薛黎明，徐佳樂，馮超，邱歆磊，林元杰，徐騫，周志俊，盧大勝，汪國權(quán)

1.上海市疾病預防控制中心 a.化學品毒性檢定所 b.國家環(huán)境保護新型污染物環(huán)境監(jiān)控影響評價重點實驗室，上海 200336

2.復旦大學公共衛(wèi)生學院，上海 200032

氟咯草酮（fluorochloridone，F(xiàn)LC）是一種芽前施用選擇性除草劑［1］，進入我國市場后被廣泛使用［2］，但對其毒性研究有限。根據(jù)2010年歐洲食品安全局（European food safety authority，EFSA）的報告，F(xiàn)LC 具有雄性生殖毒性以及心血管系統(tǒng)毒性，不具有遺傳毒性、致癌性或神經(jīng)毒性［3］。FLC 的雄性生殖毒性機制為通過促進睪丸支持-生精細胞的氧化應激水平和細胞凋亡水平，進而產(chǎn)生生殖毒性損害［4-5］。研究也發(fā)現(xiàn)FLC對雌性倉鼠卵巢細胞及蝌蚪具有遺傳毒性［6-8］。目前缺乏系統(tǒng)研究FLC毒性作用的報道，其危害并未引起重視。對FLC亞慢性毒性試驗發(fā)現(xiàn)其可導致大鼠肝臟系數(shù)、血液脂質(zhì)及血糖水平等變化，F(xiàn)LC 對肝臟損傷及肝功能代謝有一定影響，呈現(xiàn)一定肝毒性［9］。通過建立模擬肝細胞代謝的小鼠3T3 細胞肝微粒孵育體系，考察FLC 肝微粒體孵育后對于3T3 細胞毒性，發(fā)現(xiàn)FLC 的細胞毒性增加，表明FLC 經(jīng)肝代謝后，毒性增強［10］。前期代謝組學結(jié)果發(fā)現(xiàn)500 mg·kg-1劑量FLC灌胃暴露大鼠尿液中葡萄糖、甘露醇、乳酸、丙酮酸等能量代謝相關(guān)代謝物紊亂，導致機體能量代謝異常，表明FLC 的毒性可能與肝臟能量代謝功能異常相關(guān)［9，11］，而呈現(xiàn)肝毒性，但FLC 體外對肝細胞的毒理作用研究尚未見報道。因此，本研究采用大鼠正常肝細胞BRL-3A作為研究模型，從細胞毒性、氧化損傷和細胞凋亡等角度考察FLC對肝細胞的毒性作用和機制。

1 材料與方法

1.1 材料

BRL-3A肝細胞系購自中國科學院細胞庫。主要試劑：杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）完全培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）、胰酶、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、青霉素-鏈霉素雙抗（美國Gibco），F(xiàn)LC（德國Dr.Ehrenstorfer GmbH），噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT；美國Sigma），二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO；中國國藥集團化學試劑有限公司），活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒（中國碧云天生物技術(shù)有限公司），二喹啉甲酸（bicin choninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒、放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）細胞裂解液（美國Thermo Fisher），eBioscience膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）細胞凋亡試劑盒（美國Invitrogen），B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體、Bax抗體（英國Abcam），環(huán)氧合酶-3（cyclooxygenase-3，Cox-3）抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、核酸提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和擴增試劑盒（美國Thermo Fisher），錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，SOD2）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和GAPDH 引物由生工生物工程有限公司合成；96 孔板、6 孔板、15 mL 離心管、25 cm2培養(yǎng)瓶、75 cm2培養(yǎng)瓶（美國Corning），刻度吸管、計數(shù)板（美國Bio-rad），1.5 mL離心管（美國Axygen），水相針式濾器（0.45 μm，中國安譜實驗科技股份有限公司）。

1.2 儀器

主要儀器：CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific）、DMI3000 倒置顯微鏡（德國Leica）、細胞計數(shù)儀（美國Bio-rad）、流式細胞儀（美國BD Biosciences）、酶標儀（瑞士Tecan）、水浴超聲儀（美國BRANSON）。

1.3 BRL-3A細胞培養(yǎng)

將BRL-3A細胞用胰酶消化至70%脫落，加入培養(yǎng)基終止消化。吹打混勻后以5×105個·瓶-1接種于含1%雙抗、10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2孵育培養(yǎng)，48 h后傳代。

1.4 MTT細胞活性檢測

取對數(shù)生長期細胞接種，以1×104個·孔-1密度接種于96孔板，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)基，分別加入0.1 mL 含0.1、1、10、100 μmol·L-1的FLC 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每個濃度設立10 個復孔。染毒完成后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg·mL-1），37℃孵育4 h。棄培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO。完成后每輕輕振搖至晶體溶解，用多功能酶標儀測量490 nm處光密度。

1.5 細胞凋亡檢測

取對數(shù)生長期細胞，以1×105個·孔-1密度接種于6 孔板，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，加入含1、10、100 μmol·L-1的FLC 染毒24 h，按照 Annexin V-FITC 細胞凋亡試劑盒測定細胞凋亡率。用胰酶消化細胞，用標記熒光素FITC 的Annexin V 和碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色，采用流式細胞儀測定細胞凋亡水平。

1.6 ROS水平檢測

按照方法“1.5”染毒方法對細胞染毒，陽性對照孔中加入4-丁基過氧化氫（Rosup）作為陽性對照，染毒24 h后，采用試劑盒測定細胞內(nèi)ROS 水平。

1.7 SOD2、GSH-Px 的mRNA表達檢測

按照方法“1.5”染毒方法對細胞染毒24 h后，依據(jù)試劑盒說明書進行提取總RNA和反轉(zhuǎn)錄后，分別對GAPDH、SOD2和GSH-Px進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）擴增，引物序列見表1。PCR反應條件：采用預變性95℃ 10 min，變性95℃ 45 s，退火60℃ 45 s，延伸72℃50 s，循環(huán)40次，總反應體系10 μL。

表1 引物序列列表Table 1 Primer sequences

1.8 Bcl-2、Bax和Cox3蛋白表達檢測

取對數(shù)生長期細胞，以2×106個·瓶-1密度接種于75 cm2培養(yǎng)瓶，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，加入含1、10、100 μmol·L-1的FLC 染毒24 h，用預冷的PBS 洗滌3 遍，加入RIPA 細胞裂解液，4℃下裂解30 min 后，12 000×g離心10 min，取上清液，用BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacryamide gel electropHoresis，SDS-PAGE）分離后，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，經(jīng)5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗Bcl-2、Bax 和Cox3 抗體，在4℃下孵育過夜，含0.05% Tween20 的三羥甲基氨基甲烷緩沖液（tris buffered saline with Tween 20，TBST）洗3次；室溫孵育二抗1 h，TBST 洗3 次，電化學發(fā)光法拍照，檢測相關(guān)蛋白的位置和含量。

1.9 統(tǒng)計學分析

每組試驗重復3 次，結(jié)果采用平均值±標準差表示，統(tǒng)計分析均采用SPSS 18.0 軟件進行處理，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗。差異有統(tǒng)計學意義，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細胞活性

如圖1所示，在染毒劑量為0.1 μmol·L-1時，染毒組與對照組之間BRL-3A 細胞活性差異并無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。1、10、100 μmol·L-1組細胞活性較對照組明顯下降（P＜0.05），且呈現(xiàn)隨濃度的升高而降低的趨勢。

圖1 MTT法測定FLC對BRL-3A細胞存活率的影響（n=3）Figure 1 Effect of FLC on the survival rate of BRL-3A cells by MTT assay (n=3)

2.2 ROS，GSH-Px、SOD2 的mRNA水平

細胞內(nèi)ROS 結(jié)果如圖2A 所示。陽性對照組ROS提高至（270.4±30.4）%，說明試劑盒有效。染毒濃度1 μmol·L-1時ROS 含量為對照組的（110.3±15.4）%，100 μmol·L-1時為（98.4±16.8）%，差異都不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），染毒濃度為10 μmol·L-1時ROS 含量升高至對照組的（126.2±12.4）%（P＜0.05）。與對照組相比，各染毒組中GSH-Px和SOD2的mRNA 表達量均有下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見圖2B）。

圖2 FLC染毒BLR-3A細胞中ROS 水平（A）和 GSH-Px（B）和SOD2（B）的mRNA相對表達含量（n=3）Figure 2 The levels of ROS (A) and GSH-Px (B) and SOD2 (B)mRNA in BLR-3A cells exposed to FLC (n=3)

2.3 細胞凋亡

細胞凋亡檢測結(jié)果如圖3A～3D 所示。隨染毒劑量上升，細胞死亡率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢：與對照組比較，1、10、100 μmol·L-1的FLC 染毒組細胞死亡率分別升高至（1.6±0.2）、（2.7±0.1）和（4.7±0.3）倍；細胞凋亡率（早期凋亡及晚期凋亡之和）也上升（圖3E）：與對照組比較，染毒組分別升高至（2.3±0.2）、（2.2±0.1）和（12.5±0.8）倍，與細胞活性MTT結(jié)果趨勢一致。

圖3 FLC染毒對BRL-3A細胞凋亡水平流式細胞圖像Figure 3 Effect of FLC on apoptosis of BRL-3A cells by flow cytometry

2.4 Bcl-2、Bax 和Cox3蛋白表達水平

蛋白含量檢測結(jié)果如圖4所示。與對照組相比，10、100 μmol·L-1暴露組促凋亡蛋白Bax的蛋白表達增高至（1.2±0.1）和（1.4±0.1）倍（P＜0.001），Bcl-2 的蛋白表達降低至（41.6±4.0）%和（41.9±3.2）%（P＜0.001），Bcl-2/Bax 值降低至（35.2±4.0）%和（30.9±3.1）%（P＜0.001）。Cox3 表達在10、100 μmol·L-1染毒濃度時下調(diào)至（84.1±8.0）%和（54.2±4.2）%。

圖4 FLC染毒BLR-3A細胞中Cox3、Bcl-2和Bax相對蛋白表達Figure 4 Relative expression of Cox3,Bcl-2,and Bax proteins in BRL-3A cells exposed to FLC

3 討論

肝臟是人體代謝毒性化合物的重要器官，肝細胞凋亡和氧化應激上升是肝細胞損傷的重要表現(xiàn)。線粒體功能調(diào)節(jié)細胞凋亡，機制是當線粒體不能產(chǎn)生足夠的ATP 而導致細胞功能衰退和死亡，而ROS引發(fā)的氧化應激是引起肝損傷的生理基礎。體外研究也發(fā)現(xiàn)FLC 可使睪丸支持-生精細胞共培養(yǎng)體系中的過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、總谷胱甘肽過氧化物酶活性降低和凋亡線粒體通路中Bax、Cyt-c、Caspase-9和Caspase-3的mRNA 表達升高［4-5］，本研究對大鼠肝細胞進行FLC 染毒，考察了氧化應激和細胞凋亡通路相關(guān)指標的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)LC 可抑制細胞活性，促進細胞凋亡，且呈現(xiàn)劑量依賴性。其中高劑量100 μmol·L-1FLC 暴露可以促進肝細胞凋亡，降低Bcl-2/Bax 的表達比例，降低SOD2和GSH-Px的mRNA 表達。

在通常情況下，少量的ROS 能在機體中發(fā)揮生理功能，但在毒性化合物暴露時，大量產(chǎn)生的ROS 會促使細胞凋亡。Bcl-2 蛋白可以抑制由毒物暴露引起的細胞凋亡，甚至死亡，增強細胞對DNA 損傷因子的抵抗性，Bcl-2基因的表達越高證明細胞對毒物的抵抗性越強。而Bax基因是最主要的凋亡基因，能拮抗Bcl-2基因的保護效果，促使細胞凋亡。Bcl-2與Bax兩基因之間的比例關(guān)系決定了細胞凋亡的狀態(tài)，Bcl-2/Bax 值越高，抑制細胞凋亡作用越強。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LC 染毒后，BLR-3A 細胞Bax 表達增加而Bcl-2 表達被抑制，說明FLC確實能夠?qū)е赂渭毎蛲觥?/p>

ROS 異常增高使體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，導致中性粒細胞炎性浸潤，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，從而導致組織損傷。SOD 催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，在機體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用。SOD2 主要存在于線粒體基質(zhì)中，其表達以及活性的降低將導致對線粒體內(nèi)產(chǎn)生的超氧離子的清除作用降低，從而導致線粒體DNA的過氧化損傷。GSH-Px 是一種重要的過氧化物分解酶，催化GSH變?yōu)檠趸凸入赘孰?，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，保護細胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)FLC 染毒后，BLR-3A細胞中ROS 含量升高，SOD2、GSH-PxmRNA 表達降低，表明FLC 能夠促進肝細胞的氧化應激狀態(tài)，引起肝損傷。Cox-3 是一種新型Cox 亞型結(jié)構(gòu)，具有環(huán)氧合酶和過氧化物酶兩種活性，具有抗炎作用，可降低ROS 引起的炎癥浸潤，同時參與細胞凋亡［12-13］。本試驗發(fā)現(xiàn)FLC 染毒后BLR-3A 細胞中Cox-3 水平降低，進一步證實了FLC可引起細胞炎癥損傷。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)在100 μmol·L-1的FLC 劑量暴露時，大鼠肝細胞的細胞活性降低，細胞死亡率和凋亡率升高，氧化應激水平升高，表明FLC 對肝細胞具有確切的毒性作用，而毒性機制可能是通過引起肝細胞的氧化損傷，進一步促進細胞凋亡和死亡。