呂佳鑫，馬璐，張愛華

貴州醫(yī)科大學 a.環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點實驗室 b.公共衛(wèi)生學院毒理學系，貴州 貴陽 550025

砷是危害人體健康的常見環(huán)境污染物，砷暴露可引起多系統(tǒng)多臟器的損傷，肝臟是其主要的靶器官之一［1］。研究顯示，氧化應(yīng)激是砷致肝臟損傷的主要機制，砷暴露可以通過促進氧自由基產(chǎn)生，抑制抗氧化酶表達水平及活性，破壞肝臟氧化-抗氧化平衡，誘導肝臟的氧化損傷，從而進一步引起肝臟持續(xù)性炎癥等損傷的發(fā)生［1-2］。目前研究發(fā)現(xiàn)除經(jīng)典的氧化應(yīng)激調(diào)控通路外，表觀遺傳修飾是調(diào)控砷誘導氧化損傷的新途徑。如砷可通過干擾DNA 甲基化、miRNA 的正常表達，造成其靶向的抗氧化酶轉(zhuǎn)錄抑制等方式，參與砷誘導氧化損傷的進程［3-4］。組蛋白修飾是表觀遺傳調(diào)控的另一種重要機制，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)H3 第36位賴氨酸三甲基（H3 lysine 36 trimethylation，H3K36me3）是參與砷誘導體外細胞氧化應(yīng)激調(diào)控的關(guān)鍵靶點［5］。近年研究也揭示了H3K36me3 的水平異?？蓞⑴c肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展［6］。

為了探討H3K36me3 是否參與砷誘導肝氧化損傷的調(diào)控，本研究在課題組成功建立砷暴露致大鼠肝損傷模型基礎(chǔ)上，檢測大鼠肝組織中砷水平、組蛋白H3K36me3 修飾水平以及尿8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8-OHdG）和肝臟丙二醛（malondialdehyde，MDA）等氧化損傷指標水平，通過分析肝砷、肝組織H3K36me3、氧化損傷指標之間的關(guān)系以及H3K36me3 對砷致肝氧化損傷的中介效應(yīng)，探討H3K36me3 在砷致肝氧化損傷中的作用，為砷致肝氧化損傷的調(diào)控機制研究尋找特異的表觀遺傳靶點提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 主要儀器與試劑

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）、超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS）、酶標儀（Thermo Fisher，美國），全自動樣品快速研磨器（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司，中國），高速冷凍離心機（Eppendorf，德國）。亞砷酸鈉（Sigma，美國），濃硝酸、硫酸、過氧化氫（天津市大茂化學試劑廠，中國），蛋白酶抑制劑Cocktail（Roche，瑞士）、H3K36me3 抗體（Abcam，英國），lgG抗鼠二抗（Proteintech，美國），H3K36me3 重組蛋白標準品（Active Motif，美國），四甲基聯(lián)苯（TMB）顯色劑、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所，中國），MDA 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國），8-OHdG 的同位素（13C10、15N5）內(nèi)標、8-OHdG 標準品（Sigma，美國）。

1.2 實驗動物分組及處理

本研究依托課題組前期建立的砷中毒大鼠肝損傷模型［7］，動物模型建立如下：32 只健康初斷乳Wistar 大鼠，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司［合格證號為SCXK（遼）2015-0003］。其中體重為80～100 g，雌雄各半。實驗期間，大鼠飼養(yǎng)在清潔級動物房內(nèi)（室溫22～24℃，濕度60%～70%，光照/黑暗交替12 h/12 h），分籠飼養(yǎng)，自由攝取飼料，自由飲水。將大鼠按體重采用隨機數(shù)字表法分為對照組，低、中、高染砷劑量組，每組8 只。大鼠亞砷酸鈉半數(shù)致死量（LD50）為41 mg·kg-1（以體重計，后同），按照亞慢性毒性試驗劑量設(shè)計原則，低、中、高染砷組分別給予2.5（1/16 LD50）、5.0（1/8 LD50）、10.0（1/4 LD50）mg·kg-1（以體重計，后同）亞砷酸鈉溶液，對照組給予去離子水，灌胃染毒，灌胃量為10 mL·kg-1，每周連續(xù)染毒6 d，共處理4個月。實驗終期采集大鼠24 h尿樣，大鼠處死后取肝臟樣本。依據(jù)大鼠肝組織病理形態(tài)及肝功能指標（總膽汁酸、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶）改變與亞砷酸鈉的劑量-反應(yīng)關(guān)系來判定砷中毒大鼠肝損傷模型的成功構(gòu)建［7-8］。本研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學倫理委員會審查批準（批準號：

1403059）。

1.3 肝砷水平檢測

肝組織經(jīng)消化處理（0.3 g肝組織于6.0 mL濃HNO3及2.0 mL H2O2溶液中，微波消解后用2% HNO3定容至25 mL，微孔濾膜過濾）于ICP-MS 上機檢測，采用標準曲線法根據(jù)樣品的峰面積計算肝中砷的質(zhì)量分數(shù)，以每克肝中砷元素的質(zhì)量表示。

1.4 肝中組蛋白提取及H3K36me3修飾水平的測定

肝組織與預(yù)冷裂解緩沖液按1：6 于研磨儀中研磨后離心、棄上清，留沉淀，酸抽提法提取組蛋白，BCA 蛋白濃度測定試劑盒進行定量；采用ELISA 法檢測H3K36me3 水平，100 μL·孔-1的H3 抗體稀釋液（1：10 000）包被96孔板，4°C過夜；PBST（包含1×PBS、0.05% Tween-20）清洗3 次，含5%脫脂牛奶的PBST 200 μL·孔-1，室溫封閉2 h；PBST清洗，每孔加入100 μL H3K36me3 重組蛋白標準品（0、0.313、0.625、1.25、2.5、5、10 μg·mL-1）及樣品（20 μg·mL-1），室溫搖床孵育1.5 h；PBST 清洗，每孔加入100 μL H3K36me3 抗體（1：3 000）室溫搖床孵育1 h；PBST 清洗，每孔加入100 μL IgG 抗鼠二抗（1：5 000），室溫搖床孵育1 h；PBST 清洗，每孔加入200 μL TMB 顯色液避光室溫孵育0.5 h后，加入50 μL 2 mol·L-1硫酸終止顯色；在酶標儀波長為450 nm 處檢測吸光度（D）值，并根據(jù)標準曲線計算H3K36me3 的質(zhì)量分數(shù)，以每克肝中組蛋白H3K36me3的質(zhì)量表示。

1.5 尿8-OHdG 水平的測定

將處理的尿液混勻液［150 μL尿液+150 μL 10 mmol·L-1醋酸鈉（NaAc，pH=7.5）+7.5 μL 400 μg·L-1同位素（13C，15N2）內(nèi)標8-OHdG］于被甲醇活化親水親油平衡的固相萃取小柱（60 mg，3cc，Waters Oasis）中，將待測物在小柱中經(jīng)過富集、去離子水沖洗、洗脫等過程，放置氮吹儀吹至近干。加入150 μL 甲醇流動相，經(jīng)離心、取上清液于上樣瓶中。用UPLC-MS/MS 分析標品、樣品中8-OHdG 及同位素（13C，15N2）內(nèi)標8-OHdG 的峰面積，根據(jù)標準曲線用內(nèi)標法計算尿中8-OHdG 的質(zhì)量濃度，以每毫升尿液8-OHdG 的質(zhì)量表示。

1.6 肝MDA水平的測定

肝組織與裂解液按1：9配置10%肝組織勻漿稀釋液，離心、棄沉淀，取上清。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量。采用硫代巴比妥酸法（TBA 法），根據(jù)MDA 檢測試劑盒的操作步驟及計算方法完成檢測，以試劑盒推薦的單位nmol·mg-1（以蛋白計）表示肝組織中MDA水平。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0 對實驗數(shù)據(jù)進行分析。計量資料進行正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH法，采用Kruskal-Wallis 單因素方差分析法進行兩兩比較，經(jīng)對數(shù)變換后采用線性回歸進行趨勢分析；正態(tài)分布且方差齊數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步采用SNK 法進行兩兩比較，趨勢分析采用線性趨勢檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson 分析方法。將肝砷水平對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行中介效應(yīng)檢驗，肝砷水平為自變量，8-OHdG、MDA 水平為應(yīng)變量，肝組蛋白H3K36me3 水平為中介變量，建立“肝砷—H3K36me3—8-OHdG”及“肝砷—H3K36me3—MDA”中介檢驗?zāi)Ｐ?，通過PROCESS 3.2 軟件采用Bootstrap 法對H3K36me3 修飾水平在砷暴露與肝氧化應(yīng)激的中介效用進行檢驗［9］，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 砷染毒大鼠肝臟砷水平、H3K36me3 修飾水平及氧化損傷指標的改變

4 個指標不同染毒組間比較差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表1；與對照組相比，低、中、高砷劑量組肝砷水平、尿8-OHdG 和肝MDA 水平升高（均P＜0.05），而肝H3K36me3修飾水平降低（P＜0.05）；肝砷水平、尿8-OHdG 和肝MDA 水平隨染砷劑量的增加逐漸升高（P趨勢＜0.01），而肝H3K36me3修飾水平逐漸降低（P趨勢＜0.01），見表1。

表1 砷染毒大鼠肝砷水平、H3K36me3 修飾及氧化損傷水平（n=8）Table 1 The levels of arsenic,H3K36me3 modification,and oxidative damage in liver of rats exposed to arsenic (n=8)

2.2 大鼠肝砷水平、肝H3K36me3 修飾水平、氧化損傷指標間的關(guān)聯(lián)性

大鼠肝砷水平與肝H3K36me3 修飾水平呈負相關(guān)（r=-0.715，P＜0.01），與尿8-OHdG、肝MDA 水平呈正相關(guān)（r=0.701、0.748，均P＜0.01），且肝H3K36me3 修飾水平與尿8-OHdG、肝MDA水平呈負相關(guān)（r=-0.660、-0.683，均P＜0.01）；此外，尿中8-OHdG 水平與肝中MDA水平呈正相關(guān)（r=0.778，P＜0.01）。

2.3 H3K36me3的中介效應(yīng)

砷暴露對8-OHdG 和MDA 的總效應(yīng)、直接效應(yīng)及以H3K36me3 介導的中介效應(yīng)均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），且H3K36me3 在砷致8-OHdG 和MDA 水平的中介效應(yīng)分別占總效應(yīng)的30.97%、38.91%，見表2。

表2 H3K36me3 介導砷暴露與氧化損傷的中介效應(yīng)（n=8）Table 2 Mediating effect of H3K36me3 on arsenic exposure and oxidative damage (n=8）

3 討論

砷暴露致機體多系統(tǒng)多臟器的毒作用機制研究一直以來備受國內(nèi)外學者關(guān)注。肝臟作為砷毒性蓄積和代謝的主要靶器官，其機制研究除氧化應(yīng)激、遺傳損傷、信號通路轉(zhuǎn)導等途徑外，表觀遺傳修飾也是砷暴露與肝細胞損害或肝組織結(jié)構(gòu)和功能異常的重要媒介，其表達的改變可能是肝臟損害或疾病惡變的早期、關(guān)鍵生物學標志［2，8］。因此，進一步探究砷致表觀遺傳修飾的改變對揭示砷致肝損害機制及針對性的防治具有重要的意義和價值。組蛋白修飾是表觀遺傳修飾的重要機制之一。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，組蛋白H3K36me3 可能是砷誘導機體損傷的表觀遺傳調(diào)控新靶點。飲水型及燃煤型砷中毒人群研究顯示，隨著尿砷水平的升高，人外周血淋巴細胞H3K36me3 的修飾水平發(fā)生相應(yīng)改變［10-11］。體外研究顯示H3K36me3 可通過調(diào)控DNA修復(fù)酶［O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）］、氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達參與砷誘導DNA 損傷、氧化損傷的發(fā)生［12，5］，但砷暴露誘導肝臟H3K36me3 改變與其介導砷中毒肝臟早期損傷效應(yīng)的關(guān)系尚不清楚。本課題組前期成功構(gòu)建了砷暴露致大鼠肝損傷模型，發(fā)現(xiàn)隨著染砷劑量的增加，大鼠肝臟出現(xiàn)不同程度的炎性浸潤等病理改變及肝功能指標的紊亂［7-8］。本研究在此基礎(chǔ)上，從整體動物探討砷暴露大鼠肝臟H3K36me3 的表達水平，分析H3K36me3 在砷致大鼠肝氧化損傷中的作用，為進一步探索砷致肝損傷的表觀遺傳機制提供新依據(jù)。

有研究表明，H3K36me3 的修飾改變與多種肝臟疾病密切相關(guān)。據(jù)文獻報道，H3K36me3 表達異?？梢酝ㄟ^抑制膽固醇外排基因的表達，阻礙DNA 錯配修復(fù)機制誘導肝脂肪樣變及肝腫瘤的惡化［13-14］。另有研究報道肝氧化損傷是誘導肝臟持續(xù)炎癥及遠期肝腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵事件［15］。砷暴露誘導肝氧化損傷的多種途徑中，氧自由基增多引發(fā)的致突變損傷產(chǎn)物8-OHdG、脂質(zhì)過氧化物MDA 是評價機體氧化應(yīng)激及氧化損傷程度的敏感生物標志物。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著砷暴露劑量的增加，大鼠尿8-OHdG、肝MDA 的水平升高，尿8-OHdG 與肝MDA 具有相同的變化趨勢，提示尿8-OHdG 改變可間接反映肝中氧化損傷的情況，且尿8-OHdG、肝MDA 均與大鼠肝中砷內(nèi)負荷存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，表明砷暴露誘導的氧化損傷是砷致大鼠肝損傷發(fā)生發(fā)展的直接原因。近年研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白修飾可以通過調(diào)控氧化應(yīng)激通路中關(guān)鍵因子及抗氧化酶的表達誘導機體氧化損傷的發(fā)生［16］，推測組蛋白修飾也可能是誘導靶器官氧化損傷的重要環(huán)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠肝H3K36me3 的表達隨著砷暴露劑量的增加不斷降低，且其與氧化損傷指標（尿8-OHdG、肝MDA）水平呈負相關(guān)，提示砷誘導大鼠氧化損傷的進程中，H3K36me3 修飾水平的改變在其中扮演了重要角色。

本研究進一步采用中介效應(yīng)方法探索H3K36me3修飾異常在砷致肝氧化損傷中的貢獻。中介效應(yīng)是指變量間的影響關(guān)系（X→Y）不是直接的因果鏈關(guān)系而是通過一個或一個以上變量（M）的間接影響產(chǎn)生的，此時稱M為中介變量，而X通過M對Y產(chǎn)生的間接影響稱為中介效用，是揭示自變量（X）對應(yīng)變量（Y）影響的內(nèi)在機制檢驗方法，已廣泛應(yīng)用于心理、預(yù)防等領(lǐng)域的醫(yī)學研究［9］。鑒于本研究肝中砷負荷、H3K36me3 與大鼠肝氧化損傷三者的關(guān)系滿足中介效應(yīng)分析中中介因素需與暴露因素和結(jié)局指標均相關(guān)的條件，通過中介效應(yīng)檢驗發(fā)現(xiàn)砷致大鼠肝氧化損傷指標改變的總影響中，38.91%是通過H3K36me3的中介效應(yīng)發(fā)揮作用，提示H3K36me3 有望作為研究砷致肝氧化損傷機制的新靶點。另外，本課題組前期發(fā)現(xiàn)抗氧化活性天然藥植物刺梨、銀杏能促進機體排砷解毒，且對砷暴露致肝損傷具有保護作用［17-18］。鑒于表觀遺傳修飾具有可遺傳和可逆性的特點，且有研究報道植物類提取劑4β-羥基含烷醇E 可以通過恢復(fù)H3K36me3 水平，抑制肝細胞凋亡基因剪切異常，減緩肝癌的進展［19］?；诒狙芯堪l(fā)現(xiàn)H3K36me3可能是調(diào)控砷致肝氧化損傷的潛在靶點，提示以H3K36me3為切入點靶向干預(yù)H3K36me3，有可能抑制砷中毒肝損傷的發(fā)生發(fā)展，為后續(xù)干預(yù)研究提供了新思路。

綜上所述，砷暴露可致大鼠肝H3K36me3 修飾水平降低，且其變化與肝氧化損傷密切相關(guān)。本研究初步探索了H3K36me3 在砷致肝氧化損傷中的作用，為后續(xù)深入探討H3K36me3 參與調(diào)控砷致肝損傷的機制提供了依據(jù)。

（志謝：感謝王大朋老師、朱凱和董令同學在動物模型建立等方面的貢獻）