劉珊 方姝煜 綜述 安云飛 審校

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院風(fēng)濕免疫科/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/兒童感染免疫重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014）

［中國當(dāng)代兒科雜志，2021，23（7）：743-748］

一直以來，精準(zhǔn)有效地編輯活細(xì)胞基因組DNA是生命科學(xué)和醫(yī)藥領(lǐng)域的主要目標(biāo)。基因編輯技術(shù)提供了一種相對(duì)快速且簡單的方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)基因的刪除、替換和修改。隨著鋅指核酸酶（zinc-finger nuclease，ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）、規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列及其相關(guān)核酸酶9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9，CRISPR/Cas9）等特異性人工核酸酶的出現(xiàn)，該技術(shù)逐漸發(fā)展為一套較成熟的體系，使得基因相關(guān)疾病得以更有效地治療和預(yù)防。原發(fā)性免疫缺 陷?。╬rimary immunodeficiency disease，PID）是一類主要由單基因突變導(dǎo)致的免疫細(xì)胞發(fā)育或功能異常性疾病，免疫重建是根治的關(guān)鍵。基因編輯的出現(xiàn)為PID的治療提供了新選擇。本文將從基因編輯發(fā)展沿革入手，概述ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9、堿基編輯和先導(dǎo)編輯，并簡述基因編輯在PID中的應(yīng)用。

1 基因編輯

基因編輯，一種通過刪除、插入或替換基因組的某個(gè)片段或特定堿基使基因組發(fā)生特定變化的分子技術(shù)，目前廣泛用于生物學(xué)研究中［1］。起初該技術(shù)通過產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（DNA doublestrand breaks，DSB）激活非同源末端連接及同源定向修復(fù)等細(xì)胞內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制發(fā)揮作用。前者在斷裂位點(diǎn)隨機(jī)引入插入缺失，后者則以供體DNA為模板誘導(dǎo)可預(yù)測的基因表達(dá)［2-3］。在修復(fù)過程中，兩種途徑同時(shí)發(fā)生并且相互競爭，但多數(shù)情況下以非同源末端連接為主，因此編輯過程中不可避免出現(xiàn)副產(chǎn)物。對(duì)于已知的致病性突變而言，糾正目標(biāo)位點(diǎn)的突變才是治療的最終目的。因此研究者后續(xù)開發(fā)出無需產(chǎn)生DSB的堿基編輯和先導(dǎo)編輯，掀起了基因編輯技術(shù)應(yīng)用的新篇章。

1.1 ZFN

ZFN由鋅指蛋白介導(dǎo)的DNA識(shí)別域和源自海床黃桿菌的核酸內(nèi)切酶FokⅠ介導(dǎo)的DNA切割域組成。通常，鋅指蛋白由ββα結(jié)構(gòu)的鋅指串聯(lián)組成。其中，α螺旋能插入DNA雙螺旋的大溝，特異性識(shí)別靶鏈的3個(gè)連續(xù)核苷酸。FokⅠ可非特異性切割DNA，但需二聚體的形成。當(dāng)ZFN二聚體反向識(shí)別位點(diǎn)相距6～8 bp時(shí)，F(xiàn)okⅠ切割靶位點(diǎn)產(chǎn)生DSB，激活內(nèi)源性修復(fù)［4］。鋅指結(jié)合特性和效率受內(nèi)部氨基酸和臨近鋅指結(jié)構(gòu)的影響，這使ZFN的直接構(gòu)建或篩選耗時(shí)耗力。此外，三聯(lián)體識(shí)別模式限制了可靶向范圍。并且基因組中存在多個(gè)與目標(biāo)位點(diǎn)相似的序列，可成為額外的靶點(diǎn)導(dǎo)致脫靶編輯。但不可否認(rèn)，ZFN作為開創(chuàng)性技術(shù)，為基因編輯在各領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了夯實(shí)的基礎(chǔ)。

1.2 TALEN

TALEN由轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物（transcription activator-like effector，TALE）介導(dǎo)的DNA結(jié)合域和FokⅠ介導(dǎo)的DNA切割域組成。TALE由重復(fù)單元串聯(lián)構(gòu)成。重復(fù)單元除重復(fù)可變雙殘基（第12、13位氨基酸）不同以外，其余高度相似。1個(gè)重復(fù)可變雙殘基能特異性識(shí)別1個(gè)堿基。與ZFN相似，TALEN也有組件FokⅠ，但需要10～30 bp的間隔才能實(shí)現(xiàn)切割［5］。與ZFN相比，TALEN技術(shù)的DNA識(shí)別域長、識(shí)別單元不受臨近單元的影響、識(shí)別密碼簡單對(duì)應(yīng)等特性，使得其識(shí)別序列更廣、設(shè)計(jì)更靈活。但是由于廣泛相同的重復(fù)序列導(dǎo)致TALE克隆困難，并且結(jié)合位點(diǎn)需以堿基T開始，這使得TALEN技術(shù)的應(yīng)用受到限制。隨著“Golden Gate”分子克隆、高通量固相組裝和獨(dú)立連接克隆技術(shù)的出現(xiàn)，可快速設(shè)計(jì)裝配自定義TALE陣列，而無堿基識(shí)別限制的突變體克服了5'-T這一難題［6］。這使得TALEN技術(shù)成為基因編輯的有力工具。

1.3 CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌、古菌的適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，通過RNA引導(dǎo)核酸切割來抵抗外來遺傳物質(zhì)對(duì)自身的影響。該系統(tǒng)由單鏈向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA）和Cas9核酸內(nèi)切酶組成。其中，sgRNA與靶序列互補(bǔ)配對(duì)，而Cas9識(shí)別緊鄰靶點(diǎn)的前間隔序列臨近基序（protospacer adjacent motif，PAM），并執(zhí)行剪切功能［7］。其作用過程為：Cas9識(shí)別合適的PAM后DNA雙螺旋解開，sgRNA識(shí)別目標(biāo)序列形成RNA-DNA異源雙鏈。此時(shí)R環(huán)形成，導(dǎo)致Cas9發(fā)生構(gòu)象改變而激活剪切活性，對(duì)DNA進(jìn)行切割產(chǎn)生DSB［8-9］。與前兩種編輯方法相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)使用更精準(zhǔn)的堿基互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別方式，組件sgRNA的構(gòu)建也更簡單及節(jié)約成本。但CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在PAM限制、脫靶切割及系統(tǒng)遞送障礙等限制。通過改變Cas9同源序列對(duì)比、蛋白結(jié)構(gòu)和蛋白定向進(jìn)化等方法突破PAM限制，擴(kuò)大了可靶向基因范圍。同時(shí)突變體Cas9單切口酶（Cas9 nickase，nCas9）、雙sgRNA組合及截短的sgRNA則降低了脫靶率［10-11］。而通過尋找到更小的Cas9蛋白［12］或者將Cas9分裝為兩個(gè)載體［13］等方法增加了遞送可行性。這一系列策略大幅度提高了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用價(jià)值。

1.4 堿基編輯

在人類已知的致病性突變中，單堿基突變高達(dá)58%，因此開發(fā)一種精準(zhǔn)且高效糾正點(diǎn)突變的技術(shù)尤為重要［14］。堿基編輯由sgRNA、修飾的Cas9蛋白和脫氨酶組成，無需DSB、供體模板及同源定向修復(fù)，便能對(duì)點(diǎn)突變進(jìn)行精準(zhǔn)修復(fù)［15］。目前，堿基編輯可分為胞嘧啶堿基編輯系統(tǒng)（cytosine base editor，CBE）和腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)（adenine base editor，ABE），前者將靶點(diǎn)胞嘧啶（cytosine，C）替換為胸腺嘧啶（thymine，T），后者則將靶點(diǎn)腺嘌呤（adenine，A）替換為鳥嘌呤（guanine，G）［16］。其作用過程為：在sgRNA和修飾的Cas9蛋白作用下形成R環(huán)后，脫氨酶直接作用于R環(huán)中未與sgRNA互補(bǔ)的無序單鏈，將其編輯窗中目標(biāo)堿基（C/A）脫氨為中間產(chǎn)物（C→U、A→I），進(jìn)而通過DNA復(fù)制或修復(fù)轉(zhuǎn)變?yōu)槟繕?biāo)產(chǎn)物（U→T、I→G）。

CBE最初僅由sgRNA、催化失活的Cas9（dead Cas9，dCas9）和大鼠胞嘧啶脫氨酶組成。為了提高編輯效率和降低副產(chǎn)物的生成，研究者加入破壞尿嘧啶堿基切除修復(fù)的尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑及使用觸發(fā)胞內(nèi)堿基錯(cuò)配修復(fù)的nCas9［15］。此外，化膿性鏈球菌Cas9（Streptococcus pyogenesCas9，spCas9）同源物和突變體、自然及突變進(jìn)化的胞嘧啶脫氨酶的使用也可擴(kuò)大CBE編輯范圍，同時(shí)增加精準(zhǔn)度和效率。由于已知的腺嘌呤脫氨酶不能以DNA為底物對(duì)A進(jìn)行脫氨，Gaudelli等［16］構(gòu)建人工定向進(jìn)化的腺嘌呤脫氨酶，與野生型腺嘌呤脫氨酶形成異二聚體，再與nCas9融合，這才開發(fā)出了ABE系統(tǒng)。ABE系統(tǒng)的改進(jìn)也可以借鑒CBE系統(tǒng)優(yōu)化策略，但ABE對(duì)除野生型spCas9外的Cas結(jié)構(gòu)域兼容性比CBE低。在最近的研究中，Richter等［17］對(duì)腺嘌呤脫氨酶進(jìn)行噬菌體輔助的非連續(xù)和連續(xù)進(jìn)化解決了當(dāng)前ABE對(duì)部分Cas蛋白的不兼容。在實(shí)際應(yīng)用中，ABE系統(tǒng)編輯的副產(chǎn)物更少，其可能原因?yàn)榘麅?nèi)肌苷的切除比尿嘧啶的切除要慢很多。并且雙細(xì)胞胚胎注射進(jìn)行全基因組脫靶分析可對(duì)脫靶編輯進(jìn)行評(píng)估后顯示ABE脫靶率遠(yuǎn)低于CBE［18］。這一系列優(yōu)勢說明ABE系統(tǒng)更具臨床應(yīng)用價(jià)值。堿基編輯開創(chuàng)了堿基轉(zhuǎn)換的先河，但不能實(shí)現(xiàn)堿基之間的顛換。而C→A/G的糖基化酶堿基編輯器［19］和靶序列雙堿基編輯器［20］，讓堿基編輯使用更寬廣。

1.5 先導(dǎo)編輯

先導(dǎo)編輯是一種“搜索并替換”的多用途且精確的基因編輯技術(shù)，無需DSB或DNA模板便能介導(dǎo)靶向刪除、插入和堿基間的替換［21］。先導(dǎo)編輯由向?qū)NA（prime editing extended guide RNA，pegRNA）及Cas9-逆轉(zhuǎn)錄融合蛋白復(fù)合體組成。與原始sgRNA不同，pegRNA的3'端有兩個(gè)功能區(qū)，一個(gè)為引物結(jié)合位點(diǎn)可起始逆轉(zhuǎn)錄；另一個(gè)是逆轉(zhuǎn)錄模板可實(shí)現(xiàn)基因修飾［22］。Cas9蛋白為切割含PAM的DNA鏈的nCas9，其作用機(jī)制為：目標(biāo)序列連接后，nCas9切割含PAM的DNA鏈，其靶鏈3'斷裂端與pegRNA互補(bǔ)后，啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄；隨后未被修飾的5'斷裂端被切除，經(jīng)DNA連接酶連接斷端便實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)編輯。Anzalone等［21］通過使用逆轉(zhuǎn)錄酶突變體及增加sgRNA剪切非編輯鏈觸發(fā)細(xì)胞錯(cuò)配修復(fù)途徑等方法將先導(dǎo)編輯系統(tǒng)進(jìn)化至第3代。為了最佳編輯效率，關(guān)鍵組件pegRNA的組裝除根據(jù)既往經(jīng)驗(yàn)選擇合適長度的引物結(jié)合位點(diǎn)和逆轉(zhuǎn)錄模板外，還需考慮其他因素［23］。

先導(dǎo)編輯原則上可糾正89%人類疾病相關(guān)的已知遺傳變異，并且與CRISPR/Cas9系統(tǒng)相比，在同樣的編輯位點(diǎn)先導(dǎo)編輯展現(xiàn)出更低的脫靶率。同時(shí)，先導(dǎo)編輯介導(dǎo)所有堿基間的替換，補(bǔ)充了堿基編輯的不足。但仍需要解決一些問題，比如：細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞類型對(duì)該系統(tǒng)編輯效率的影響，目標(biāo)產(chǎn)物和副產(chǎn)物編輯的DNA修復(fù)機(jī)制需深入了解，并且體內(nèi)應(yīng)用先導(dǎo)編輯工具的遞送策略需進(jìn)一步開發(fā)［23］。

2 基因編輯在PID中的應(yīng)用

PID是一類影響免疫系統(tǒng)發(fā)育和/或功能的異質(zhì)性單基因遺傳病，目前分為10類共430種［24］。PID可導(dǎo)致宿主免疫功能嚴(yán)重受損，增加了對(duì)危及生命的感染、自身免疫和惡性腫瘤的易感性，具有極高的病死率［25］。盡管同種異體造血干細(xì)胞移植可治愈PID，但受供體來源、患兒健康狀態(tài)和致病基因種類等因素的影響，大多數(shù)患者無法接受該治療。并且移植后患者也會(huì)面臨患移植物抗宿主病及移植物排斥的風(fēng)險(xiǎn)?；蛑委煂⒄；?qū)胱泽w造血干細(xì)胞后再進(jìn)行移植，一定程度上解決了傳統(tǒng)造血干細(xì)胞移植面臨的問題。但是半隨機(jī)整合載體都存在插入性致癌風(fēng)險(xiǎn)。盡管改進(jìn)病毒載體能降低該風(fēng)險(xiǎn)，但仍不能實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的生理性調(diào)控。而基因編輯原位糾正基因，使基因表達(dá)受內(nèi)源性調(diào)控。目前，基因編輯技術(shù)在PID的治療應(yīng)用中常與自體造血干細(xì)胞移植相結(jié)合，提供了一種治愈可能的理想方案。

2.1 X-連鎖重癥聯(lián)合免疫缺陷病

X-連鎖重癥聯(lián)合免疫缺陷?。╔-linked severe combined immunodeficiency disease，X-SCID）是SCID最常見的類型，由IL-2受體共同γ鏈（IL-2 receptor common gamma chain，IL2RG）缺陷導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙，造成T、B、NK細(xì)胞數(shù)量及功能缺陷。既往研究表明，IL2RG表達(dá)正常的淋巴祖細(xì)胞比缺陷祖細(xì)胞更具選擇性生長優(yōu)勢，因此只需少量校正的造血干祖細(xì)胞（hematopoietic stem and progenitor cell，HSPC）即可重建T細(xì)胞免疫［26］。2014年，Genovese等［27］首次運(yùn)用ZFN將包含IL2RG基因外顯子5～8互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）導(dǎo)入X-SCID患者HSPC的致病基因中，后代細(xì)胞顯示出正常的IL2RG表達(dá)。為突破HSPC的培養(yǎng)及擴(kuò)展限制，2015年研究者使用XSCID患者來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并利用設(shè)計(jì)更靈活的TALEN對(duì)目標(biāo)基因座定點(diǎn)修飾，觀察到前體T細(xì)胞及成熟NK細(xì)胞的產(chǎn)生［28］。為評(píng)估校正后的HSPC免疫重建的有效性和安全性，研究者使用ZFN將完整IL2RG的cDNA整合到原基因座的內(nèi)含子1處，并將所編輯的HSPC移植入實(shí)驗(yàn)小鼠中，在第16周顯示出同源定向修復(fù)校正的細(xì)胞平均為12%，超過免疫重建所需功能性HSPC的閾值［29］。而最近的一項(xiàng)研究中改用特異性更高的CRISPR-Cas9實(shí)現(xiàn)了高效整合，并無異常造血和脫靶突變的跡象，這為97%以上的X-SCID患者建立有長期治療及潛在治愈策略的臨床開發(fā)提供強(qiáng)有力的支持［30］。

2.2 慢性肉芽腫性疾病

慢性肉芽腫性疾病（chronic granulomatous disease，CGD）由負(fù)責(zé)中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶復(fù)合物亞基編碼基因缺陷導(dǎo)致，臨床上以反復(fù)嚴(yán)重感染、炎癥性疾病及肉芽腫形成為特征。研究表明，XCGD患兒臨床獲益所需功能正常的中性粒細(xì)胞約為10%～15%，因此基因編輯的治療作用易在CGD中體現(xiàn)［31］。在CGD致病基因中，CYBB基因占比65%，而NCF1基因占比25%，因此該病的治療主要集中于這兩類型［32］。2011年，Zou等［33］的研究中首次使用ZFN介導(dǎo)密碼子優(yōu)化的CYBB基因靶向插入X-CGD患者誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的安全港基因座中，觀察到CGD表型的完全功能校正。然而，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞只能產(chǎn)生少量的造血干細(xì)胞，因此2017年研究者采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)X-CGD患者的CD34+HSPC進(jìn)行校正，測序確認(rèn)超過20%HSPC的基因修復(fù)，植入小鼠體內(nèi)可產(chǎn)生功能正常的人骨髓/淋巴樣細(xì)胞，并無插入缺失突變產(chǎn)生［31］。NCF1基因最常見的突變是外顯子2核苷酸GT缺失（ΔGT），而該基因附近高度保守的假基因NCF1和NCF2也有該突變。2017年，有研究使用ZFN對(duì)CGD患者的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中NCF1基因外顯子2ΔGT進(jìn)行校正，顯示在NCF1基因座或其假基因上的基因校正，引起與氧化酶活性恢復(fù)相關(guān)的p47蛋白的表達(dá)［34］。這是由基因編輯介導(dǎo)假基因修復(fù)的單基因疾病功能校正的首次報(bào)道。但由于3個(gè)編輯位點(diǎn)存在可導(dǎo)致更大的缺失、倒位和易位，從而潛在地導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定［35］。因此在隨后Khan等［36］的研究中，選用與假基因有3個(gè)額外堿基對(duì)差別的NCF1內(nèi)含子1作為靶點(diǎn)通過CRIS‐PR/Cas9介導(dǎo)小基因插入，觀察到p47phox的表達(dá)幾乎恢復(fù)到野生型水平。

2.3 其他原發(fā)性免疫缺陷病

X連鎖高IgM綜合征指活化T細(xì)胞表面CD40配體基因突變引起免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換重組障礙的單基因疾病。2016年，Hubbard等［37］首次使用TALEN介導(dǎo)致病基因修復(fù)，實(shí)現(xiàn)了患者T細(xì)胞CD40配體的正常表達(dá)和IgG類別轉(zhuǎn)換的修復(fù)。而Kuo等［38］的研究更注重于HSPC的基因編輯，將使用TALEN或CRISPR-Cas9校正的HSPC移植入免疫缺陷小鼠中能達(dá)到臨床相關(guān)水平的編輯率，這為永久性治療該疾病提供了基礎(chǔ)。Wiskott-Aldrich綜合征（Wiskott-Aldrich syndrome，WAS）由WAS基因突變使WAS蛋白缺乏導(dǎo)致，臨床以血小板減少伴血小板體積減小、濕疹、免疫缺陷、易患自身免疫性疾病和惡性腫瘤為特征。在Laskowski等［39］的研究中，首次利用ZFN將功能性基因?qū)胝T導(dǎo)多功能干細(xì)胞的相應(yīng)基因座中，觀察到正常WAS蛋白的表達(dá)。而最新的研究則利用CRISPR-Cas9技術(shù)向WAS病人HSPC中遞送編輯試劑，校正細(xì)胞多達(dá)60%，并且無細(xì)胞活力和分化潛能損害［40］。

3 挑戰(zhàn)與展望

目前CRISPR/Cas系統(tǒng)及其衍生系統(tǒng)堿基編輯和先導(dǎo)編輯為各領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。然而，在最近發(fā)現(xiàn)，人類血液中存在針對(duì)Cas9蛋白的抗體和T細(xì)胞［41］。雖然目前對(duì)已存在T細(xì)胞的殺傷能力尚不清楚，但使用具有Cas9蛋白組件的基因編輯工具治療人類疾病時(shí)，其安全性需要著重考慮。針對(duì)這一問題，研究者們提出一些思路來解決，比如：使機(jī)體免疫抑制或缺失來防止細(xì)胞對(duì)Cas9的嚴(yán)重反應(yīng)，或者使用不感染人體或正常寄生菌的Cas9蛋白，又或者在人類對(duì)Cas9產(chǎn)生適應(yīng)性免疫反應(yīng)之前使用基于Cas9的療法，但這些方法的有效性有待驗(yàn)證。

對(duì)于PID的基因編輯，大多數(shù)研究仍處于臨床前研究階段，臨床應(yīng)用面臨的最大挑戰(zhàn)是從體外到體內(nèi)同源定向修復(fù)率的不斷變低。這可能是由于同源定向修復(fù)更易發(fā)生在S/G2期，因此分化程度越高的短期干細(xì)胞越易發(fā)生定向編輯，而更原始的長期干細(xì)胞則進(jìn)行非同源末端連接。并且原始造血干細(xì)胞可能對(duì)雙鏈斷裂更敏感，在編輯過程中易于受損。這導(dǎo)致有長期再生能力的干細(xì)胞未進(jìn)行真正的基因校正，或是校正后由于受損失去了移植和自我更新的能力。雖然有一些研究表明，使用一些小分子暫時(shí)控制DNA修復(fù)［42］和操縱DNA修復(fù)蛋白［43］，能維持和擴(kuò)增真正的造血干細(xì)胞數(shù)量，但也只是增加了基因校正造血干細(xì)胞的數(shù)量。迄今為止，如何編輯真正長期移植、具有自我更新能力的干細(xì)胞仍是一大問題。

目前，DNA修復(fù)機(jī)制、干細(xì)胞生物學(xué)和基因組編輯技術(shù)方面的研究快速進(jìn)展，基因編輯PID應(yīng)用有極大希望發(fā)展到臨床階段。此外，它有望治愈無法通過增加基因拷貝策略治療的疾病，也可以治愈因同種異體骨髓移植而病重的患者。盡管該領(lǐng)域仍然存在未解決的問題和許多挑戰(zhàn)，但是基因編輯在PID根治中具有巨大的潛力毋庸置疑。