閻朝龍，閆惠穎綜述，金 偉審校

0 引 言

創(chuàng)傷性腦損傷 (traumatic brain injury, TBI) 是戰(zhàn)爭時期及現(xiàn)代社會生活中一種常見的外傷類型，死亡率及致殘率居各種外傷之首，隨著城市化的進程，TBI的發(fā)生率逐年上升，在全球每年可造成約4000億美元的經(jīng)濟負擔[1]。TBI的病理過程包括原發(fā)的機械性損傷及多種因素導致的繼發(fā)性損傷兩個階段。其中原發(fā)性損傷指出血和神經(jīng)元丟失等，發(fā)生在創(chuàng)傷當時，無法進行臨床干預；繼發(fā)性損傷主要包括神經(jīng)炎癥、氧化應激、鈣超載、代謝毒物產(chǎn)生和神經(jīng)元凋亡等，在損傷發(fā)生后的病程中持續(xù)進展性發(fā)生，因此抑制或減緩TBI后繼發(fā)性損傷的持續(xù)發(fā)展對改善TBI患者的預后有著重要意義[2-3]。

神經(jīng)炎癥反應是機體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在TBI、蛛網(wǎng)膜下腔出血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程中發(fā)揮重要作用。適度炎癥反應的發(fā)生，可以促進組織損傷后細胞碎片的清除和加速損傷神經(jīng)元的修復，但是過度的炎癥反應，同樣也會加重細胞損傷和導致疾病的惡化[4]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3 (nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptor family pyrin domain containing 3, NLRP3) 炎性小體在TBI后的炎癥反應及多種繼發(fā)性損傷中發(fā)揮著重要作用[5]。本文就TBI后NLRP3炎性小體的激活以及針對NLRP3炎性小體激活的治療措施的研究進展進行綜述，為緩解TBI后繼發(fā)性損傷及改善病人預后的臨床前和臨床研究提供參考。

1 NLRP3炎性小體

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體 (nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor, NLRs) 是模式識別受體 (pattern recognition receptors, PRRs) 家族的一個亞類，在機體的先天免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。NLRP3正是NLRs家族中研究最為廣泛的一員，在神經(jīng)元細胞、小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、血管平滑肌細胞等細胞中廣泛多樣性表達，在TBI、阿爾茲海默癥、亨廷頓舞蹈病、缺血性腦卒中等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[6]。

1.1NLRP3炎性小體的分子組成NLRP3炎性小體是一種多蛋白聚合復合物，由感受器分子NLRP3、銜接蛋白ASC (apoptosis associated speckle-like protein containing CARD) 和效應蛋白前體pro-caspase-1 3個部分組成，見圖1。其中，NLRP3包含C端的亮氨酸重復序列LRR (leucine rich repeat)、中段特征性的核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域NACHT (nucleotide-binding and oligomerization domain，NOD/NACHT)和N端的效應結(jié)構(gòu)域PYD (pyrin domain) 三個部分；ASC蛋白包含一個PYD結(jié)構(gòu)域和一個CARD (caspase activation and recruitment domain) 結(jié)構(gòu)域；pro-caspase-1也包含一個CARD結(jié)構(gòu)域。炎性小體受到刺激激活時，NLRP3通過PYD結(jié)構(gòu)域與ASC相互連結(jié)，進而通過ASC的CARD結(jié)構(gòu)域招募pro-caspase-1形成NLRP3-ASC-pro-caspase-1復合物，對pro-caspase-1進行剪切產(chǎn)生有活性的caspase-1[7]。

活化的caspase-1可以將下游無活性的白細胞介素 (interleukin，IL) -1β前體和IL-18前體轉(zhuǎn)化成有活性的、分泌形式的IL-1β和IL-18，活化的炎癥因子將啟動并放大下游的炎癥信號通路，發(fā)生嚴重的炎癥反應。此外，激活的caspase-1還可以剪切細胞焦亡的效應蛋白GSDMD (Gasdermin-D)，剪切產(chǎn)生的N末端產(chǎn)物GSDMD-N能夠介導細胞膜上膜孔的形成，增加細胞內(nèi)外液體的流動，導致細胞的腫脹和破裂，在細胞焦亡中起關(guān)鍵作用[8]。

圖 1 NLRP3炎性小體的組成及激活示意圖

1.2NLRP3炎性小體的激活研究表明，NLRP3炎性小體的激活需要啟動和激活兩個信號。在靜息狀態(tài)下，細胞內(nèi)的NLRP3處于低表達水平，不會進行炎性小體的組裝和激活；但是微生物分子 (如Toll樣受體配體) 或內(nèi)源性細胞因子 (如腫瘤壞死因子α) 等對NF-κB的激活，可以在轉(zhuǎn)錄水平增加NLRP3和pro-IL-1β的表達，這是炎性小體的啟動信號。此外，最新的研究認為，啟動信號也可以在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)炎性小體的激活[9]。第二步的激活信號主要調(diào)控炎性小體的組裝過程。NLRP3炎性小體可以被一系列損傷相關(guān)分子模式 (如二氧化硅、細胞外ATP和尼日利亞菌素等)和病原相關(guān)分子模式 (如微生物造孔毒素等)觸發(fā)組裝激活，但是鑒于激活劑數(shù)量和結(jié)構(gòu)的多樣性，NLRP3不太可能與所有的激活劑直接相互作用，而是感知這些激活劑引起的細胞內(nèi)信號[9]。目前，已提出的可以解釋NLRP3炎性小體激活的細胞內(nèi)信號主要分為三類：鉀離子的外排、活性氧 (reactive oxygen species, ROS) 的產(chǎn)生和溶酶體的破裂[7]。

1.2.1鉀離子的外排細胞內(nèi)外離子的流動被認為是NLRP3炎性小體的激活因素，包括K+的外排、Cl-的流出以及鈣信號的改變等。其中，K+外排是目前公認的NLRP3炎性小體激活的上游信號事件[10]。一方面，在ATP、尼日利亞菌素、結(jié)晶和顆粒分子、雙鏈DNA等多種NLRP3激活劑對炎性小體的激活事件中觀察到了細胞內(nèi)K+濃度的降低。另一方面，多種刺激對NLRP3炎性小體的激活也可以被細胞外高濃度的鉀 (30～45mol/L) 所抑制[10]。例如：細胞外高濃度的ATP分子通過激活P2X嘌呤受體7降低細胞內(nèi)K+濃度進而激活NLRP3炎性小體[11]；尼日利亞菌素作為離子載體，誘導細胞膜兩側(cè)K+/H+的交換導致細胞內(nèi)K+外排而誘導NLRP3炎性小體的激活[12]。而且，使用鉀離子通道抑制劑格列苯脲可以有效抑制多種激活劑對炎性小體的激活，也從另一個角度闡述了K+外排在炎性小體激活中的重要作用[13]。此外，包括咪喹莫特和CL097在內(nèi)的一些小分子，可以誘導ROS的產(chǎn)生，以一種不依賴K+外排的方式，促進炎性小體的激活[14]。這些結(jié)果表明，K+外排對于NLRP3炎性小體的激活非常重要，但又不是必須的、唯一的因素。

盡管細胞內(nèi)K+的減少可以激活NLRP3炎性小體是明確的，但是K+的濃度如何調(diào)控NLRP3的激活依然未知。有兩個研究分別發(fā)現(xiàn)，K+的外排對于NLRP3炎性小體組裝的一個關(guān)鍵步驟即NIMA相關(guān)激酶7 (never in mitosis A (NIMA)-related kinase 7) 與NLRP3的結(jié)合是必要的[15-16]?？偟膩碚f，這些研究支持K+外排作為NLRP3炎性小體激活的遠端上游信號，并且可能是通過影響NLRP3-NEK7的相互作用或者促進線粒體ROS產(chǎn)生實現(xiàn)的。

1.2.2ROS的產(chǎn)生ROS的產(chǎn)生，特別是線粒體來源的ROS，是最早被認為觸發(fā)炎性小體激活的因素之一[17]。多項研究表明，NLRP3炎性小體的激活劑 (如ATP、二氧化硅、尼日利亞菌素等) 可以誘導細胞內(nèi)線粒體ROS的產(chǎn)生，并且ROS清除劑的使用會阻斷激活劑對NLRP3的激活[14]。這種ROS的產(chǎn)生通常伴隨著K+的外排，但是K+外排和ROS產(chǎn)生之間的確切機制尚不清楚。而且，ROS的產(chǎn)生如何導致NLRP3炎性小體的激活，依然沒有確切的解釋。一些研究提供了潛在的見解：NLRP3激動劑可以以ROS依賴性方式觸發(fā)NLRP3與硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein, TXNIP)的相互作用。靜息狀態(tài)下，TXNIP與硫氧還蛋白組成性結(jié)合并受其抑制；細胞ROS濃度的增加，使得該復合物解離，TXNIP與NLRP3結(jié)合，導致NLRP3炎性小體的活化。但是，在沒有TXNIP的情況下，caspase-1的活化和IL-1β的分泌并未被完全抑制，表明仍然有其他機制的存在[18]。有最新的研究表明，線粒體ROS的產(chǎn)生，導致線粒體的損傷，進而會引起線粒體DNA (mtDNA)合成、氧化的增加，氧化的mtDNA能夠與NLRP3炎性小體締合導致炎性小體的激活[19]。也有研究從感知ROS的層面解釋，是NEK7而不是NLRP3本身能夠感知ROS的產(chǎn)生，因為咪喹莫特誘導的ROS依賴性的NLRP3炎性小體的活化在NEK7缺陷的細胞中消失了[14]。因此，ROS的產(chǎn)生觸發(fā)炎性小體激活的具體機制，依然眾說紛紜，值得更加深入的研究。

此外，ROS的產(chǎn)生對NLRP3炎性小體的激活的確非常重要，但也不是絕對必要條件，線粒體ROS非依賴性炎性小體的激活也已有報道[20]。

1.2.3溶酶體的破裂二氧化硅、明礬等顆粒性活化劑清除效率的降低會導致溶酶體的破裂和溶酶體內(nèi)物質(zhì)的釋放，觸發(fā)NLRP3炎性小體的激活。有研究表明溶酶體的破裂不僅參與了炎性小體的激活步驟，而且參與了啟動步驟。在棕櫚酸鹽誘導的NLRP3炎性小體激活中，一方面溶酶體鈣信號通過穩(wěn)定IL-1β的mRNA調(diào)節(jié)IL-1β前體的生成 (啟動信號)，另一方面溶酶體破裂釋放的組織蛋白酶B促進了NLRP3炎性小體的激活(激活信號)[21]。也有一項研究進一步證實了多種組織蛋白酶可以促進NLRP3炎性小體的激活，而且使用組織蛋白酶B的抑制劑CA-074-Me可以抑制NLRP3炎性小體的活化[22]。但是，組織蛋白酶B抑制劑在發(fā)揮作用時也有可能由于脫靶效應或者靶向組織蛋白酶家族的其他成員而被干擾。顆粒物質(zhì)除了通過吞噬作用導致溶酶體的破裂，還會觸發(fā)吞噬作用依賴性的K+外排，進而激活NLRP3炎性小體[23]。然而，將顆粒物誘導的溶酶體破裂和K+外排聯(lián)系起來的機制尚待深入研究。此外，TAK1-JNK途徑 (TAK1：transforming growth factor beta-activated kinase 1，轉(zhuǎn)化生長因子活化蛋白激酶1；JNK：c-Jun N-terminal kinase，N末端激酶) 最近也被報道在溶酶體破壞后激活，并在NLRP3炎性小體活化中發(fā)揮作用[24]。因此，溶酶體破裂在NLRP3炎性小體活化中發(fā)揮著重要作用，觸發(fā)活化的詳細機制仍需要進一步研究。

總而言之，NLRP3的激活劑通過觸發(fā)包括鉀離子外排，線粒體功能障礙和溶酶體破裂在內(nèi)的多種細胞和分子事件，在炎性小體的激活中發(fā)揮了重要作用，特別是細胞內(nèi)離子水平的改變，把不同的信號轉(zhuǎn)導聯(lián)系起來；但是各激活信號激活炎性小體的詳細機制依然值得更深入的研究。

2 創(chuàng)傷性腦損傷中NLRP3炎性小體的激活

Liu等[25]進行了第一個TBI中NLRP3炎性小體表達的研究，作者發(fā)現(xiàn)在中度TBI (改良的自由落體打擊模型)后的第一周內(nèi)，大鼠皮層腦組織中NLRP3相關(guān)基因和蛋白表達顯著上升。 具體來說，炎性小體的引發(fā)信號 (即NLRP3、ASC和pro-caspase-1的mRNA和蛋白)和激活信號 (caspase-1 p10、IL-1β和IL-18的蛋白) 在腦損傷后6h被上調(diào)，并一直到損傷后7d的實驗終點時都處于上調(diào)水平[25]。自首次發(fā)表以來，已有大量研究支持NLRP3炎性小體的基因和蛋白表達在TBI動物模型中上調(diào)[26-27]。而且，Irrera等[28]通過使用NLRP3-/-基因型小鼠和NLRP3抑制劑BAY 11-7082藥物處理兩種方式與野生型小鼠形成對比，在TBI后第7天觀察到小鼠在行為學和組織學損傷上明顯減弱。在TBI后NLRP3炎性小體激活的機制研究上，Chen等[29]通過使用NEK7-shRNA病毒，發(fā)現(xiàn)敲低NEK7可以改善TBI小鼠 (控制皮層損傷模型) 的神經(jīng)功能損傷和減弱NLRP3炎性小體的激活，表明NEK7可能是調(diào)節(jié)TBI后NLRP3激活的潛在靶點。而Ma等[30]則是從ROS的角度發(fā)現(xiàn)，通過基因敲除NOX2，可以降低TBI后的ROS水平，進而影響TXNIP與NLRP3的相互作用，調(diào)節(jié)NLRP3的激活，減少TBI后腦組織的炎性損傷。這些結(jié)果的發(fā)現(xiàn)，為TBI后NLRP3炎性小體的激活提供了重要證據(jù)；但是TBI誘導的NLRP3炎性小體激活的具體機制依然值得深入研究，特別是溶酶體破裂是否在TBI后NLRP3炎性小體的激活中發(fā)揮作用還是一片空白。

然而，關(guān)于TBI后NLRP3炎性小體激活的臨床研究依然較少。在Lin等[31]的研究中，與癲癇患者相比，在重度TBI患者切除的皮層組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表達顯著上調(diào)。另一項臨床研究分析了重度顱腦損傷的嬰兒和兒童患者 (0～24歲) 的腦脊液中NLRP3的蛋白含量，發(fā)現(xiàn)TBI患者腦脊液中NLRP3的含量顯著高于同年齡的對照組；而且根據(jù)患者TBI后6個月的格拉斯哥評分判斷，腦脊液中NLRP3濃度>6.63 mg/mL與神經(jīng)系統(tǒng)不良預后獨立相關(guān)[32]。這項研究首次證明了NLRP3作為基于體液的腦外傷預后生物標志物的潛在效用，但是NLRP3在更大范圍的年齡人群以及人體的外周循環(huán)血液中是否具有可能的生物學標志物依然值得研究。

3 NLRP3炎性小體作為TBI治療的靶點

隨著對NLRP3炎性小體在創(chuàng)傷性腦損傷中激活機制的研究，以NLRP3炎性小體為靶點來改善TBI預后的研究也逐漸增多。特別是NLRP3-/-的基因小鼠已經(jīng)顯示出減少TBI后組織學損傷和改善神經(jīng)功能的結(jié)果[28]，更是推動了靶向NLRP3炎性小體來減弱TBI后繼發(fā)性腦損傷和改善TBI遠期預后的研究。目前，已有多種藥物或治療措施通過直接或間接抑制TBI后NLRP3炎性小體的活性在臨床前研究中顯示出了治療潛力，這些治療方法主要分為以下五類：①靶向NLRP3分子的抑制劑 (例如MCC950、JC-124等[26-27, 33-34])；②靶向NLRP3炎性小體組成分子的抑制劑 (例如抗ASC抗體、caspase-1選擇性抑制劑VX765等[35-36])；③NLRP3炎性小體激活的上游信號分子的抑制劑 (例如右美托嘧啶、NF-κB抑制劑等[37-38])；④其他機制未明的非特異性抑制劑：包括部分經(jīng)典藥物的新用法 (例如異丙酚、替米沙坦等) 和一些天然化合物 (例如ω-3脂肪酸、芒果苷等)[39-42]； ⑤物理治療 (例如高壓氧治療) 等其他方法[43]。下表匯總了目前能夠抑制TBI后NLRP3炎性小體激活的治療措施。

MCC950是一種有效的、高度選擇性的NLRP3抑制劑，可以與NLRP3的NACHT域直接相互作用，從而阻止ATP水解并抑制NLRP3的活化和炎性體的形成[48]。大量的臨床前研究證實，MCC950具有良好的中樞神經(jīng)系統(tǒng)滲透性，而且對NLRP3的高選擇性使其不會脫靶與NLRP1或NLRC4炎性小體結(jié)合，具有良好的應用前景[48-49]。系統(tǒng)性注射MCC950也在腦出血和阿爾茲海默癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床前研究中顯示了良好的結(jié)果[50-51]，最近的兩項研究也展示了MCC950在TBI中的應用前景[26, 34]。Ismael等[34]通過給TBI小鼠腹腔注射MCC950，發(fā)現(xiàn)小鼠皮層組織中NLRP3炎性小體組分 (NLRP3, caspase-1, ASC, and IL-1β) 在TBI的急性期 (24 h) 的表達顯著降低，并且caspase-1和IL-1β的減少持續(xù)到亞急性期 (72 h)；而且，伴隨NLRP3炎性小體激活的抑制，小鼠的神經(jīng)功能評價 (mNSS評分)在觀察期72 h內(nèi)也得到顯著改善。而Xu等[26]在觀察到NLRP3炎性小體表達降低的同時，發(fā)現(xiàn)腹腔注射MCC950對TBI小鼠神經(jīng)功能的改善可以延長到14 d，這為MCC950在腦損傷中應用的安全性、有效性提供了更長的觀察期限。此外，Xu等[26]的研究還發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞是TBI后NLRP3表達增加的主要來源，MCC950可以同時抑制小膠質(zhì)細胞的激活和NLRP3的表達；而且發(fā)現(xiàn)通過藥物清除TBI后的小膠質(zhì)細胞使得MCC950神經(jīng)保護及減輕水腫的作用被消除，證明小膠質(zhì)細胞的存在對MCC950發(fā)揮保護作用有重要價值[26]。綜上所述，MCC950在小鼠TBI的急性期和亞急性期顯示出了一定的神經(jīng)保護效果，但是針對于MCC950在TBI后的治療窗和該化合物在其他種屬的TBI中是否具有療效還需更多的研究。

JC-124是通過對格列苯脲的結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化設計后得到的NLRP3特異性抑制劑，它可以有效抑制由ATP誘導的NLRP3炎性小體的激活。JC-124可以特異性抑制NLRP3炎性小體的激活信號而不影響NF-κB信號相關(guān)的啟動信號或者其他炎性小體的激活信號，因此具有NLRP3選擇性[27]。與格列苯脲相比，JC-124消除了格列苯脲產(chǎn)生低血糖癥的風險，具有更高的安全性；與MCC950相比，JC-124可能在K+外排的下游或者通過抑制ATP酶的活性發(fā)揮抑制作用而MCC950不影響ATP誘導的Ca2+通量，因此他們發(fā)揮作用的機制不同[13, 49]。在Kuwar等[27]的研究中，與對照組相比，JC-124處理顯著降低了NLRP3炎性小體在TBI后48h大鼠腦組織中的表達；但是該團隊并未進行神經(jīng)功能相關(guān)的行為學方面的檢測。有趣的是，在Kuwar的研究中，無論是TBI損傷還是JC-124處理，都沒有對IL-18的表達水平產(chǎn)生顯著的差異性影響，這可能與其他課題組觀察到的IL-1β和IL-18的差異性表達模式相關(guān)[25, 27]。因此，作為NLRP3的特異性抑制劑，JC-124還需要更多的研究來探明其在抑制NLRP3時的詳細機制以及其在TBI后神經(jīng)功能方面是否具有同樣的保護作用。

與MCC950和JC-124相比，其他治療措施雖然也被證明通過抑制NLRP3炎性小體的活性改善了實驗性腦損傷的預后，但是尚未有證據(jù)顯示這種改善作用呈NLRP3依賴性，因此很難判斷預后的改善是否靶向NLRP3炎性小體或者是否還有NLRP3炎性小體以外的機制也影響了預后的變化。所以，綜合以上治療措施的研究，MCC950和JC-124作為NLRP3的特異性抑制劑，最有可能揭示NLRP3炎性小體在TBI中的確切機制并有希望成為改善TBI預后的治療選擇。

4 總結(jié)與展望

創(chuàng)傷性腦損傷是全球范圍面臨的，具有極高致死率和致殘率的健康衛(wèi)生問題。目前已有一些臨床前研究和臨床研究顯示NLRP3炎性小體在TBI后被上調(diào)，并在TBI后的繼發(fā)性損傷中發(fā)揮重要作用。此外，也有一些NLRP3炎性小體相關(guān)的抑制劑在臨床前研究中顯示出抗炎作用并改善TBI的神經(jīng)功能預后。更重要的是，在最新的臨床研究中，體液中的NLRP3及相關(guān)分子顯示出了作為神經(jīng)炎癥的生物標記物的潛力。但是，有關(guān)NLRP3及相關(guān)分子在TBI病人體內(nèi)具有怎樣的變化規(guī)律，以及臨床前研究中的陽性治療措施是否能夠?qū)崿F(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化，依然需要更多的研究。