間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)HPV18型陽(yáng)性人子宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡的影響

邱杰洪?張昌林?李田

【摘要】目的 觀察人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（MSC-CM）對(duì)HPV18型陽(yáng)性人子宮頸癌HeLa細(xì)胞（HPV18 HeLa細(xì)胞）凋亡相關(guān)基因的調(diào)控作用，以及對(duì)HPV18 HeLa細(xì)胞凋亡的影響。方法 制備MSC-CM，設(shè)置空白組、低劑量組和高劑量組，配制相應(yīng)濃度分別為0%、20%和60%的MSC-CM處理HPV18 HeLa細(xì)胞，使用CCK-8法、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力和克隆形成能力;磷脂結(jié)合蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶雙染法凋亡染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)量。結(jié)果 與空白組相比，在低劑量組或高劑量組的MSC-CM作用下，HPV18 HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)活性和克隆形成能力均降低，細(xì)胞凋亡率升高（P均< 0.05），且高劑量組作用效果均比低劑量組明顯（P均< 0.05）。與空白組相比，HPV18 HeLa細(xì)胞在低劑量或高劑量組MSC-CM的作用下，HPV18 HeLa細(xì)胞中p53、胱天蛋白酶-3（Caspase-3）、Caspase-9、Bax的mRNA表達(dá)量升高，而B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）的mRNA表達(dá)量降低（P均< 0.05），高劑量組比低劑量組的作用效果更明顯（P < 0.05）。結(jié)論 MSC-CM能誘發(fā)HPV18 HeLa細(xì)胞凋亡，可能與p53、Caspase-3、Caspase-9、Bax以及Bcl-2等基因表達(dá)差異相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】人乳頭瘤病毒18型;宮頸癌;HeLa細(xì)胞;間充質(zhì)干細(xì)胞;細(xì)胞凋亡

Effect of umbilical cord-derived mesenchymal stem cell-conditioned medium on apoptosis of HPV18-infected HeLa cell lines Qiu Jiehong， Zhang Changlin， Li Tian. Department of Gynecology and Pelvic Floor Disorders Center， the Seven Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Shenzhen 518107， China

Corresponding author， Li Tian， E-mail： sandylitian@ 126. com

【Abstract】Objective To evaluate the effect of umbilical cord-derived mesenchymal stem cell-conditioned medium （MSC-CM） on regulating the apoptosis-related genes and determine the impact upon the apoptosis of human papillomavirus type18-infected HeLa cell lines. Methods Primary cervical cancer HeLa cells were divided into the blank， low-dose and high-dose groups. HeLa cells were cultured and treated with 0%， 20% and 60% of MSC-CM in three groups， respectively. The cell viability and clone formation ability of HeLa cells were detected by CCK-8 assay and clone formation assay. The apoptosis of HeLa cells was detected by Annexin V-Fluorescein isothiocyanate/Propidium iodide （V-FITC/PI） staining and flow cytometry. The expression levels of p53， Bax， Caspase-3， Caspase-9 and Bcl-2 mRNA in HeLa cells were quantitatively measured by RT-PCR. Results In the low- and high-dose groups， the cell viability and clone formation ability were significantly decreased， whereas the apoptosis rate was significantly elevated compared with those in the blank group （all P < 0.05）. The effects in the high-dose group were more evident than those in the low-dose group （all P < 0.05）. The expression levels of p53， Bax， Caspase-3 and Caspase-9 mRNA in the low- and high-dose groups were significantly up-regulated， whereas that of Bcl-2 mRNA was significantly down-regulated compared with those in the blank group （all P < 0.05）. The effects in the high-dose group were more pronounced than those in the low-dose group （all P < 0.05）. Conclusions Under the effect of MSC-CM， the apoptosis of HPV18 cervical HeLa cells can be induced， probably associated with the differential expression patterns of p53， Bax， Bcl-2， Caspase-3 and Caspase-9 mRNA.

【Key words】Human papillomavirus type18;Cervical cancer;HeLa cell;Mesenchymal stem cells;

Apoptosis

人乳頭瘤病毒（HPV）是一種閉合雙鏈DNA病毒[1]。在HPV感染導(dǎo)致的眾多上皮病變中，子宮頸癌與HPV的持續(xù)感染高度相關(guān)[2]。目前約90%的子宮頸癌由高危型HPV感染引起，其中69.1%的子宮頸癌是由HPV16和HPV18引起的，這對(duì)全球女性的健康造成了嚴(yán)重的不良影響[3]。目前大部分HPV疫苗以預(yù)防HPV感染為主，主要保護(hù)HPV陰性人群，且不能終身預(yù)防[4]。因此，探索一種靶向清除HPV陽(yáng)性子宮頸癌細(xì)胞的治療方案，成為了目前子宮頸癌防治的迫切需求。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）是一種多能干細(xì)胞，因取材廣泛、增殖迅速，在細(xì)胞治療領(lǐng)域備受關(guān)注[5]。研究顯示，MSC能增加血循環(huán)中未成熟CD4+ T淋巴細(xì)胞數(shù)目，逆轉(zhuǎn)HIV-1持續(xù)感染的結(jié)局[6]。乙型肝炎終末期肝病患者輸注MSC，能降低HBV的病毒復(fù)制水平[7]。同時(shí)，MSC的抗癌特性引起了研究人員的關(guān)注[8]。MSC能有效抑制膽管癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)并在動(dòng)物模型中定向遷移抑制瘤體生長(zhǎng)[9]。另外MSC能使卵巢腫瘤的細(xì)胞周期停滯并促進(jìn)其凋亡進(jìn)程[10]。可見(jiàn)，MSC在病毒感染和腫瘤中發(fā)揮著重要的作用。然而目前較少報(bào)道MSC在宮頸癌中的作用，本研究通過(guò)制備MSC條件培養(yǎng)基（MSC-CM）處理人子宮頸癌HeLa細(xì)胞，探索MSC對(duì)人HeLa細(xì)胞的影響及可能機(jī)制。

材料與方法

一、細(xì)胞來(lái)源及主要試劑

人臍帶MSC購(gòu)自博雅干細(xì)胞公司，HPV18型陽(yáng)性人子宮頸癌HeLa細(xì)胞（HPV18 HeLa細(xì)胞）購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶購(gòu)自美國(guó) Corning 公司，DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液均購(gòu)自美國(guó) Gibco公司，MSC專用胎牛血清購(gòu)自BI公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司。磷脂結(jié)合蛋白Ⅴ（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）雙染法凋亡試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。Trizol RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光實(shí)時(shí)定量（qRT）-PCR試劑盒均購(gòu)自北京天根生物科技有限公司。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含100 U/ml 青霉素， 100 μg/ml鏈霉素）培養(yǎng) HPV18 HeLa 細(xì)胞;本研究采用F3～F6代的MSC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用含10%胎牛血清的低糖DMEM/F12 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，置于37℃含5% CO2、濕度為95%的環(huán)境中培養(yǎng)，2 ～ 3 d 傳代1次。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80% ～ 90%時(shí)，利用含0.25%胰酶進(jìn)行常規(guī)傳代。

三、MSC-CM對(duì)HPV18 HeLa細(xì)胞活性與增殖檢測(cè)

1. MSC-CM的制備

將1×106的MSC（F3代）接種于培養(yǎng)瓶中，待12 h細(xì)胞貼壁后，采用無(wú)血清DMEM/F12饑餓培養(yǎng)72 h，并收集其培養(yǎng)上清，300×g、離心10 min后，將上清通過(guò)針筒式濾膜過(guò)濾器（0.22 μm，水系）過(guò)濾得到MSC培養(yǎng)上清，并用磷酸鹽緩沖液（PBS）和DMEM培養(yǎng)液將MSC培養(yǎng)上清配制成濃度為0%、20%以及60%的MSC-CM。

2. CCK-8實(shí)驗(yàn)

將4×103個(gè)/孔的HPV18 HeLa細(xì)胞接種于96孔板中，設(shè)置空白組、低劑量組和高劑量組，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)孔，分別加入0%、20%和60% 的MSC-CM培養(yǎng)，48 h后通過(guò)CCK-8試劑盒對(duì)HeLa細(xì)胞的活力進(jìn)行測(cè)定，對(duì)各組吸光度（OD）值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)采用至少3批不同批次的MSC，且每批次實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

3. 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞HPV18 HeLa細(xì)胞，胰蛋白酶消化制備單細(xì)胞懸液，設(shè)置空白組、低劑量組和高劑量組，細(xì)胞以 800個(gè)/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞培養(yǎng)12 h貼壁后，分別加入0%、20%和60%的 MSC-CM，每組細(xì)胞各設(shè)5個(gè)重復(fù)孔，以37℃、5% CO2培養(yǎng)7 ～ 9 d后，PBS 沖洗1次，用甲醇固定 20 min，結(jié)晶紫染色 15 min，拍照，并計(jì)數(shù)集落數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)采用不同批次的MSC，且每批次實(shí)驗(yàn)至少重復(fù) 3 次。

4. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

設(shè)置空白組、低劑量組和高劑量組，分別使用0%、20%和60%的MSC-CM處理HPV18 HeLa細(xì)胞，48 h后收集3組的細(xì)胞樣品制備細(xì)胞懸液，然后各加入100 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再向細(xì)胞懸液中加入FITC標(biāo)記的Annexin V和PI各5 μl，混勻后避光孵育 30 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)采用不同批次的MSC，且每批次的實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，每組收集5份重復(fù)樣本。

5. qRT-PCR探索MSC促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡的凋亡基因差異

按前述實(shí)驗(yàn)方案準(zhǔn)備0%、20%和60% MSC-CM處理48 h的HPV18 HeLa細(xì)胞樣品，即空白組、低劑量組和高劑量組的HPV18 HeLa細(xì)胞樣品，依據(jù)天根生物科技公司提供的試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，并利用qRT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)分子p53、胱天蛋白酶-3（Caspase-3）、Caspase-9、Bax、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）的表達(dá)，并通過(guò)2-??Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析，評(píng)價(jià)在不同濃度的MSC-CM下HPV18 HeLa細(xì)胞凋亡的比例。實(shí)驗(yàn)采用3批以上不同批次的MSC且每批次實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)中所涉及的基因?qū)?yīng)的引物序列如表1所示。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用GraphPad Prism 8.0.2進(jìn)行作圖。正態(tài)分布數(shù)據(jù)以進(jìn)行描述，2組數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);多組數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、MSC-CM對(duì)HPV18 HeLa細(xì)胞活力與增殖的影響

依次以0%、20%和60%的MSC-CM分別處理3組HPV18 HeLa細(xì)胞48 h后，高劑量組和低劑量組的HPV18 HeLa細(xì)胞的OD值均低于空白組（P均< 0.05），且高劑量組的OD值低于低劑量組（P < 0.05）。另外，高劑量組和低劑量組的HPV18 HeLa細(xì)胞的克隆形成能力明顯比空白組降低（P均< 0.05），而且高劑量組的克隆形成數(shù)少于低劑量組（P < 0.05），見(jiàn)表2、圖1。

二、MSC-CM對(duì)HPV18 HeLa細(xì)胞凋亡的影響。

低劑量組和高劑量組的HPV18 HeLa細(xì)胞的凋亡率分別為（8.41±3.52）%和（31.80±9.58）%，均高于空白組（0.19±0.01）%（P均< 0.05）。高劑量組的HPV18 HeLa細(xì)胞凋亡率高于低劑量組（P < 0.05），見(jiàn)表3、圖2。

三、MSC通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)促進(jìn)HPV18 HeLa細(xì)胞的凋亡

低劑量組和高劑量組的HPV18 HeLa細(xì)胞中，p53、Caspase-3、Caspase-9以及Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于空白組（P均< 0.05），而Bcl-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于空白組（P均< 0.05），且高劑量組的作用效果比低劑量組更明顯（P均< 0.05），見(jiàn)圖3。

討論

人臍帶來(lái)源的MSC是典型的低分化多能干細(xì)胞之一，與骨髓MSC、脂肪MSC、人羊膜來(lái)源的MSC等相比，具有更低免疫原性，而且新生兒臍帶來(lái)源豐富，人臍帶來(lái)源的MSC在體外更容易擴(kuò)增，更容易推廣其臨床應(yīng)用[2]。MSC有定向歸巢的特性，即定向遷移到機(jī)體發(fā)生損傷或炎癥的組織，而人體內(nèi)的腫瘤，被稱為“過(guò)度愈合”的傷口。研究表明，MSC會(huì)被腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子吸引到腫瘤基質(zhì)[10]。所以MSC對(duì)腫瘤組織具有很強(qiáng)的定向遷移的能力，即MSC的腫瘤歸巢性。這為MSC靶向治療腫瘤或MSC作為藥物載體治療腫瘤，提供了廣闊的應(yīng)用前景。

MSC的抗腫瘤作用在肝癌、卵巢癌和乳腺癌等方面得到驗(yàn)證[11-13]。Qiao等（2004年）報(bào)道，人MSC的抗腫瘤發(fā)生作用是通過(guò)MSC的旁分泌作用實(shí)現(xiàn)的[14]。所以本研究提取MSC的培養(yǎng)上清，制備MSC-CM，初步探索MSC-CM對(duì)HPV18 HeLa細(xì)胞的影響，并揭示其中的分子機(jī)制。結(jié)果顯示，在MSC-CM的作用下，HPV18 HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)受到影響，這為人臍帶MSC在HPV所致的子宮頸病變以及子宮頸癌的治療提供了可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。同時(shí)，子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與持續(xù)數(shù)年的HPV慢性感染密切相關(guān)[14]。研究顯示，HPV誘導(dǎo)子宮頸癌的中心環(huán)節(jié)就是E6與p53之間的相互作用，p53的失活是導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的主要原因[15]。Chen等（2014年）研究顯示，HPV的遺傳序列整合入子宮頸上皮細(xì)胞后，HPV 編碼的E6蛋白，可與P53蛋白結(jié)合，從而導(dǎo)致染色體的不穩(wěn)定性增加，阻礙細(xì)胞的自發(fā)性凋亡，最終導(dǎo)致細(xì)胞永生化[17]。除此之外，Bcl-2蛋白家族在細(xì)胞程序性死亡中起著非常重要的作用。Bcl-2蛋白家族主要通過(guò)改變線粒體外膜通透性從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。在Bcl-2家族中，Bax通過(guò)寡聚化在線粒體外膜形成孔道，改變線粒體的通透性，使線粒體內(nèi)容物釋放，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如細(xì)胞色素C從線粒體釋放后，可與Caspase-9組成凋亡體，使Caspase-3的表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此Caspase-3、Caspase-9和Bax基因也被稱為促凋亡基因，然而Bcl-2則可阻斷上述通路，抑制Bax的促凋亡進(jìn)程，Bcl-2也因此被稱為抗凋亡基因[16]。本研究通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MSC能有效上調(diào)p53、Caspase-3、Caspase-9和Bax等促凋亡基因的表達(dá)，而且有效抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，從而促進(jìn)HPV18 HeLa細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，人臍帶MSC通過(guò)旁分泌作用上調(diào)p53、Caspase-3、Caspase-9和Bax等促凋亡基因的表達(dá)，而且有效抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，從而促進(jìn)HPV18 HeLa細(xì)胞的凋亡，為MSC治療HPV感染相關(guān)的癌癥病變提供新思路。然而MSC在其他類型HPV所導(dǎo)致的癌癥病變中的作用，仍需進(jìn)一步深入探討，以期為MSC對(duì)HPV的防治應(yīng)用提供更科學(xué)的依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2020-11-05）

（本文編輯：林燕薇）