付銘，白巖森，郭歡

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，湖北 武漢 430030

環(huán)境污染對(duì)人類健康產(chǎn)生了極為深刻的影響，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，僅2012年全球約有1 260 萬(wàn)人的死亡歸因于空氣、水和土壤污染以及氣候異常變化等環(huán)境因素，占全球死亡總數(shù)的23%［1］。研究表明，環(huán)境暴露可通過(guò)表觀遺傳機(jī)制影響人體健康［2］，其中DNA 甲基化的主要形式5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）作為表觀遺傳修飾的重要指標(biāo)，能夠響應(yīng)多種環(huán)境因素的改變，在預(yù)測(cè)環(huán)境污染所致的疾病進(jìn)程中具有現(xiàn)實(shí)意義［3］。5mC 的氧化產(chǎn)物5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）不僅是DNA 主動(dòng)去甲基化的中間產(chǎn)物，也是一種穩(wěn)定的表觀遺傳標(biāo)記［4］。正常的5hmC 水平對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育十分關(guān)鍵，現(xiàn)已在惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病等多種重大慢性疾病中發(fā)現(xiàn)了基因組5hmC 水平的異常變化。研究提示環(huán)境因素可能通過(guò)影響基因組5hmC 的模式參與調(diào)控疾病的發(fā)生發(fā)展，并且5hmC 在指示某些外界環(huán)境因素暴露導(dǎo)致的健康效應(yīng)變化方面可能比5mC 更加敏感［5］。因此，本文以5hmC 為中心，整合目前環(huán)境因素引起5hmC 改變的證據(jù)，總結(jié)5hmC 與部分重大慢性病關(guān)聯(lián)的研究現(xiàn)狀，提出尚存在的科學(xué)問(wèn)題，展望研究方向，以期為環(huán)境分子流行病學(xué)研究提供新思路。

1 5hmC背景簡(jiǎn)述

1.1 5hmC的生成與DNA主動(dòng)去甲基化

5hmC 是5mC 在TET（ten-eleven translocation）蛋白的氧化作用下生成的［6］。TET 蛋白是一類α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）和Fe2+依賴的雙加氧酶，有TET1、TET2 和TET3 三個(gè)成員［7］。TET 將5mC 氧化為5hmC 后，還可進(jìn)一步作用于5hmC 將其連續(xù)氧化成5-醛基胞嘧啶（5-formylcytosine，5fC）和5-羧基胞嘧啶（5-carboxylcytosine，5caC）［8］。后二者可被胸腺嘧啶DNA 糖苷酶識(shí)別并切除，形成無(wú)堿基位點(diǎn)，然后啟動(dòng)堿基切除修復(fù)將該位點(diǎn)修復(fù)成未修飾的胞嘧啶［9］，從而實(shí)現(xiàn)DNA主動(dòng)去甲基化過(guò)程。

由于TET 蛋白存在底物偏好性［10］，5hmC 不易被進(jìn)一步氧化，因此相比5fC 和5caC，5hmC 是最豐富、最穩(wěn)定的氧化產(chǎn)物，具有重大的研究意義。近年來(lái)的研究認(rèn)為，5hmC 除了作為DNA 主動(dòng)去甲基化的中間產(chǎn)物，通過(guò)介導(dǎo)DNA 去甲基化減輕5mC 的沉默效應(yīng)，還可以調(diào)控基因的表達(dá)［11］。已有研究報(bào)道了一些能夠識(shí)別并結(jié)合5hmC 的蛋白，如MeCP2、RPL26、MHS6、UHRF、Wdr76、Thy28、Neil1 等［12-14］，但具體的生物學(xué)作用過(guò)程尚不清晰，仍然需要更多深入的功能性研究。

1.2 5hmC在組織和基因組中的分布

5hmC 廣泛分布于哺乳動(dòng)物的組織和細(xì)胞中，與5mC 不同，各組織間5hmC 的含量具有明顯的差異。Globisch 等［15］通過(guò)對(duì)成年小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，5hmC 在大腦皮層的含量最高，約占脫氧鳥嘌呤的0.7%；在脾臟中的含量最低，約0.03%；而各組織間5mC 含量差別不大，為（4.22±0.22）%。值得注意的是，5hmC 的豐度遠(yuǎn)低于5mC，人類基因組中約80%的CpG 發(fā)生了甲基化修飾，而成人5hmC 含量最豐富的大腦組織中也僅有約13%的CpG 發(fā)生了羥甲基化［16］，這對(duì)精確檢測(cè)5hmC提出了挑戰(zhàn)。在基因組的分布上，Cui等［17］通過(guò)繪制人體19 種組織的5hmC 修飾圖譜，發(fā)現(xiàn)不同組織中5hmC 在基因組分布上的一致性：在啟動(dòng)子、外顯子和增強(qiáng)子上富集，在基因間區(qū)和在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)處相對(duì)缺失。

1.3 5hmC的檢測(cè)技術(shù)

研究人員基于色譜、質(zhì)譜、高通量測(cè)序等技術(shù)開發(fā)了多種對(duì)5hmC 定量或定位的檢測(cè)方法，根據(jù)不同的研究目的，可以從基因組的三個(gè)水平上檢測(cè)5hmC。

（1）基因組總體5hmC 水平：常用的方法有薄層色譜［6-7］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用［15，18］、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）［19］、免疫組化［18］等。這類方法成本較低、易于開展，然而只能提供基因組5hmC 的總體平均水平，無(wú)法開展后續(xù)基因通路、分子機(jī)制的研究。

（2）基因組特定區(qū)域5hmC 水平：主要是先通過(guò)各種富集方法，如抗體、葡糖基修飾、限制性內(nèi)切酶［20］等，將含有5hmC 的DNA 片段富集后，再聯(lián)合高通量測(cè)序或芯片技術(shù)測(cè)定基因組特定區(qū)域的5hmC 分布，如羥甲基化DNA 免疫共沉淀測(cè)序（hydroxymethylated DNA immunoprecipitation coupled with deep sequencing，hMeDIP-Seq）［18］等。這類方法可以識(shí)別一些差異羥甲基化區(qū)域（differentially 5-hydroxymethyated regions，DhMRs），但對(duì)5hmC 密度低的區(qū)域檢測(cè)靈敏度較低，并不能準(zhǔn)確測(cè)定5hmC的總量，無(wú)法達(dá)到單堿基分辨率的水平。

（3）基因組單堿基5hmC 水平：甲基化的常用檢測(cè)技術(shù)如重亞硫酸鹽測(cè)序（bisulfite sequencing，BSSeq）等，并不能區(qū)分5mC和5hmC，因此研究人員開發(fā)出基于BS-Seq的TET輔助重亞硫酸鹽測(cè)序（TET-assisted bisulfite sequencing，TAB-Seq）、氧化重亞硫酸鹽測(cè)序（oxidative bisulfite sequencing，OxBS-Seq）等方法［20］，先采用不同的化學(xué)修飾手段在測(cè)序前將5hmC 與5mC區(qū)別開，然后通過(guò)比對(duì)同一樣品在化學(xué)修飾前后BS-Seq 測(cè)定的序列，從而定位5hmC。但由于重亞硫酸鹽對(duì)DNA樣本具有較強(qiáng)的破壞性，在樣本量少時(shí)應(yīng)用有局限性，因而研究人員又開發(fā)了借助單分子實(shí)時(shí)測(cè)序［21］和納米孔測(cè)序［22］檢測(cè)5hmC 的第三代測(cè)序技術(shù)，以及載脂蛋白B mRNA 編輯酶催化多肽耦聯(lián)表觀遺傳測(cè)序［23］、TET 輔助吡啶硼烷測(cè)序［24］等不依賴重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的新技術(shù)。這類方法可以檢測(cè)全基因組單個(gè)CpG 位點(diǎn)的羥甲基化狀態(tài)，能夠提供更多的生物學(xué)信息，但目前由于價(jià)格昂貴，在大樣本人群研究中比較受限。

2 環(huán)境因素暴露對(duì)5hmC水平影響的研究現(xiàn)狀

DNA主動(dòng)去甲基化增強(qiáng)了細(xì)胞和組織的可塑性，并且為環(huán)境分子流行病學(xué)研究提供了一個(gè)新的潛在的效應(yīng)生物標(biāo)志物—5hmC。5hmC 是TET 的主要氧化產(chǎn)物，故TET 蛋白表達(dá)增加或者活性增強(qiáng)能夠升高5hmC 的水平。由于TET 的酶促反應(yīng)需以α-KG 和O2為底物，以Fe2+和維生素C 作為輔因子，所以各底物和輔因子的濃度能夠直接影響5mC 的氧化效率［25-28］，進(jìn)而影響5hmC 的水平。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境因素可以通過(guò)體內(nèi)的代謝過(guò)程影響上述TET 的底物和輔因子的水平從而與5hmC 關(guān)聯(lián)，也可以通過(guò)對(duì)TET基因本身或轉(zhuǎn)錄后RNA、翻譯后蛋白質(zhì)的調(diào)控來(lái)影響基因組5hmC水平［29］。

2.1 金屬和類金屬

金屬和類金屬在工業(yè)生產(chǎn)和日常生活中應(yīng)用廣泛，人體長(zhǎng)時(shí)間低劑量接觸可使其在某些器官或組織中蓄積，引起慢性毒性作用。目前已有研究報(bào)道了砷、鉛、汞、鎘、鉻、鎳、銻等金屬或類金屬與5hmC 水平的關(guān)聯(lián)［30-38］，5hmC 有望成為某些金屬或類金屬暴露的效應(yīng)生物標(biāo)志物。

砷是確認(rèn)的人類致癌物，職業(yè)暴露可引起肺癌、皮膚癌、膀胱癌等［31］。目前已有多篇研究報(bào)道了砷對(duì)5hmC水平的影響。Zhang等［32］通過(guò)給予雄性大鼠8周較低水平（0.5、2或10 ppm）的飲用水亞砷酸鈉暴露，觀察到5hmC 的整體水平在心、肺、脾中升高，在胰腺中下降，而大多數(shù)器官的5mC 整體水平并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的改變；作者認(rèn)為這可能是由于S-腺苷蛋氨酸在低水平砷暴露時(shí)仍保持穩(wěn)態(tài)，可以同時(shí)為砷甲基化和DNA 甲基化提供甲基供體，該研究提示5hmC 也許能比5mC 更加敏感地指示砷暴露。Niedzwiecki 等［31］基于孟加拉國(guó)的兩個(gè)隊(duì)列人群（分別為196 人和375 人）檢測(cè)外周血白細(xì)胞或單核細(xì)胞DNA 的5hmC 水平，發(fā)現(xiàn)飲用水中的砷以及人體尿砷、血砷濃度與5hmC 水平的關(guān)聯(lián)具有性別差異，在男性中呈正相關(guān)，在女性中呈負(fù)相關(guān)。Du 等［33］對(duì)剛斷乳的雄性大鼠用三氧化二砷飲水染毒6 個(gè)月，發(fā)現(xiàn)砷暴露可以降低大腦皮層和海馬組織中5mC 和5hmC 的水平，損害大鼠的認(rèn)知能力，并且這種神經(jīng)毒性與氧化應(yīng)激和α-KG 的水平有關(guān)。

由于多種重金屬或其化合物能夠通過(guò)胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，因此孕期鉛、汞、鎘、砷等重金屬的暴露對(duì)子代表觀基因組的影響是目前的研究熱點(diǎn)之一［34］。Cardenas 等［35］基于美國(guó)的出生隊(duì)列首次評(píng)估孕期汞暴露和子代基因組5hmC 水平的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)306 位孕婦孕中期時(shí)紅細(xì)胞汞濃度與新生兒臍帶血中5hmC 水平呈負(fù)相關(guān)，并且這種關(guān)聯(lián)可持續(xù)到出生后5年。Sen等［36］運(yùn)用改良的羥甲基化DNA 免疫共沉淀結(jié)合450K芯片的方法檢測(cè)基因組5hmC，研究產(chǎn)前鉛暴露影響新生兒臍帶血基因組5hmC 的模式，發(fā)現(xiàn)與鉛相關(guān)的DhMRs 可以進(jìn)一步分為與性別有關(guān)和無(wú)關(guān)的兩種類型。

在金屬影響5hmC的機(jī)制研究方面，Yin等［37］利用尺寸排阻色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，Ni2+可與小鼠TET1蛋白的催化中心域結(jié)合，并且其親和力是輔因子Fe2+的7.5倍，因此能有效地替換掉Fe2+，抑制TET1的催化活性，降低5hmC的形成。此外，他們還發(fā)現(xiàn)Pb2+和Cd2+也有類似的作用，但其親和力比Ni2+弱。Liu等［38］發(fā)現(xiàn)亞砷酸鹽在體外可以直接結(jié)合到TET蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)上，抑制TET介導(dǎo)的5hmC生成。

2.2 醌類化合物

醌類化合物是一類廣泛存在于環(huán)境中的氧化還原活性物質(zhì)，能夠刺激活性氧的產(chǎn)生，具有一定的細(xì)胞毒性、免疫毒性和致癌性，同時(shí)也因其對(duì)癌細(xì)胞具有極強(qiáng)的殺傷力而被用作抗癌藥物［28］。Zhao等［28］研究發(fā)現(xiàn)殺蟲劑五氯苯酚的活性代謝物四氯苯醌和四氯氫醌可以提高細(xì)胞內(nèi)可利用Fe2+的水平，從而刺激TET蛋白的催化活性，促進(jìn)多種人源細(xì)胞株5hmC的形成。Coulter等［39］也發(fā)現(xiàn)了苯的代謝產(chǎn)物氫醌可通過(guò)提高TET1的活性，升高HEK293T細(xì)胞中的5hmC水平。

2.3 雙酚類內(nèi)分泌干擾物

雙酚A 和雙酚S 廣泛應(yīng)用于食品包裝、飲料容器、醫(yī)療器械等塑料制品的生產(chǎn)，是常見的環(huán)境雌激素，研究發(fā)現(xiàn)其具有一定的生殖毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性、胚胎發(fā)育毒性和潛在的致癌性等［40］。Zheng 等［41］對(duì)30 位雙酚A 職業(yè)暴露的男性和25 例對(duì)照進(jìn)行了精子樣本的全基因組5hmC 的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)職業(yè)暴露者的5hmC 整體水平升高。Li 等［42］通過(guò)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系的研究揭示雙酚A/S 可與雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）結(jié)合使其形成二聚體和發(fā)生磷酸化，激活的ERα 可促進(jìn)DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）1 和DNMT3B 甲基化TET2基因的啟動(dòng)子，從而抑制TET2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，降低基因組5hmC 水平，最終促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，并具有明顯的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系和劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.4 大氣顆粒物

大氣顆粒物是化學(xué)組成較為復(fù)雜的環(huán)境污染物，可引發(fā)呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等多種器官系統(tǒng)的疾病，增加死亡風(fēng)險(xiǎn)。Sanchez-Guerra等［43］在北京招募60名卡車司機(jī)和60 名辦公室工作人員作為研究對(duì)象，每人佩戴采樣器以評(píng)估個(gè)體PM2.5的暴露水平，并根據(jù)環(huán)境監(jiān)測(cè)點(diǎn)的PM10數(shù)據(jù)綜合評(píng)估個(gè)人1、4、7和14 d 的PM10平均暴露水平，采用ELISA 檢測(cè)外周血DNA 5mC和5hmC 水平，觀察到PM10與5hmC 呈穩(wěn)定的正相關(guān)關(guān)系，但與5mC 關(guān)聯(lián)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為這可能與暴露水平、檢測(cè)方法的精確程度以及5hmC、5mC 本身具有不同的生物學(xué)功能有關(guān)。比利時(shí)魯汶大學(xué)的學(xué)者De Nys 等［44］以26 名學(xué)生的口腔頰黏膜細(xì)胞作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)一周內(nèi)PM2.5和PM10的平均暴露水平與細(xì)胞5hmC整體水平呈負(fù)相關(guān)。

2.5 生活方式

目前已有一些研究關(guān)注了吸煙、飲酒、鍛煉、飲食習(xí)慣等多種生活方式與TET 蛋白及5hmC 水平的關(guān)聯(lián)［45-48］。Ringh 等［45］通過(guò)對(duì)20 名吸煙和29 名不吸煙健康志愿者的支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞進(jìn)行羥甲基化的芯片檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)吸煙者的差異羥甲基化位點(diǎn)幾乎均呈高羥甲基化的狀態(tài)。Gatta 等［46］基于一項(xiàng)25 對(duì)慢性酗酒者和非酗酒者的病例對(duì)照研究，發(fā)現(xiàn)酗酒者的小腦組織中TET1mRNA 表達(dá)水平高于對(duì)照組，但5hmC平均水平升高無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Jessop 等［47］發(fā)現(xiàn)老年小鼠的自主鍛煉情況與海馬體中TET1/2mRNA 的表達(dá)水平及miR-137基因啟動(dòng)子區(qū)的5hmC 水平呈正向關(guān)聯(lián)。Spallota 等［48］通過(guò)對(duì)人群、小鼠和細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，高脂高糖飲食暴露可能會(huì)造成心臟間充質(zhì)干細(xì)胞5mC 及其氧化產(chǎn)物5hmC、5fC 累積。Wu 等［18］研究發(fā)現(xiàn)較高的葡萄糖濃度能抑制人外周血單核細(xì)胞的5hmC水平，而5mC總體水平變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，多種環(huán)境因素的暴露均可引起基因組5hmC水平的改變，并常具有以下共同點(diǎn)：（1）在相同的環(huán)境刺激下，基因組5hmC 的整體水平出現(xiàn)了明顯變化時(shí)，5mC 的整體水平尚未發(fā)生明顯改變。這提示5hmC 可能是一個(gè)比5mC 更加敏感的效應(yīng)標(biāo)志物，但具體的生物學(xué)機(jī)制尚不明確；（2）環(huán)境因素暴露引起的5hmC 變化具有組織器官、細(xì)胞類型的差異，因此，在不同的研究過(guò)程中要注意所選生物樣本對(duì)目標(biāo)疾病的代表性；（3）環(huán)境因素暴露引起的5hmC 變化存在性別差異。然而，目前的大多數(shù)研究?jī)H建立了環(huán)境因素與5hmC 總體水平的關(guān)聯(lián)，未采用單堿基分辨率的方法，所以無(wú)法選出對(duì)環(huán)境敏感的特異性靶基因或者CpG 位點(diǎn)，限制了進(jìn)一步的分子機(jī)制的解析。環(huán)境因素通過(guò)5hmC 影響特定基因表達(dá)的機(jī)制將是未來(lái)環(huán)境與健康研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。

3 5hmC與疾病的研究現(xiàn)狀

5hmC 的異常改變可能是引起多種疾病發(fā)生的生物學(xué)基礎(chǔ)［49］，已有研究報(bào)道了5hmC 與多種重大慢性?。ò◥盒阅[瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等）的關(guān)聯(lián)。

3.1 5hmC與惡性腫瘤

5hmC整體水平的降低是惡性腫瘤的表現(xiàn)特征之一。研究人員在肺癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、皮膚癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和造血系統(tǒng)腫瘤等多種腫瘤樣本中均發(fā)現(xiàn)了5hmC總體水平的下降［50-51］。研究發(fā)現(xiàn)，肺鱗癌組織中的5hmC 水平可低至正常肺組織的1/5，而腦腫瘤中可降低至1/30［51］?？赡艿脑蛴校海?）TET及相關(guān)基因如IDH、WT1的突變是多種腫瘤發(fā)生的共同早期事件［25，52］，由此造成的TET 的表達(dá)減少或功能異?？赡茉斐?hmC 生成減少；（2）TET 蛋白對(duì)α-KG、O2和Fe2+的依賴性使其催化活性受細(xì)胞代謝狀態(tài)的調(diào)控［25-28］，而腫瘤細(xì)胞異常的能量代謝和氧化狀態(tài)可能抑制TET 的功能，導(dǎo)致5hmC 表達(dá)水平降低；（3）腫瘤細(xì)胞增殖較快，在不斷的DNA復(fù)制過(guò)程中，由于DNMT1具有底物偏好性［53］，難以維持胞嘧啶的羥甲基化，因此逐漸稀釋了基因組中5hmC的密度。

研究發(fā)現(xiàn)，TET 蛋白與5hmC 參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。Li 等［42］、Park 等［54］、Lian 等［55］多位研究者通過(guò)在人乳腺癌、胃癌、或黑色素瘤細(xì)胞系中敲減或敲除TET 蛋白，觀察到5hmC 水平降低和細(xì)胞增殖能力提高的現(xiàn)象，且發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)TET 蛋白可重建5hmC的水平并抑制腫瘤的生長(zhǎng)。在5hmC 對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制方面，Kafer 等［56］研究發(fā)現(xiàn)5hmC 富集在癌細(xì)胞系中的內(nèi)源性DNA 損傷位點(diǎn)以及微輻射或阿非迪霉素誘導(dǎo)的外源性DNA 損傷位點(diǎn)，認(rèn)為5hmC 在維護(hù)基因組的完整性方面發(fā)揮著重要作用。Uribe-Lewis 等［57］的研究發(fā)現(xiàn)正常組織中基因啟動(dòng)子區(qū)的5hmC 高表達(dá)可以抑制與癌癥發(fā)生相關(guān)的基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化。Jia等［58］研究發(fā)現(xiàn)5hmC及其結(jié)合蛋白淋巴特異性解旋酶表達(dá)水平的降低與腫瘤的轉(zhuǎn)移和基因組不穩(wěn)定性有關(guān)。Sun 等［59］研究發(fā)現(xiàn)TET1 可以通過(guò)調(diào)控特定基因（HOXA）啟動(dòng)子的去甲基化來(lái)抑制小鼠乳腺癌移植瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

5hmC 在腫瘤的早期診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)和液體活檢等方面的具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。Cai 等［60］利用5hmC-Seal 技術(shù)檢測(cè)早期肝癌患者和正常人外周血循環(huán)DNA（circulating free DNA，cfDNA）中的5hmC，尋找有明顯差異的5hmC位點(diǎn)，隨后利用彈性網(wǎng)絡(luò)分析和十倍交叉驗(yàn)證的方法對(duì)差異位點(diǎn)進(jìn)一步篩選，利用得到的32 個(gè)位點(diǎn)建立肝癌的早期診斷模型，該模型在獨(dú)立樣本中驗(yàn)證ROC 曲線下的面積可達(dá)88.4%。Song等［61］采用改良的hMe-Seal技術(shù)檢測(cè)7種癌癥cfDNA的5hmC，發(fā)現(xiàn)肺癌、肝癌和胰腺癌的cfDNA中顯示出不同的5hmC模式，使用機(jī)器學(xué)習(xí)算法可以準(zhǔn)確區(qū)分這三種癌癥類型；還發(fā)現(xiàn)5hmC水平隨著肺癌的進(jìn)展呈階段性下降，且cfDNA的5hmC水平可用于肝癌患者的治療和復(fù)發(fā)情況的監(jiān)測(cè)。隨著研究的不斷深入，5hmC在腫瘤領(lǐng)域的臨床應(yīng)用價(jià)值正在逐步被發(fā)掘。

3.2 5hmC與神經(jīng)系統(tǒng)疾病

腦組織中存在豐富的5hmC，因此其在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能引起了研究人員們的關(guān)注。研究表明，5hmC參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程，且與雷特綜合癥、孤獨(dú)癥等神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病以及阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）、亨廷頓病、帕金森等神經(jīng)退行性疾病有關(guān)［62］。Coppieters 等［63］通過(guò)免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照人群相比，AD 患者額葉中回以及顳中回的5mC 和5hmC 水平增加，且其增加的幅度與AD 的病理分子標(biāo)志（β-淀粉樣蛋白、tau 蛋白和泛素蛋白）呈正相關(guān)。Fetahu 等［64］將AD 患者和健康對(duì)照來(lái)源的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞逐步誘導(dǎo)分化成皮層神經(jīng)元，然后通過(guò)OxBS-Seq 和甲基化酶輔助亞硫酸氫鹽測(cè)序法以單堿基分辨率繪制全基因組5mC、5hmC、5fC/5caC 的分布情況，得到了能夠在獨(dú)立的臨床隊(duì)列中印證的、與AD相關(guān)的27 個(gè)區(qū)域和39 個(gè)CpG 位點(diǎn)，證明5mC 及其氧化產(chǎn)物的改變發(fā)生于疾病進(jìn)展前。由于高度分化的神經(jīng)元幾乎不會(huì)分裂，因此無(wú)法通過(guò)依賴細(xì)胞復(fù)制的被動(dòng)去甲基化機(jī)制去甲基化，所有甲基的消除幾乎都需要主動(dòng)去甲基化，5hmC 作為主動(dòng)去甲基化的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，有可能成為AD 早期診斷的一大突破。

3.3 5hmC與心血管疾病

越來(lái)越多的研究在心血管疾病中發(fā)現(xiàn)TET 和5hmC 的異常改變。Jiang 等［65］研究發(fā)現(xiàn)113 位病人外周血單核細(xì)胞的5mC 和5hmC 水平與頸動(dòng)脈斑塊的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)；且校正混雜因素后，僅發(fā)現(xiàn)5hmC（而不是5mC）是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素。Liu 等［66］研究發(fā)現(xiàn)TET2 和5hmC 在收縮型的血管平滑肌細(xì)胞中富集，而在去分化型的平滑肌細(xì)胞中缺失，且其缺失程度與小鼠的血管損傷程度和動(dòng)脈粥樣硬化程度呈正相關(guān)；在體內(nèi)，局部過(guò)表達(dá)TET2 可恢復(fù)5hmC 的水平和收縮相關(guān)基因的表達(dá)，并減輕內(nèi)膜增生。此外，除了調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換，5hmC 還可能參與動(dòng)脈粥樣硬化病變過(guò)程中血管內(nèi)皮細(xì)胞的程序性死亡、免疫細(xì)胞的分化等過(guò)程［67］。

近年來(lái)，DNA 羥甲基化與多種重大慢性病的研究取得了一定的進(jìn)展，5hmC 的高度組織特異性和敏感性為闡明疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，開發(fā)早期診斷技術(shù)和發(fā)現(xiàn)有效干預(yù)靶點(diǎn)提供了極具前景的表觀遺傳學(xué)新策略。然而，目前關(guān)于5hmC 的流行病學(xué)研究通常樣本量較小，今后還需要開展大規(guī)模、多中心的前瞻性研究來(lái)確定與重大慢性病相關(guān)的5hmC 位點(diǎn)，并在精細(xì)設(shè)計(jì)的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中探討其生物學(xué)機(jī)制。

4 5hmC在環(huán)境暴露與疾病間關(guān)聯(lián)的作用

5hmC 不僅受到環(huán)境因素的影響，也與多種慢性病的發(fā)生有關(guān)，因此5hmC 作為表觀遺傳學(xué)的重要指標(biāo)，在連接環(huán)境暴露與疾病發(fā)生過(guò)程中可能發(fā)揮“橋梁”作用。Li 等［42］基于雙酚類內(nèi)分泌干擾物與乳腺癌的流行病學(xué)背景，研究發(fā)現(xiàn)雙酚A 和雙酚S 可通過(guò)激活ERα，上調(diào)DNMTs 的表達(dá)，進(jìn)而提高TET2基因啟動(dòng)子的甲基化水平，使TET2表達(dá)水平和基因組5hmC 水平降低，最終促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，建立了環(huán)境污染物-TET2-5hmC-細(xì)胞增殖之間的關(guān)聯(lián)。Wu 等［18］在多種人源腫瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，高糖狀態(tài)可抑制腺苷酸活化蛋白激酶對(duì)TET2 蛋白的磷酸化作用，使TET2 蛋白不穩(wěn)定，5hmC 水平下降，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)；并結(jié)合hMeDIP-seq、基因表達(dá)譜芯片、RT-qPCR 發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證了高糖環(huán)境下與DhMR 相關(guān)的上調(diào)原癌基因和下調(diào)抑癌基因；該研究將細(xì)胞外葡萄糖濃度與5hmC 的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)、腫瘤細(xì)胞的增殖聯(lián)系起來(lái)，描述了一個(gè)從營(yíng)養(yǎng)環(huán)境改變到出現(xiàn)健康效應(yīng)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。隨著環(huán)境分子流行病學(xué)研究的不斷深入，今后將會(huì)有更多關(guān)于5hmC 在環(huán)境暴露與疾病間關(guān)聯(lián)的研究報(bào)道。

5 總結(jié)和展望

DNA 羥甲基化作為新興的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志物，能夠敏感指示環(huán)境暴露的生物效應(yīng)，在環(huán)境分子流行病學(xué)中逐漸受到重視。盡管已有大量研究將5hmC 整體水平的變化與環(huán)境暴露或疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)，但是5hmC 的生物學(xué)功能還沒(méi)有被完全認(rèn)識(shí)，多種環(huán)境因素復(fù)合暴露如何誘導(dǎo)5hmC 譜的變化也尚不清楚。因此，在今后的體內(nèi)外功能研究中，發(fā)展準(zhǔn)確靈敏且低成本的單細(xì)胞組學(xué)分析技術(shù)，并結(jié)合位點(diǎn)特異性的5hmC 修飾技術(shù)，實(shí)現(xiàn)單個(gè)位點(diǎn)的5hmC 的寫入或擦除，將有助于進(jìn)一步揭示5hmC 的生物學(xué)功能；在大樣本前瞻性隊(duì)列研究中，將暴露組、表觀遺傳組、基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組等多組學(xué)生物技術(shù)結(jié)合起來(lái)，有助于進(jìn)一步明確與疾病有關(guān)聯(lián)的5hmC 位點(diǎn)，闡明疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，探索有效的早期診斷標(biāo)志物。