時明陽，胡倩，畢頂念，汪紅玲，張愛華，胡勇

貴州醫(yī)科大學 a.公共衛(wèi)生學院 b.環(huán)境污染與疾病監(jiān)控重點實驗室，貴州 貴陽 550025

地方性砷中毒，簡稱地砷病，是一種以多系統、多臟器損傷為主要特點的慢性砷中毒；除典型的皮膚損害以外，突出特點是肝損害嚴重。該病發(fā)病機制不清，已成為制約其有效防控的難點［1-2］。目前，砷誘導氧化應激學說得到廣泛認可，但機制尚未明確。深入研究其機制可以更好地了解砷引起多系統、多臟器損害的原因，為地砷病的針對性防治提供科學依據［3］。

超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1）是人體內的一種重要抗氧化酶。本課題組前期發(fā)現，砷可致人和大鼠SOD1 mRNA 轉錄水平增高，但其蛋白表達水平卻下降，這提示可能存在某種轉錄后調節(jié)機制抑制SOD1 的翻譯［4-5］。

微小核糖核酸（miRNA）是一類內源性非蛋白質編碼的RNA 分子，一般含有22 個核苷酸，能夠參與細胞的基因表達調控。Dicer1 能夠對miRNA 前體進行剪切，形成成熟的miRNA［6］。成熟的miRNA 是RNA 沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）的重要組成部分，RISC 能通過堿基互補配對的方式與靶mRNA 3’非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）結合，引起mRNA降解或翻譯抑制，導致蛋白表達水平下降。miR-155 是一種常見的miRNA，由B 細胞淋巴瘤的逆轉錄病毒被啟動子插入在整合位點后，激活其轉錄過程形成，又稱B 細胞融合群集。

本課題組前期研究發(fā)現，miR-155 在燃煤型砷中毒人群血漿中高表達［7］。應用生物信息學工具Tarbase及網站microRNA.org 分析均發(fā)現，miR-155 可與人SOD1-3’UTR 序列結合。為了解miR-155、Dicer1、SOD1在砷致肝損傷中的作用，本研究建立不同濃度亞砷酸鈉致大鼠肝損傷模型；通過檢測肝砷含量、肝組織病理、氧化應激相關指標及Dicer1、miR-155 和SOD1 的基因及蛋白表達情況，為進一步揭示砷致肝氧化應激損傷的機制提供科學依據。

1 對象與方法

1.1 主要儀器試劑

電感耦合等離子體質譜儀（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）NexION 2000（美國Thermo），AU400 全自動生化分析儀、光學顯微鏡（日本OlymPus），MQX200 酶標儀（美國Bio-Tek），亞砷酸鈉（美國Sigma），TB Green? Premix Ex Taq II（日本Takara），兔抗Dicer1、SOD1（英國Abcam），辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗、二氨基聯苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）顯色劑（中國Servicebio），谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、SOD1、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（中國南京建成生物研究所）。

1.2 實驗動物分組及處理

購買SPF 級80～100 g Wistar 大鼠24 只［遼寧長生生物技術股份有限公司，合格證號為SCXK（遼）2015-0001］，雌雄各半，飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學實驗動物中心清潔級動物房，光照與黑暗各12 h 交替，控制室溫為（25±3）℃，濕度為45%～65%。本實驗經貴州醫(yī)科大學實驗動物中心倫理委員會批準，審批編號為1900250。經預實驗測定大鼠經口亞砷酸鈉半數致死量為45 mg·kg-1，根據亞砷酸鈉半數致死量的1/4、1/8、1/16 確定大鼠染毒質量濃度（后稱濃度）依次為100、50、25 mg·L-1。大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，按體重Z 字形隨機分為對照、低/中/高濃度組4 組，每組6 只，雌雄各半，分別自由飲用濃度為0、25、50、100 mg·L-1亞砷酸鈉水溶液。24 周后，大鼠禁食24 h，采用0.9%戊巴比妥鈉麻醉，心尖取乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝血2 mL后處死，用于轉錄表達檢測；取肝最大葉中間部分置于4%多聚甲醛中固定，用于病理HE染色與免疫組化，其余肝臟-80℃保存，用于酶活性檢測。

1.3 一般情況

大鼠飼喂期間記錄毛發(fā)光澤度、活動度，每周同一時間稱量各組動物體重并記錄。

1.4 肝砷含量檢測

取0.3 g大鼠肝臟加入5 mL硝酸與2 mL過氧化氫，浸泡2 h 后進行微波消解。第一步：1 200 W，120℃，6 min；第二步：1 200 W，180℃，10 min；第三步：1 200 W，190℃，15 min。趕酸至0.5 mL，定容至10 mL后稀釋待測。采用ICP-MS 檢測肝砷含量，該方法的精密度為1.3%，回收率為95.3%～107.1%。

1.5 肝組織病理改變檢測

解剖過程中肉眼觀察大鼠肝臟表面質地變化，取肝臟最大葉中間部分置于4%多聚甲醛固定，依次進行脫水、石蠟包埋、HE染色及鏡檢。

1.6 肝組織氧化損傷指標檢測

取肝組織，用冰預冷生理鹽水1：9 稀釋勻漿后，采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD1 活力，二巰雙硝基苯甲酸還原法檢測GSH-Px 活性，硫代巴比妥酸比色法檢測MDA含量。

1.7 大鼠肝組織miR-155、Dicer1 及SOD1轉錄水平檢測

采用實時熒光定量PCR 檢測3 項指標的轉錄情況，Trizol 法提取肝組織總RNA，逆轉錄為cDNA后，-20℃保存。miR-155 引物：正向5’-CGGCGGTTTAA TGCTAATCGTGAT-3’，反向5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3’；內參U6引物：正向5’-CGGCGGTCGTGAAGCGTTCCAT-3’，反向3’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA T-5’；Dicer1 引物：正向5’-TCTTCTTTCTCCTCATCCTCC-3’，反向5’-TCCCCATA TTGATGGACATGGAAC-3’；SOD1 引物：正向5’-AGCA GAAGGCAAGCGGTGAAC-3’，反向5’-TCCCCATATTGATG GACATGGAAC-3’ ；內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物：正向5’-GGCACAGTCAAGGCTGAGA ATG -3’，反向5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’。反應條件：95℃ 預變性30 s，95℃變性15s，60℃退火1 min，72℃延伸15 s，共40 個循環(huán)。結果以Ct值為統計參數，計算 2-ΔΔCt后進行統計分析。

1.8 肝組織免疫組化

肝組織置于常規(guī)4%多聚甲醛固定后脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、抗原修復和阻斷內源性過氧化物酶后分別加一抗，體積比分別為1：200（Dicer1）、1：100（SOD1），4 ℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗3 次，每次5 min；分別加山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗，體積比為1：200，室溫孵育30 min 后，PBS 沖洗3 次，每次5 min；DAB顯色，自來水沖洗終止染色；蘇木素復染細胞核，脫水封片，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用Image Pro Plus 圖像處理系統觀察Dicer1、SOD1 表達情況。陽性表達呈棕黃色，200 倍光鏡下采集免疫組化圖像，每張切片隨機采3個不重疊視野，計算平均光密度值。

1.9 統計學分析

數據以均數±標準差表示，使用SPSS 23.0 軟件進行統計分析。數據首先進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布時多組間比較使用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，指標間相關性分析采用Pearson 相關分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 一般情況

實驗期間，對照組大鼠毛發(fā)光澤，活動正常，生長發(fā)育良好，能夠正常飲水和進食；各染砷組大鼠活動度下降，毛色暗淡，毛發(fā)質地粗糙，尤以高濃度組明顯，甚至出現個別大鼠躁狂異常。

2.2 體重

染毒6、12、18、24 周后，各組間大鼠體重差異均存在統計學意義（F=3.59、4.04、3.89、4.63，均P＜0.05）。與對照組比較，染毒6、12、18、24 周后，中、高濃度組大鼠體重均下降（P＜0.05）；與低濃度組比較，染毒12、18、24 周后，高濃度組大鼠體重均下降（P＜0.05）。結果見圖1。

圖1 亞砷酸鈉染毒后大鼠體重變化（n=6）Figure 1 The changes in body weight of rats following sodium arsenite treatment (n=6)

2.3 肝砷含量

對照及低、中、高濃度染毒組大鼠肝砷含量分別為（0.10±0.02）、（1.35±0.08）、（1.91±0.20）、（2.28±0.09）μg·g-1。各組間大鼠肝砷含量差異具有統計學意義（F=333.38，P＜0.05）。與對照組相比，各染砷組肝砷含量均升高（P＜0.05）；與低濃度組相比，中、高濃度組肝砷含量均升高（P＜0.05）；與中濃度組相比，高濃度組肝砷含量也升高（P＜0.05）。

2.4 HE染色結果

HE 染色結果可見：對照組肝組織小葉結構完整，肝索結構清晰，肝細胞排列規(guī)則，胞質豐富，形態(tài)正常，未見明顯異常；隨著染砷濃度增加，肝細胞變性、壞死增多，細胞空泡明顯，匯管區(qū)淋巴細胞浸潤加重，中、高濃度組肝組織可見明顯的炎性壞死小灶。結果見圖2。

圖2 亞砷酸鈉染毒24 周后大鼠肝組織病理改變（HE染色）Figure 2 The pathology changes in liver tissues of rats following sodium arsenite treatment (HE staining)

2.5 肝勻漿氧化應激指標

各組間SOD1、GSH-Px 酶活性，MDA 含量差異均具有統計學意義（F=21.43、5.17、8.54，均P＜0.05）。與對照組比較，各染砷組SOD1 酶活性均下降，高濃度組GSH-Px 酶活性下降，中、高濃度組MDA 含量均升高（均P＜0.05）。與低濃度組比較，高濃度組SOD1、GSH-Px 酶活性均下降，MDA 含量升高（均P＜0.05）；與中濃度組比較，高濃度組SOD1 酶活性下降，MDA含量升高（均P＜0.05）。結果見表1。

表1 亞砷酸鈉染毒24周后大鼠肝勻漿SOD、GSH-Px酶活性及MDA含量變化（±s，n=6）Table 1 The changes in SOD and GSH-Px enzyme activities and MDA contents in liver homogenate of rats following sodium arsenite treatment (±s,n=6)

表1 亞砷酸鈉染毒24周后大鼠肝勻漿SOD、GSH-Px酶活性及MDA含量變化（±s，n=6）Table 1 The changes in SOD and GSH-Px enzyme activities and MDA contents in liver homogenate of rats following sodium arsenite treatment (±s,n=6)

［注］a：與對照組比較，P＜0.05；b：與低濃度組比較，P＜0.05；c：與中濃度組比較，P＜0.05。

組別 SOD1/（U·mg-1） GSH-Px/（U·mg-1） MDA/（nmol·mg-1）對照組 296.53±11.42 357.49±28.92 0.48±0.05低濃度組（25 mg·L-1） 277.51±9.64a 326.85±41.67 0.51±0.05中濃度組（50 mg·L-1） 266.53±15.39a 304.69±44.70 0.56±0.05a高濃度組（100 mg·L-1） 238.40±9.52abc 250.32±57.70ab 0.64±0.06abc F 21.43 5.17 8.54 P＜0.05＜0.05＜0.05

2.6 肝組織Dicer1、miR-155 及SOD1 mRNA 轉錄水平

各組間大鼠肝組織Dicer1、miR-155及SOD1 mRNA轉錄水平差異均有統計學意義（F=5.26、7.75、10.01，均P＜0.05）。與對照組相比，高濃度組肝組織Dicer1 mRNA轉錄水平升高（均P＜0.05）；中、高濃度組肝組織miR-155、SOD1 mRNA轉錄水平均升高（均P＜0.05）。與低濃度組相比，高濃度組肝組織Dicer1 mRNA轉錄水平升高（均P＜0.05）；高濃度組肝組織miR-155轉錄水平升高（均P＜0.05）；中、高濃度組肝組織SOD1 mRNA 轉錄水平升高（均P＜0.05）。與中濃度組相比，高濃度組肝組織Dicer1 mRNA 轉錄水平升高（均P＜0.05）。結果見圖3。

圖3 亞砷酸鈉染毒24周后大鼠肝組織miR-155、Dicer1及SOD1 轉錄表達（n=6）Figure 3 The transcriptional expressions of miR-155,Dicer1,and SOD1 in liver tissues of rats following sodium arsenite treatment (n=6)

2.7 肝組織免疫組化結果

亞砷酸鈉染毒后，各組免疫組化結果見圖4。各組間大鼠肝組織Dicer1 及SOD1 蛋白表達差異均有統計學意義（F=17.75、F=38.10，均P＜0.05）。與對照組相比，各染砷組肝組織Dicer1 蛋白表達均增高，SOD1蛋白表達均下降（均P＜0.05）；與低濃度組相比，高濃度組Dicer1 蛋白表達升高，中、高濃度組肝組織SOD1蛋白表達均下降（均P＜0.05）；與中濃度組相比，高濃度組Dicer1、SOD1 蛋白表達下降（均P＜0.05）。結果見圖5。

圖4 亞砷酸鈉染毒24周后大鼠肝組織免疫組化結果Figure 4 The immunohistochemical results of rat liver tissues following sodium arsenite treatment

圖5 亞砷酸鈉染毒24周后各組大鼠肝組織Dicer1、SOD1平均光密度值（n=6）Figure 5 The average optical density of Dicer1 and SOD1 in livertissues of rats following sodium arsenite treatment for 24 weeks (n=6)

2.8 Pearson 相關性分析

亞砷酸鈉染毒24 周后，大鼠肝組織miR-155 與Dicer1 蛋白表達水平呈正相關（r=0.670，P＜0.05），與SOD1 蛋白表達水平呈負相關（r=-0.604，P＜0.05）。

3 討論

肝臟是砷損害的主要靶器官，砷中毒肝損傷發(fā)病率和死亡率較高，病情較嚴重［8］。砷毒作用復雜，致病機制不清，已成為地砷病防控工作的瓶頸和亟待解決的關鍵問題［9-10］。本研究發(fā)現，亞砷酸鈉染毒大鼠，肝組織miR-155、Dicer1、SOD1 的基因表達均升高，肝組織Dicer1蛋白表達升高，SOD1蛋白表達下降。

本研究利用亞砷酸鈉建立飲水型砷中毒大鼠肝損傷模型。結果顯示，各染砷組大鼠出現活動度下降、毛發(fā)暗淡、飲水和攝食量明顯減少等中毒癥狀；隨染毒濃度增加，大鼠體重增長緩慢，肝砷含量增加，且存在明顯的劑量-效應關系。該結果提示，砷已對大鼠產生毒性作用和肝臟蓄積效應。進一步病理學檢查發(fā)現，各染砷組大鼠出現不同程度的病理學改變。上述結果表明，飲水型砷中毒大鼠肝損傷模型構建成功。

SOD1、GSH-Px 是兩種重要的超氧自由基清除劑，MDA 是脂質過氧化終產物，它們的水平可反映機體氧化應激水平［11］。結果發(fā)現，隨著染砷濃度增加，大鼠肝勻漿SOD1、GSH-Px 活性均下降，而MDA 含量均上升。該結果提示，砷誘導了氧化應激，機體內產生的過氧化產物不能被及時清除而大量堆積，可能造成肝臟損傷。為進一步探討砷誘導氧化應激與肝損傷的機制，本研究檢測了SOD1 基因表達。結果發(fā)現，隨著染砷濃度增加，SOD1 mRNA 表達逐漸增加而其蛋白表達逐漸下降；與課題組前期研究結果一致［4-5］。這提示，可能存在某種轉錄后調控機制，抑制了SOD1蛋白表達。

mRNA 3’UTR 在基因表達調控上起重要作用［12］。成熟的miRNA 是形成RISC 的最重要的組成成分，該RISC 復合體能通過堿基互補配對的方式與靶mRNA 3’UTR 結合［13］。當兩者互補配對程度高時，RISC 會發(fā)揮作用導致靶mRNA 降解或翻譯抑制［14］。在本研究中，隨著亞砷酸鈉染毒濃度增加，大鼠肝組織miR-155表達量均逐漸上升；提示亞砷酸鈉能夠促進miR-155表達。相關性分析顯示，大鼠肝組織miR-155 水平與SOD1 蛋白表達水平呈負相關，結合生物信息學工具的發(fā)現，推測miR-155 可與人SOD1-3’UTR 序列結合。高表達的miR-155 可能通過與SOD1 3’UTR 結合，抑制SOD1 翻譯，導致SOD1 蛋白表達減少。

Dicer1能夠剪切miRNA前體，形成成熟的miRNA［15］。miR-155 是一種常見的miRNA，提示Dicer1 可能通過剪切miR-155 前體，生成成熟的miR-155。本研究發(fā)現，Dicer1 的轉錄和蛋白表達均隨亞砷酸鈉染毒濃度的增加而增加；相關性分析也發(fā)現，大鼠肝組織miR-155 水平與Dicer1 蛋白表達水平存在明顯的正相關關系。該結果提示，砷引起Dicer1 表達增加，高表達的Dicer1 可能增加對miR-155 前體的剪切，導致成熟miR-155增多而調控下游靶基因的表達。

綜上，本研究發(fā)現：砷誘導Dicer1 基因及蛋白表達增加，可能促進miR-155 高表達后與SOD1 3’UTR 區(qū)結合，抑制SOD1 翻譯，導致SOD1 蛋白表達和酶活性下降，進而造成肝臟損傷。本研究為進一步揭示砷致肝損傷的機制及尋找新的藥物靶點提供了科學依據，但本實驗不能確切說明miR-155對SOD1的靶向作用，還需進一步通過miR-155的高低表達實驗驗證miR-155和SOD1 3’UTR指標間的相互關系。