利用剩余活性污泥制備洗滌用酶制劑的研究

陳夢濤， 王俊華， 張子明， 范曉敏， 倪 賀， 李海航*

(1. 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院∥廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，廣州 510631；2. 深圳盛世集團，深圳 518112； 3. 廣州科藤生物醫(yī)藥科技有限公司,廣州 510425)

隨著城市和工業(yè)化的發(fā)展，我國剩余活性污泥產(chǎn)量以每年約10%速度增加，預(yù)計到2020年濕污泥年產(chǎn)量將達(dá)到6 000～8 000萬t[1-3]. 現(xiàn)有的剩余活性污泥處理方法不僅成本高，而且浪費資源，因此有必要改善污泥處理方法. 剩余活性污泥中59%～88% 的成分為有機物，富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、酶以及各種營養(yǎng)成分[4-7]. 對上述各種有機成分進(jìn)行資源化利用不僅可以減少二次污染物的量和污泥處理費用，還能產(chǎn)生良好的經(jīng)濟效益[8-9].

KARN等[10]報道了從剩余活性污泥中提取到的蛋白酶可應(yīng)用在皮革工業(yè)中對動物皮膚進(jìn)行脫毛和軟化處理. GARCA等[11]采用不同的方法增加剩余活性污泥中蛋白質(zhì)的溶解效率，并將其回收作為動物飼料添加劑使用. 李愷等[12]將表面活性劑CTAC處理活性污泥，不僅提高了活性污泥的脫水性能，同時可以溶出胞內(nèi)聚合物，有利于蛋白酶的提取.

本實驗室的前期研究表明，剩余活性污泥可用于依次提取水解酶和聚羥基脂肪酸酯，剩余殘渣制備保水緩釋有機肥[8]. 本文系統(tǒng)地研究了簡單高效地從剩余活性污泥中提取、分離和制備復(fù)合水解酶的方法和工藝，并將提取的酶研發(fā)成熱穩(wěn)定性高的洗滌用酶制劑.

目前，酶制劑的制備方法主要是微生物發(fā)酵提取，其中30%～40%的生產(chǎn)成本是培養(yǎng)基的制備，因此生產(chǎn)成本較高[13]. 本文首次將污泥中制備的復(fù)合水解酶作為洗滌用酶制劑使用，并將其研制成商品應(yīng)用價值更高的顆粒酶制劑. 剩余活性污泥中豐富的酶資源可以跨越菌種培育和發(fā)酵生產(chǎn)酶的階段，有效地縮短了工業(yè)生產(chǎn)時間，且生產(chǎn)成本大大降低，優(yōu)勢明顯.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器設(shè)備

供試剩余活性污泥采集于廣州開發(fā)區(qū)水處理集團公司所屬位于食品工業(yè)區(qū)的永和水質(zhì)凈化廠. Triton X-100、Tris、明膠、酪蛋白均為分析純，購自廣州鼎國有限公司；蛋白marker為分析純，購自Takara公司；食用級乙醇，體積分?jǐn)?shù)95%；茚三酮、Folin-酚試劑、對硝基苯酚棕櫚酸酯、3，5-二硝基水楊酸以及其它實驗常用的試劑均為分析純，購自廣州成碩化玻有限公司. 微濾膜(0.2、0.1 μm)、超濾膜(0.01 μm)、納濾膜(0.001 μm)購自廣東深圳市百德水凈水器廠.

1.2 各種酶的分析

1.2.1 酶活性的測定 采用比色法測定各種水解酶的酶活[8,14]. 分別用0.2% 明膠溶液、1% 堿性酪蛋白溶液、對硝基苯酚棕櫚酸酯、1% 可溶性淀粉和1% 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)作為膠原蛋白酶、堿性蛋白酶、脂肪酶、β-淀粉酶和纖維素酶的酶促反應(yīng)底物，測定各酶的活性. 酶活力單位定義為：在測定條件下，1mL酶液每分鐘水解底物產(chǎn)生相當(dāng)于1 μg 酶促反應(yīng)產(chǎn)物的酶的活性為1個酶活力單位(U).

1.2.2 酶活性自顯影分析 膠原蛋白酶、堿性蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的酶活性自顯影分析采用NI等[8]報道的方法.

1.3 剩余活性污泥中復(fù)合水解酶的提取

以NI等[8]的提取方法為基礎(chǔ)，分別對提取液中非離子表面活性劑Triton X-100的用量、提取固液比、提取時間和提取次數(shù)等提取條件進(jìn)行了優(yōu)化和分析. 取25 g離心脫水的剩余活性污泥，按一定固液比加入Triton X-100的水溶液，在冰浴上以 500 r/min攪拌浸提 1 h，4 ℃、5 000 r/min離心15 min，收集上清液為復(fù)合水解酶提取液. 以提取液中膠原蛋白酶的活性為指標(biāo)，對各種提取條件進(jìn)行優(yōu)化.

1.4 復(fù)合水解酶提取液的膜過濾分離和濃縮

首先用酶活性自顯影法對復(fù)合水解酶提取液中的各種酶的相對分子量大小及其活性條帶分布范圍進(jìn)行測定和分析. 根據(jù)各種水解酶的相對分子量范圍，選用各級膜孔徑的大小. 以微濾和超濾膜分離除去無活性的大分子物質(zhì)，再通過納濾膜將膜過濾液濃縮. 分別檢測各級膜過濾前后提取液中膠原蛋白酶的活性.

1.5 酶濃縮液中復(fù)合水解酶的沉淀與干燥

經(jīng)膜分離和濃縮后的酶濃縮液用乙醇沉淀法沉淀其中的復(fù)合水解酶. 在酶濃縮液中分別加入4 ℃預(yù)冷的95%乙醇和NaCl(離子強度調(diào)節(jié)劑)，調(diào)節(jié)溶液的pH值，混合均勻后于4 ℃下靜置沉淀2 h或不同時間. 離心分離，沉淀用磷酸緩沖液(pH6.8)充分溶解，以沉淀后溶解出的膠原蛋白酶活性為指標(biāo)，分別測定乙醇體積分?jǐn)?shù)(40%～80%)、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.1%～2.0%)、pH(3.0～7.0,各水解酶的等電點均小于7.0)和沉淀時間(0.5～24 h)對沉淀中可溶性酶活性的影響，篩選出乙醇沉淀的最佳條件. 酶沉淀物經(jīng)真空冷凍干燥制成粉末酶制劑.

1.6 復(fù)合水解酶提取分離和制備的放大實驗

將開發(fā)和優(yōu)化后的復(fù)合水解酶提取分離和制備工藝逐級放大到每次提取5 kg活性污泥的小試水平到50 kg級的中試水平. 對所得復(fù)合酶粉中主要酶的種類及其酶活性進(jìn)行分析.

1.7 復(fù)合水解酶的熱穩(wěn)定性測定和穩(wěn)定劑篩選

以復(fù)合水解酶中脂肪酶在55 ℃水浴處理下酶活降低50% 所需時間作為復(fù)合水解酶熱穩(wěn)定性的指標(biāo)(即t1/2)測定酶的熱穩(wěn)定性和篩選酶的穩(wěn)定劑. 向酶溶液中分別加入不同濃度的無機鹽類、糖類、醇類和氨基酸類物質(zhì)，在55 ℃水浴中處理，前30 min內(nèi)每隔5 min 取1 mL酶液，之后每隔10 min取1 mL酶液. 酶液取出后立即在冰水浴中冷卻，測定脂肪酶的酶活. 首先篩選出4種類型化合物中的各自最佳的酶穩(wěn)定劑，然后通過4個單因素水平L9(34)正交試驗，篩選出最佳的復(fù)合穩(wěn)定劑配方.

1.8 洗滌用酶顆粒制劑的制備及其在室溫下儲存穩(wěn)定性的測定

按固體總量計10%硅藻土、10%可溶性淀粉、6%復(fù)合穩(wěn)定劑、4%復(fù)合酶粉末和70%十水硫酸鈉的配方將復(fù)合水解酶粉制作成洗滌用酶顆粒制劑[15]. 測定所得酶顆粒制劑中洗滌劑常用添加酶(堿性蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶)的酶活，將顆粒酶制劑于室溫條件下儲存一段時間后，定期測定其脂肪酶活性變化.

1.9 實驗結(jié)果與統(tǒng)計分析

所有實驗均重復(fù)3次，實驗結(jié)果為3次重復(fù)的平均值，計算標(biāo)準(zhǔn)差.

2 結(jié)果與討論

2.1 剩余活性污泥中復(fù)合水解酶的提取

以膠原蛋白酶活性為指標(biāo)，研究了Triton X-100質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取固液比、提取時間和提取次數(shù)對復(fù)合水解酶提取效果的影響(圖1). 隨著Triton X-100質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，提取液中膠原蛋白酶活性增加，當(dāng)Triton X-100質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時，膠原蛋白酶活性達(dá)到最高. Triton X-100質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于1.0%時，酶活性不再增加(圖1A).

圖1 剩余活性污泥中復(fù)合水解酶提取條件的篩選

提取固液比在1∶1～1∶4內(nèi)，隨著固液比的提高，提取的酶活性增加. 當(dāng)提取固液比為1∶4時，膠原蛋白酶酶活最高. 此后，繼續(xù)提高固液比，提取的酶活性不再增加. 由于固液比越高，提取液的體積越大，后續(xù)處理的工作量和試劑用量也會成倍增加，當(dāng)提取固液比為1∶2時，膠原蛋白酶酶活與1∶4時差異不太大，故選取1∶2為最佳提取固液比(圖1B).

隨著提取時間的延長，膠原蛋白酶活性呈上升趨勢，當(dāng)提取時間達(dá)到60 min后，膠原蛋白酶活性不再增加(圖1C). 將同一污泥連續(xù)提取3次，以3次提取的膠原蛋白酶總活性為100%計算，發(fā)現(xiàn)第1次提取出了71.7%的膠原蛋白酶. 雖然多次提取能進(jìn)一步提高蛋白酶的提取率，但相應(yīng)的提取液體積也成倍增加，增加后續(xù)處理的成本. 第1次提取已經(jīng)能將大部分的復(fù)合水解酶提取出來，所以選擇提取1次(圖1D). 綜上所述，確定活性污泥中水解酶的提取條件為固液比1∶2，用含1%Triton X-100的水溶液攪拌提取60 min，提取1次.

該最佳提取條件與KARNET等[14]和NABARLATZ等[16]報道的研究結(jié)果相似.

2.2 復(fù)合水解酶的膜分離與濃縮

選用膜分離與濃縮復(fù)合水解酶提取液，濃縮的酶液用乙醇沉淀，用真空冷凍干燥酶制劑的工藝將提取的水解酶進(jìn)行分離、純化并制備成粉末酶制劑.

對復(fù)合水解酶提取液中的膠原蛋白酶、堿性蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶進(jìn)行了酶活性自顯影分析. 脂肪酶的活性條帶主要集中在66.2 kDa區(qū)域，介于50～70 kDa之間(圖2)；膠原蛋白酶的活性條帶主要分布在25.0～66.2 kDa之間；淀粉酶的活性條帶分布在35.0～45.0 kDa區(qū)域；堿性蛋白酶的活性條帶主要分布在45.0～66.2 kDa區(qū)域.

圖2 復(fù)合水解酶提取液中各酶的相對分子量分布

根據(jù)上述結(jié)果可知，本實驗篩選了分離復(fù)合水解酶的各孔徑的膜. 復(fù)合水解酶提取液經(jīng)離心處理后依次按微濾膜1(0.2 μm，截留相對分子量300 kDa)，微濾膜2(0.1 μm，截留相對分子量150 kDa)，超濾膜3(0.01 μm，截留相對分子量100 kDa)分離和過濾，截留除去相對分子量大于100 kDa的雜質(zhì). 濾液再經(jīng)納濾膜4(0.001 μm，截留相對分子量200 Da)將提取液濃縮至原體積的1/5. 濃縮完后用少量的磷酸緩沖液(pH 6.8)將納濾膜上的截留物質(zhì)沖洗下來，將洗滌液并入濃縮液. 經(jīng)測定，經(jīng)膜過濾和濃縮處理后酶提取液中膠原蛋白酶酶活回收率為75.8%.

2.3 復(fù)合水解酶濃縮液的乙醇沉淀

NABARLATZ 等[16]分別使用無水乙醇和硫酸銨沉淀污泥提取液中的蛋白酶，結(jié)果表明乙醇的沉淀效果要優(yōu)于硫酸銨. NI[8]比較了鹽析法、等電點沉淀法和有機溶劑沉淀法(乙醇和丙酮)對污泥提取液中復(fù)合酶的沉淀效果，結(jié)果表明：有機溶劑沉淀法要優(yōu)于其他2種方法，且丙酮的沉淀效果最佳. 但從工業(yè)生產(chǎn)的適用性考慮，本研究選用乙醇沉淀法沉淀復(fù)合水解酶.

乙醇沉淀不僅影響酶的沉淀效率和酶活回收率，也對沉淀制備的酶制劑的復(fù)溶性有很大影響. 以沉淀后可溶出的蛋白酶活性為指標(biāo)，研究了乙醇體積分?jǐn)?shù)、離子強度、pH和沉淀時間對乙醇沉淀酶濃縮液中復(fù)合水解酶的影響(圖3).

乙醇體積分?jǐn)?shù)從40%增加到70%時，沉淀中膠原蛋白酶的酶活增加. 此后，繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，膠原蛋白酶酶活不再提高. 因此，選取70%乙醇沉淀復(fù)合水解酶(圖3A).

溶液中適量的離子強度能提高乙醇沉淀酶的效果和沉淀酶的可溶性[17]，本研究選用NaCl來調(diào)節(jié)酶提取液中的離子強度. 隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，沉淀中膠原蛋白酶酶活呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(圖3B)，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.3%時，沉淀出的膠原蛋白酶酶活最高.

隨著溶液pH的增加，沉淀中膠原蛋白酶酶活也逐漸增加(圖3C)，當(dāng)溶液pH為7.0時，沉淀出的膠原蛋白酶酶活最高. 此后隨著溶液pH的增加，膠原蛋白酶酶活逐漸減小.

在0～12 h范圍內(nèi)，隨著沉淀時間的延長，沉淀中膠原蛋白酶的酶活上升(圖3D). 在12 h時，沉淀中膠原蛋白酶酶活達(dá)到最高.

結(jié)合上述結(jié)果，確定乙醇沉淀復(fù)合水解酶的最佳條件為：酶濃縮液加入NaCl至終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%，溶液pH調(diào)至7.0，加乙醇至終體積分?jǐn)?shù)70%，充分搖勻，4 ℃靜置12 h沉淀酶蛋白，沉淀經(jīng)冷凍干燥得洗滌用復(fù)合水解酶粉末.

圖3 乙醇沉淀酶濃縮液中復(fù)合水解酶的條件篩選

2.4 洗滌用復(fù)合水解酶提取分離和制備

用上述實驗確定的最佳提取分離和制備工藝，先通過5 kg污泥的小試實驗后放大到50 kg中試水平. 實驗由小試放大至中試水平后，復(fù)合水解酶中膠原蛋白酶的酶活和酶活回收率與小試的差異不大. 結(jié)果表明(表1)：制備工藝放大后，仍具有很好的重復(fù)性，可用于工業(yè)化生產(chǎn). 中試實驗所得酶粉中膠原蛋白酶、堿性蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶的酶活分別為4.216、3.714、11.915、3.060和1.291 U/mg.

表1 小試與中試實驗制備的酶制劑中酶活性與回收率

2.5 復(fù)合水解酶穩(wěn)定劑的篩選

冷凍干燥所得復(fù)合水解酶的熱穩(wěn)定性較差，在常溫下存放酶易失活. 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，某些鹽類、糖類、醇類和氨基酸具有提高酶熱穩(wěn)定性的效果[18-26]. 本研究從這4類影響酶穩(wěn)定性的小分子物質(zhì)中各選擇4種化合物，測定了它們對復(fù)合水解酶穩(wěn)定性的影響. 在4種無機鹽(NaCl、MgSO4、ZnSO4、NH4Cl)中，MgSO4和NaCl能顯著提高復(fù)合水解酶的穩(wěn)定性(圖4). NH4Cl對酶的穩(wěn)定性無顯著影響，而ZnSO4則降低酶的穩(wěn)定性. MgSO4和NaCl均在20 mmol/L時對復(fù)合水解酶的穩(wěn)定效果最好，與對照組相比，酶的t1/2(55 ℃) 分別提高了2.6倍和2.9倍. MgSO4的效果稍優(yōu)于NaCl. 因此，選取20 mmol/L的MgSO4作為最佳的無機鹽類穩(wěn)定劑(圖4A). 4種糖類物質(zhì)(蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉)在所測定的各種質(zhì)量分?jǐn)?shù)時均能顯著提高復(fù)合水解酶的穩(wěn)定性，其中以蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3%時的效果最顯著，與對照組相比酶的t1/2(55 ℃)提高了4.4倍，表明3%的蔗糖是糖類物質(zhì)中最佳的酶穩(wěn)定劑(圖4B). 4種醇(甘露醇、甘油、丙三醇和正丁醇)均對復(fù)合水解酶的穩(wěn)定性有不同程度的改善，其中甘露醇的效果最顯著. 甘露醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時，比對照組的t1/2(55 ℃) 提高了3.3倍(圖4C). 4種氨基酸中，甘氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸對復(fù)合水解酶穩(wěn)定性均有顯著的提高，其中30 mmol/L甘氨酸的效果最顯著，比對照組的t1/2(55 ℃) 提高了3.6倍.而精氨酸對復(fù)合水解酶的穩(wěn)定性無顯著影響(圖4D).

圖4 復(fù)合水解酶熱穩(wěn)定劑的篩選

以上結(jié)果表明，在所測定的 4類小分子化合物中，鹽類中的MgSO4(20 mmol/L)、糖類中的蔗糖(3%)、醇類中的甘露醇(3%)和氨基酸類的甘氨酸(30 mmol/L)在其同類化合物中對復(fù)合水解酶穩(wěn)定性的效果最好. 為了獲得最佳的復(fù)合穩(wěn)定劑，采用L9(34)正交試驗，對4種化合物組成的復(fù)合穩(wěn)定劑的配方進(jìn)行了優(yōu)化. 正交實驗的設(shè)計和結(jié)果見表2和表3. 正交實驗的結(jié)果表明：在單因素水平上，4種化合物對復(fù)合水解酶穩(wěn)定性影響由大到小依次為蔗糖、MgSO4、甘露醇、甘氨酸. 各種組合穩(wěn)定劑中，9號復(fù)合穩(wěn)定劑對酶的穩(wěn)定效果最顯著，其t1/2(55 ℃)達(dá)到314.9 min，比對照組的t1/2(55 ℃)(見圖4)提高了10.3倍. 因此，以上篩選出的最佳復(fù)合穩(wěn)定劑配方為4%蔗糖、4%甘露醇、30 mmol/L甘氨酸、10 mmol/L MgSO4.

表2 復(fù)合水解酶L9(34)正交實驗表

表3 復(fù)合水解酶L9(34)正交實驗設(shè)計及結(jié)果

2.6 洗滌用顆粒酶制劑的制備及在室溫下的儲存穩(wěn)定性

按洗滌劑用酶的特點，研究和制備了洗滌用的顆粒酶制劑. 按固體總量計算，用4%復(fù)合酶粉末、10%硅藻土、10%可溶性淀粉、6%復(fù)合穩(wěn)定劑和70%十水硫酸鈉的配方組合，制作成洗滌劑用的復(fù)合水解酶的顆粒制劑[15]. 對該顆粒酶制劑中洗滌劑常用添加酶的酶活進(jìn)行分析，其中堿性蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶的酶活分別為1.527、5.935、1.015和0.479U/mg(表4)，表明該顆粒酶制劑的酶種類與酶活性與市售商品洗滌用酶制劑相近，可用作洗滌用酶添加劑.

對制備的顆粒型復(fù)合水解酶制劑在室溫條件下的儲存穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，并與粉末酶制劑進(jìn)行了比較. 隨著儲存時間的延長，顆粒酶制劑中脂肪酶酶活的損失速率明顯慢于粉末酶制劑(圖5). 儲存60d后，粉末型酶制劑的酶活降至僅31.8%，而顆粒酶制劑仍保留76.4%的酶活. 表明將復(fù)合水解酶粉末制作成顆粒酶制劑能有效地降低其在室溫下儲存時酶活性的損失，提高其商品價值.

表4 市售和制備的洗滌劑用顆粒酶制劑比較

圖5 室溫下洗滌用顆粒酶制劑中脂肪酶的儲存穩(wěn)定性

3 結(jié)論

本研究開發(fā)了一種簡單、高效的從剩余活性污泥中提取、分離和制備復(fù)合水解酶并將其制備成洗滌用酶制劑的方法和工藝. 將剩余活性污泥按固液比1∶2加入含1% Triton X-100的純水?dāng)嚢杼崛?0 min，離心收集上清液得到酶提取液. 酶提取液經(jīng)膜過濾分離和濃縮后，調(diào)節(jié)酶濃縮液的pH至7.0，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，4 ℃下沉淀12 h后，4 ℃、5 000 r/min離心15 min收集酶沉淀. 酶沉淀用適量的磷酸緩沖液溶解，真空冷凍干燥得復(fù)合水解酶粉末. 粉末酶制劑按固體總量4%復(fù)合水解酶粉末、10%硅藻土、10%可溶性淀粉、6%復(fù)合穩(wěn)定劑和70%十水硫酸鈉的配方制作成洗滌劑用的顆粒酶制劑. 顆粒酶制劑中堿性蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶的酶活分別為1.527、5.935、1.015和0.479 U/mg，主要的酶種類與酶活性與市售商品洗滌劑用酶制劑相近. 該方法和工藝簡單，設(shè)備和生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)的酶制劑價值高，可用于從剩余活性污泥中提取制備洗滌劑用復(fù)合水解酶的規(guī)?；a(chǎn).