節(jié)之一，與糖尿病視網膜病變的發(fā)生和發(fā)展，以及新生血管生成、纖維增殖膜的形成密切相關[11]。RPE細胞層處于富含血管的脈絡膜以及視網膜神經上皮層之間，是視網膜的外屏障，其所含有大量的葡萄糖載體可運送葡萄糖至視網膜外層，滿足視細胞高代謝活動對能量的需求，同時血糖波動對其影響較大[12]。所以，深入了解RPE細胞在病理情況下的異常生物學行為可為糖尿病視網膜病變的發(fā)病機制、預防和治療的研究奠定理論基礎[13]。

目前在臨床中，已有幾種抗VEGF藥物得到了廣泛應用，但由于費用昂貴，許多患者無法承受長期抗VEGF治療。有研究顯示，藏藥小檗皮對糖尿病大鼠視網膜具有保護作用，機制與其抑制VEGF的表達有關[14]。β-欖香烯是一種二類非細胞毒性的抗腫瘤藥，從中草藥香茅草中提取而得，價格相對低廉、毒副作用輕且抗腫瘤譜廣。研究顯示，β-欖香烯可下調人涎腺腺樣囊腺癌、肺腺癌及喉鱗癌細胞中VEGF及其受體的表達水平，故推斷β-欖香烯可能通過抑制VEGF的表達從而抑制腫瘤局部血管生成[15-16]。李悅等[17]的研究證實，β-欖香烯可以直接抑制血管內皮細胞的增殖以及阻斷細胞周期，降低細胞的生成血管能力。還有研究表明，β-欖香烯可以和放療協同抑制VEGF的表達，從而改善腫瘤的新生血管形成情況，并增強腫瘤細胞的放射敏感性[18]。 另外，顏兵等[19]通過體內、體外實驗發(fā)現，β-欖香烯可通過抑制VEGF及VEGF受體3的表達降低淋巴管密度，且具有劑量依賴性，這可能是其防止胃癌淋巴轉移的機制之一。Chen等[5]的實驗研究證實，β-欖香烯通過抑制VEGF的表達，從而發(fā)揮抑制黑色素瘤生長轉移的作用。而在眼科研究領域中，趙婉君等[20]發(fā)現β-欖香烯通過促進微小RNA-27a的表達和抑制VEGF的表達，對氧誘導視網膜新生血管模型小鼠的視網膜發(fā)揮抑制新生血管形成的作用。故筆者猜測β-欖香烯在糖尿病視網膜病變中也具有抑制新生血管形成的作用。鑒于VEGF是作用最強的眼部新生血管形成促進因子，且本課題組前期研究已證實β-欖香烯可以抑制糖尿病大鼠視網膜中VEGF蛋白和mRNA的表達[21]，因此本研究選取人RPE細胞，經高糖處理后加入β-欖香烯，檢測細胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白的表達情況。

本研究結果顯示，在作用12 h、24 h、36 h、48 h時，高糖組人RPE細胞吸光度值較對照組下降(P<0.05)，但高滲組與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在作用24 h、36 h、48 h時，高糖+10 μg/mL β-欖香烯組、高糖+20 μg/mL β-欖香烯組、高糖+40 μg/mL β-欖香烯組人RPE細胞吸光度值較高糖組升高(P<0.05)。這提示高滲對RPE細胞活力影響不大，但高糖可顯著降低細胞活力，而采用β-欖香烯進行干預可以提高細胞活力。我們發(fā)現作用時間為24 h，β-欖香烯作用濃度為20 μg/mL時人RPE細胞的活力大于其他組，因此后續(xù)ELISA檢測選定的β-欖香烯作用時間為24 h和48 h，作用濃度為20 μg/mL、40 μg/mL。ELISA檢測結果顯示，各組作用48 h時人RPE細胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白表達水平均高于作用24 h(P<0.05)；作用24 h、48 h時，高糖組、高糖+20 μg/mL β-欖香烯組、對照組、高糖+40 μg/mL β-欖香烯組人RPE細胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白表達依次降低(P<0.05)。這說明隨著作用時間的延長及作用濃度的增加，β-欖香烯對高糖環(huán)境下分泌型VEGF蛋白抑制作用逐漸增強。所以我們推測β-欖香烯在一定濃度范圍內可改善高糖環(huán)境下人RPE細胞的活力，并且降低人RPE細胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白的表達，且存在一定的時效關系及量效關系。

綜上所述，一定濃度的β-欖香烯可改善高糖環(huán)境下人RPE細胞的活力，并且降低VEGF蛋白的表達，但其中的作用機制還有待進一步研究。