汪 敏，趙紹杰，盧 斌，肖建平，趙 麗

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫婦幼保健院婦產(chǎn)科，無錫 214000)

先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)是最常見的出生缺陷之一，約占各種先天性疾病的1/3，在新生兒中的發(fā)病率約為(8～9)/1000，全世界每年約有135萬例CHD新生兒出生[1]。染色體異常、單基因紊亂、環(huán)境致畸、孕產(chǎn)婦暴露和宮內(nèi)感染都被認(rèn)為是潛在的原因[2-4]。在產(chǎn)前診斷為CHD的胎兒中，染色體異常約占30%[5]。隨著超聲技術(shù)和外科手術(shù)的發(fā)展，大多數(shù)CHD在產(chǎn)前可被識別，大多數(shù)類型的CHD在修補(bǔ)術(shù)后能恢復(fù)正常或接近正常的心功能。合并染色體異常時，CHD胎兒的預(yù)后因嚴(yán)重的心外結(jié)構(gòu)異常和(或)產(chǎn)后神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙而不盡人意。因此，推薦對患有CHD的胎兒進(jìn)行產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷。過去幾十年，G顯帶核型分析和熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)是臨床中CHD胎兒用來檢測染色體異常的主要方法。然而G顯帶核型分析受限于耗時和分辨率低，而FISH受限于整個基因組的有限覆蓋范圍。染色體微陣列分析技術(shù)(chromosome microarray analysis，CMA)在整個基因水平上能同時檢測染色體數(shù)目異常和微觀的染色體不平衡，已被用于識別產(chǎn)前和產(chǎn)后CHD病例的染色體異常。單核苷酸多態(tài)性微陣列技術(shù)(single nucleotide polymorphism array，SNP array)是其中的一種檢測技術(shù)。本研究旨在探討SNP技術(shù)在檢測胎兒CHD染色體異常的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 資料來源 收集2016年1月至2020年3月因產(chǎn)前檢查存在高危因素在南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心就診，行超聲心動圖提示CHD并接受侵入性產(chǎn)前診斷的100例胎兒的臨床資料。所有胎兒標(biāo)本均采用羊膜腔穿刺術(shù)采集，標(biāo)本送至北京貝康醫(yī)學(xué)檢驗所，采用SNP技術(shù)行CMA檢測。納入標(biāo)準(zhǔn)：產(chǎn)前檢查存在以下1項或1項以上高危因素：唐氏篩查高風(fēng)險或臨界風(fēng)險、早孕B超提示NT增厚(>2.5mm)或鼻骨缺失、孕婦高齡(>35歲)、既往畸形兒分娩史等。排除標(biāo)準(zhǔn)：雙胎妊娠、無上述高危因素的單胎妊娠。由經(jīng)驗豐富的臨床遺傳醫(yī)生對CMA的優(yōu)點和潛在風(fēng)險進(jìn)行了預(yù)先遺傳咨詢，包括臨床意義未明和成年發(fā)病的可能性。所有胎兒父母均簽署知情同意書。孕婦的平均年齡(30.5±4.7)歲，平均診斷CHD孕周(23.4±2.5)周。100例CHD胎兒中，單純CHD 22例，CHD合并超聲軟標(biāo)記26例，CHD合并心外結(jié)構(gòu)畸形52例。采用Botto等[7]描述的方法對CHD進(jìn)行分類。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 用QIAamp DNA mini試劑盒(Qiagen,Hilden,Germany)從10ml羊水樣本中提取基因組DNA。

1.2.2 CMA檢測和結(jié)果判讀 使用Affy-metrix公司的CytoScan 750k芯片和擴(kuò)增、雜交試劑盒(illumina)，參照Infinium HD Assay標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行擴(kuò)增、雜交、掃描和分析。結(jié)果判讀參照DGV、ISCA、OMIM、ECIPHER等數(shù)據(jù)庫，判讀檢出的CNV性質(zhì)，分為已知致病、疑似致病、臨床意義未明、疑似良性、良性5類。對致病性CNV進(jìn)行熒光定量PCR驗證。對臨床意義未明CNV胎兒的父母外周血行CMA檢測，判斷胎兒CNV是遺傳父母或新發(fā)，以判斷CNV的性質(zhì)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件,計數(shù)資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CHD胎兒染色體異常及CNV結(jié)果 100例CHD胎兒中，檢出CMA異常70例(70.0%)，其中染色體數(shù)目異常56例(56.0%)，致病性CNV 14例(14.0%)，臨床意義未明CNV 3例(3.0%)。56例染色體數(shù)目異常中，21三體23例，18三體28例，13三體3例，45，XO 2例。14例致病性CNV中，22q11.2微缺失綜合征6例，其他已知致病綜合征5例，另3例病例中發(fā)現(xiàn)與心臟有關(guān)的致病基因：1例為右室雙出口、主動脈縮窄、左心發(fā)育不良，在染色體14q11.2區(qū)域存在1.8Mb微缺失，包含基因PRKD1和NKX2-6(病例2)，1例房間隔缺損、右室雙出口、肺動脈狹窄，在染色體16p13.3區(qū)域存在0.3Mb微重復(fù)，包含AXIN1基因(病例11)，1例永存動脈干、室間隔缺損，在染色體8p23.3區(qū)域存在0.2Mb微缺失，此缺失包含MYOM2基因(病例16)。臨床意義未明CNV 3例，對其父母的外周血進(jìn)行CMA檢測，臨床意義仍無法明確。見表1。

表1 17例CHD胎兒的CNV結(jié)果

2.2 不同CHD的亞型分類及染色體異常結(jié)果 100例CHD胎兒中，間隔缺損最常見，有43例(43.0%)，其次是圓錐動脈干畸形(conotruncal defects，CTD)，有32例(32.0%)。間隔缺損、房室間隔缺損、CTD的致病性染色體異常檢出率分別為81.4%、80.0%和75.0%。致病性CNV檢出率占前三位的是：CTD(34.3%)、左、右室流出道梗阻(20.8%)和間隔缺損(14.0%)，各組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。流出道異常致病性CNV檢出率是28.6%(16/56)。CTD致病性染色體異常檢出率75.0%，其中染色體數(shù)目異常40.6%，致病性CNV 34.3%。22q11.2微缺失均為圓錐動脈干畸形，包括4例法洛四聯(lián)癥，1例右室雙出口、右位主動脈弓，1例室間隔缺損伴肺動脈閉鎖。見表2和表3。

表2 不同CHD亞群致病性染色體異常檢出率[n(%)]

表3 不同CHD亞型致病性染色體異常情況

2.3 單純CHD、CHD合并軟標(biāo)記、CHD合并心外結(jié)構(gòu)畸形的致病性染色體異常結(jié)果 100例CHD胎兒中，單純CHD、CHD合并軟標(biāo)記、CHD合并心外結(jié)構(gòu)畸形的致病性染色體異常率分別為31.8%、76.9%、82.7%。伴有軟標(biāo)記的致病性染色體異常率明顯高于單純CHD組(P<0.05),伴有心外結(jié)構(gòu)畸形的致病性染色體異常率明顯高于單純CHD組(P<0.05)，CHD合并軟標(biāo)記和合并心外結(jié)構(gòu)畸形的致病性染色體異常率無明顯差異。單純CHD、CHD合并軟標(biāo)記、CHD合并心外結(jié)構(gòu)畸形的致病性CNV檢出率分別為9.1%、19.2%、13.5%。統(tǒng)計分析顯示，致病性CNV在這些組間均無顯著差異。見表4。

表4 不同組間CHD致病性染色體異常結(jié)果

2.4 CHD合并單個與多個心外結(jié)構(gòu)畸形的染色體異常結(jié)果 52例合并心外結(jié)構(gòu)畸形的胎兒中，單個結(jié)構(gòu)畸形18例，多個結(jié)構(gòu)畸形34例，伴有多個結(jié)構(gòu)畸形的CHD組致病性染色體異常檢出率(30/34，88.2%)與伴有單個結(jié)構(gòu)畸形的CHD組(15/18,83.3%)比較，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

CHD是最常見的出生缺陷，各種治療措施的改進(jìn)降低了病死率，但是CHD仍是嬰幼兒死亡的主要原因之一。目前研究認(rèn)為，CHD除與染色體非整倍體有關(guān)外，還與染色體拷貝數(shù)變異有關(guān)，尤其是DiGeorge綜合征TBXl基因的單倍劑量不足引起心臟發(fā)育異常，William綜合征ELN基因缺失引起主動脈發(fā)育不良、主動脈瓣狹窄等。CMA不僅可檢測出21三體、18三體、13三體等非整倍體，還可檢測出與CHD相關(guān)的22q11.2微缺失/重復(fù)綜合征、1p36微缺失綜合征和1q21微缺失/重復(fù)綜合征等致病性CNV，額外診斷15%～20%的染色體異常胎兒[6]。

本研究100例CHD胎兒中，致病性染色體異常檢出率70.0%，56.0%為染色體數(shù)目異常，致病性CNV和臨床意義未明CNV的檢出率分別為14.0%和3.0%。一項CHD胎兒的系統(tǒng)綜述提示CMA檢測在染色體核型基礎(chǔ)上增加的陽性率是12.0%[7]。Wang等[8]對602例CHD胎兒的研究發(fā)現(xiàn)，125例(20.8%)檢出致病性染色體異常，其中65例(10.8%)為染色體非整倍體，20例(3.3%)為染色體結(jié)構(gòu)異常,40例(6.6%)為致病性CNV。Luo等[9]研究發(fā)現(xiàn)，362例CHD胎兒中，140例(38.7%)檢出染色體異常，其中111例(79.3%)為非整倍體，10例為染色體結(jié)構(gòu)異常，19例(5.2%)為致病性或可能致病性CNV。與上述研究相比，本研究中致病性染色體異常檢出率和致病性CNV檢出率偏高，可能與本研究病例均來自于產(chǎn)前有高危因素的孕婦，且均為引產(chǎn)病例(心臟畸形較嚴(yán)重或合并心外畸形)，上述因素導(dǎo)致染色體非整倍體異常升高，此外還可能與樣本量較小有關(guān)，由于CMA檢測費用較高，部分孕婦拒絕行CMA檢測，導(dǎo)致樣本量較小，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量。

CHD亞組中，間隔缺損(81.4%)、房室間隔缺損(AVSD)(80.0%)、圓錐動脈干畸形(75.0%)具有較高的致病性染色體異常檢出率;房室間隔缺損病例中并未檢出致病性CNV，致病性CNV在圓錐動脈干畸形、左右室流出道梗阻和間隔缺損中檢出率分別是34.3%、20.8%、14.0%，心臟流出道異常致病性CNV檢出率是28.6%。文獻(xiàn)報道，在各種類型的CHD中，流出道異常與致病性CNV關(guān)系最為密切，單純的心臟流出道異常胎兒致病性CNV的檢出率可達(dá)30.0%[10]。本研究與文獻(xiàn)報道一致。Wang等[8]研究中，AVSD胎兒(73.7%)、CTD胎兒(25.7%)的致病性染色體異常檢出率較高。在AVSD胎兒中未檢出致病性CNV，致病性CNV在CTD胎兒中增加的陽性率為16.9%。本研究AVSD胎兒致病性染色體異常檢出率與文獻(xiàn)報道接近，且AVSD胎兒亦未檢出致病性CNV，但CTD胎兒的致病性染色體異常和致病性CNV檢出率較文獻(xiàn)報道偏高，可能與本研究所有病例均來自引產(chǎn)病例及樣本量較小有關(guān)。

CTD是一類流出道異常的復(fù)雜型心臟畸形，占CHD的20%～30%[11]，包括法洛四聯(lián)癥、大動脈轉(zhuǎn)位、右室雙出口、永存動脈干、主動脈離斷以及伴有室間隔缺損的肺動脈狹窄或閉鎖等。研究表明，CTD與染色體非整倍體及22q11.2微缺失等拷貝數(shù)變異有關(guān)。本研究中，CTD致病性染色體異常檢出率75.0%，其中染色體數(shù)目異常40.6%，致病性CNV 34.3%。文獻(xiàn)報道，107例CTD胎兒中,染色體非整倍體7例(6.5%)，致病性CNV 15例(14.0%)[12]，本研究與既往研究不符，可能與本研究所有病例均來自引產(chǎn)病例有關(guān)，也可能與檢測方法、探針大小不同等有關(guān)。文獻(xiàn)報道，22q11.2微缺失中CTD發(fā)生率最高，以法洛四聯(lián)癥最多見[13]。本研究22q11.2微缺失6例，包括4例法洛四聯(lián)癥，1例右室雙出口、右位主動脈弓，1例室間隔缺損伴肺動脈閉鎖。本研究22q11.2微缺失綜合征均為CTD，且法洛四聯(lián)癥最多，與文獻(xiàn)報道相符。本研究中，CTD胎兒檢出22q11.2微缺失綜合征(18.9%,6/32)，比例高于文獻(xiàn)報道的10%[12]。本研究中，有3例病例中發(fā)現(xiàn)與心臟有關(guān)的致病基因：1例為右室雙出口、主動脈縮窄、左心發(fā)育不良，在染色體14q11.2區(qū)域存在1.8Mb微缺失，此缺失存在基因NKX2-6和PRKD1(病例2)，NKX2-6是TBX1信號通路的下游基因，其在圓錐動脈干形成過程中起重要作用[14]。PRKD1基因是另一與圓錐動脈干異常有關(guān)的單基因，其作用機(jī)制是通過調(diào)節(jié)基因MEF2而發(fā)生重要作用[15]。1例房間隔缺損、右室雙出口、肺動脈狹窄，在染色體16p13.3區(qū)域存在0.3Mb微重復(fù)(病例11)，包含AXIN1基因，1例永存動脈干、室間隔缺損，在染色體8p23.3區(qū)域存在0.2Mb微缺失(病例16)，此缺失包含MYOM2基因，AXIN1、MYOM2基因均與心臟異常有關(guān)。

眾所周知，超聲軟標(biāo)記與胎兒非整倍體形成的風(fēng)險增加有關(guān)。文獻(xiàn)報道，超聲軟標(biāo)記與致病性CNV有關(guān)[16-18]。本研究中，伴有軟標(biāo)記的CHD胎兒染色體非整倍體檢出率是57.7%，致病性CNV檢出率是19.2%，且伴有軟標(biāo)記的致病性染色體異常檢出率明顯高于單純CHD組(P<0.05)。文獻(xiàn)報道[19]，CHD合并其他結(jié)構(gòu)異常時，染色體異常的發(fā)生率更高。本研究中，伴有心外結(jié)構(gòu)畸形組致病性染色體異常檢出率明顯高于單純CHD組(P<0.05)，與文獻(xiàn)報道一致。

綜上所述，CMA在存在高危因素的CHD胎兒中，致病性染色體異常檢出率是70.0%，致病性CNV檢出率是14.0%，進(jìn)一步證實CHD與染色體微缺失或微重復(fù)有關(guān)。因此，本研究推薦CMA技術(shù)應(yīng)作為產(chǎn)前診斷CHD胎兒的一級檢測方法，有利于發(fā)現(xiàn)CHD相關(guān)的致病基因，有利于產(chǎn)前咨詢中正確評估胎兒的預(yù)后，為孕婦是否繼續(xù)妊娠提供更客觀的理論依據(jù)。