王仁漢 宋志美 屈旭

摘要：YUC基因家族催化吲哚-3-丙酮酸（IPA）生成生長(zhǎng)素（IAA）的過程，進(jìn)而調(diào)控植物生長(zhǎng)素的合成。目前，研究者已經(jīng)在多種植物上鑒定分析了YUCCA基因家族，但是關(guān)于煙草中該基因的報(bào)道較少。為了探討普通煙草YUCCA基因結(jié)構(gòu)及功能，通過檢索普通煙草全基因組蛋白序列，篩選出21個(gè)煙草YUCCA基因家族序列，利用生物信息學(xué)工具對(duì)其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、同源性進(jìn)行分析。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示，煙草YUCCA蛋白可以聚類到4個(gè)分支，與同為單子葉植物的擬南芥的親緣關(guān)系較近。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，煙草YUCCA基因內(nèi)含子數(shù)量在0～6個(gè)之間;協(xié)同進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，親緣關(guān)系近的基因內(nèi)含子數(shù)量較為相近;亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，19個(gè)序列定位到細(xì)胞質(zhì)，2個(gè)序列定位到細(xì)胞質(zhì)膜，該基因可能參與細(xì)胞質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

關(guān)鍵詞：煙草;YUCCA基因家族;生物信息學(xué);生長(zhǎng)素

生長(zhǎng)素（IAA）是一種重要的植物激素，參與植物的大部分生長(zhǎng)發(fā)育過程，如在花、維管束、葉的發(fā)育和胚胎模式等發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用。近年來，IAA的合成途徑已經(jīng)被揭示（圖1）[1]，IAA生物合成的2條主要途徑包括色氨酸（Trp）依賴途徑和Trp獨(dú)立途徑[2]。通過色氨酸轉(zhuǎn)氨酶（TAA）/YUCCA（YUC）途徑合成生長(zhǎng)素是目前研究最多的生長(zhǎng)素生物合成途徑，該途徑中的Trp首先由TAA轉(zhuǎn)化為吲哚-3-丙酮酸酯（IPA），IPA在YUC家族編碼的黃素單加氧酶作用下產(chǎn)生IAA，此過程為多種植物IAA合成的限速步驟[3-5]。YUC是最早被確定為生長(zhǎng)素合成過程的關(guān)鍵酶，因?yàn)?YUC酶在擬南芥中過表達(dá)導(dǎo)致IAA過量產(chǎn)生[3]。研究者在擬南芥[6-7]、水稻[8]、玉米[9]等植物中進(jìn)行了YUCCA基因的全基因分析，而對(duì)煙草中該基因的研究較少。過表達(dá)OsYUCCA1基因的水稻植株表現(xiàn)出IAA水平升高和生長(zhǎng)素分泌過多的特征表型，而表達(dá)反義OsYUCCA1 cDNA的植株則表現(xiàn)出生長(zhǎng)素不敏感[8]。過表達(dá)擬南芥AtYUC6基因的馬鈴薯具有植株增高、生命周期延長(zhǎng)等較明顯的生長(zhǎng)素表現(xiàn)特征[9]。YUC基因的失活導(dǎo)致在表達(dá)YUC基因的組織中生長(zhǎng)素報(bào)告基因DR5-GUS的表達(dá)量顯著降低[6]。本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)煙草YUCCA基因家族進(jìn)行分析，為深入探討煙草該基因家族的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從美國(guó)國(guó)家生物信息中心（NCBI）網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載擬南芥、水稻、玉米、小麥的YUCCA蛋白序列，合并作為種子序列。從SNG數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//solgenomics.net/）下載普通煙草蛋白序列文件和gff文件。

1.2 煙草YUCCA基因的鑒定和理化性質(zhì)分析

以擬南芥、水稻、小麥、玉米的YUCCA蛋白序列為種子序列，通過BLASTp檢索煙草的全部蛋白質(zhì)序列，E值設(shè)置為1×10-10。經(jīng)去重復(fù)，共獲得25個(gè)候選序列，將候選序列提交到Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//web.expasy.org/protparam/）中，鑒定其是否含有YUCCA蛋白特有的保守結(jié)構(gòu)域，E值設(shè)置為0.001。然后將獲得的序列提交到ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/），預(yù)測(cè)其分子量、氨基酸數(shù)量、等電點(diǎn)等信息。再將序列提交到Protcomp 9.0（http：//linux1.softberry.com/），對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。

1.3 YUCCA基因家族的保守域分析和同源性分析

搜索煙草YUCCA基因家族中的基序，可以揭示基因家族在進(jìn)化中的多樣性并推測(cè)它們的功能。通過MEME搜索煙草YUCCA蛋白質(zhì)氨基酸序列，對(duì)其基序進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，預(yù)測(cè)基量設(shè)定為10。

通過基因進(jìn)化樹，可以清晰、直觀地觀察到基因家族成員在進(jìn)化過程中的分化情況。為了研究煙草YUCCA基因在進(jìn)化中的規(guī)律，用MEGA軟件對(duì)擬南芥、水稻、玉米、煙草的YUCCA蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)，選擇泊松模型，bootstrap值設(shè)置為1 000，構(gòu)建鄰接進(jìn)化樹。

1.4 煙草YUCCA基因家族表達(dá)模式分析

從NCBI GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載編號(hào)為GSE95717的普通煙草品種K326的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，將本研究獲得的煙草 YUCCA基因家族成員依次檢索，提取匹配到的煙草相關(guān)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，用Multiple Experiment Viewer軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 YUCCA基因家族的鑒定和理化性質(zhì)分析

利用種子序列檢索普通煙草蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，得到25個(gè)YUCCA基因家族候選序列。將候選序列提交至Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)，其中有21個(gè)序列含有YUCCA基因家族特有的蛋白結(jié)構(gòu)保守域，最終獲得21個(gè)煙草YUCCA基因家族成員（表1、圖2）。理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，最短的YUCCA蛋白序列（YUCCA17）包含161個(gè)氨基酸，最長(zhǎng)的YUCCA蛋白序列（YUCCA21）包含485個(gè)氨基酸，相應(yīng)的相對(duì)分子量分別為18 247.92、5 837.18;YUCCA20～YUCCA9的理論等電點(diǎn)為572～9.43，YUCCA9～YUCCA8的不穩(wěn)定指數(shù)為29.44～48.79。在21個(gè)YUCCA蛋白序列中，YUCCA15沒有內(nèi)含子，YUCCA17含有1個(gè)內(nèi)含子，YUCCA1～YUCCA8含有2個(gè)內(nèi)含子，YUCCA9～YUCCA14、YUCCA16、YUCCA19含有3個(gè)內(nèi)含子，YUCCA18含有4個(gè)內(nèi)含子，YUCCA20、YUCCA21含有6個(gè)內(nèi)含子。將序列提交到Protcomp 9.0進(jìn)行亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)除了YUCCA20、YUCCA21定位在細(xì)胞質(zhì)膜，其余19條序列均定位在細(xì)胞質(zhì)。染色體定位結(jié)果顯示，10個(gè)基因定位到9條染色體上，其中17號(hào)染色體上有2個(gè)基因，7、8、12、16、19、21、22、23號(hào)染色體均有1個(gè)基因，其余11個(gè)家族成員定位到Scaffold上。

2.2 煙草YUCCA蛋白序列保守域分析

用DNAMAN工具對(duì)21個(gè)煙草的YUCCA蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)，除個(gè)別序列外，大部分序列含有黃素嘌呤二核苷酸（FAD）結(jié)合位點(diǎn)、腺嘌呤核苷三磷酸序列、還原型輔酶Ⅱ結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在不同序列中幾乎相同，其中在10個(gè)保守的motifs中，motif2為FAD、NADPH的結(jié)合位點(diǎn)。利用MEME工具對(duì)21條煙草的YUCCA蛋白序列進(jìn)行分析（圖4），發(fā)現(xiàn)在所有序列中，YUCCA20含有3個(gè)motifs，數(shù)量最少。協(xié)同系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，分在同一分支基因的motif數(shù)量相近，分布在不同分支的基因各序列間的motif數(shù)量相差較大，可能在基因功能上也存在差異。

2.3 煙草、擬南芥、水稻、玉米YUCCA基因的同源性分析

為進(jìn)一步研究YUCCA蛋白在植物中的進(jìn)化規(guī)律，利用21個(gè)煙草YUCCA蛋白質(zhì)序列、7個(gè)水稻YUCCA蛋白質(zhì)序列、9個(gè)玉米YUCCA蛋白質(zhì)序列、12個(gè)擬南芥YUCCA蛋白質(zhì)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。進(jìn)化樹將這4種植物的49個(gè)YUCCA成員分為7個(gè)亞科（1～7），發(fā)現(xiàn)所有煙草YUCCA蛋白都屬于1、5、6、7這4個(gè)分支。分支2、3屬于水稻特有的2個(gè)類群，分支4是玉米特有的1個(gè)類群。在1、5、6、7分支中， 同為雙子葉植物的煙草、擬南芥YUCCA蛋白的親緣關(guān)系較為密切，在分支6、7上，發(fā)現(xiàn)單子葉植物水稻、玉米YUCCA蛋白有較密切的親緣關(guān)系，這意味著雙子葉植物和單子葉植物的YUCCA基因親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，同為雙子葉植物或同為單子葉植物具有高度的進(jìn)化保守性和密切的同源關(guān)系。

2.4 煙草YUCCA基因的表達(dá)模式分析

煙草YUCCA基因聚類分析和可視化處理結(jié)果（圖6）顯示，不同基因的表達(dá)量存在差異，在18 h內(nèi)，YUCCA13、YUCCA21在各組織中均高表達(dá)，YUCCA15、YUCCA16、YUCCA18、YUCCA19基因的表達(dá)水平較低。部分基因僅在某個(gè)組織的發(fā)育時(shí)期高表達(dá)，YUCCA5、YUCCA9、YUCCA10基因僅在莖端組織高表達(dá)，YUCCA1、YUCCA4基因在根組織高表達(dá)。綜上分析結(jié)果表明，煙草YUCCA基因家族在不同組織中的表達(dá)量存在差異，莖端的總體表達(dá)量高于莖、根，這與莖端是生長(zhǎng)素的主要合成部位相吻合。

3 討論

YUC作為植物IAA合成過程中的限速酶，其生物學(xué)功能在多種植物中得到了廣泛挖掘，但是該基因在煙草中的信息較為缺乏[10-11]。因此，利用生物信息學(xué)鑒定煙草YUCCA基因，并對(duì)其理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域及同源性進(jìn)行分析，可為后續(xù)研究YUCCA在生長(zhǎng)素合成過程中發(fā)揮的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)信息。

本研究利用普通煙草數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定出21個(gè)YUCCA基因家族成員，多于擬南芥的12個(gè)，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于普通煙草是異源四倍體植物，在進(jìn)化過程中，由于全基因復(fù)制而使基因家族出現(xiàn)擴(kuò)增。通過煙草YUCCA蛋白保守結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化樹協(xié)同分析發(fā)現(xiàn)，劃分在同一分支的家族成員具有相近數(shù)量的motif，表現(xiàn)出煙草YUCCA蛋白結(jié)構(gòu)上的保守性、功能上的相似性;分布在不同分支的家族成員的motif數(shù)量相差較大，motif存在差異可以賦予YUCCA基因不同的功能，從而表現(xiàn)出基因家族功能的多樣性，此結(jié)果與大豆[12]、大白菜[13]、水稻[8]YUCCA基因的研究結(jié)果相吻合。以往研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AD、NADPH、ATG基序可能是YUCCA基因生物學(xué)功能的關(guān)鍵位點(diǎn)，其中FAD、NADPH的結(jié)合位點(diǎn)是YUCCA活動(dòng)中心[14-15]。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，煙草YUCCA成員被定位到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)膜，生長(zhǎng)素合成是在細(xì)胞質(zhì)中完成的，這些基因可能在細(xì)胞質(zhì)中參與生長(zhǎng)素合成過程。本研究利用生物信息初步分析了普通煙草的21個(gè)YUCCA基因，但是關(guān)于該基因在煙草生長(zhǎng)素合成過程中的作用機(jī)制及相關(guān)功能還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究鑒定出21個(gè)煙草YUCCA基因家族成員，氨基酸長(zhǎng)度為161～485個(gè)之間，除YUCCA15沒有內(nèi)含子外，其余成員的內(nèi)含子數(shù)為2～6個(gè);19個(gè)YUCCA家族成員亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)，2個(gè)定位在細(xì)胞質(zhì)膜;染色體定位結(jié)果顯示，10個(gè)基因定位到9條染色體上，17號(hào)染色體有2個(gè)基因，7、8、12、16、19、21、22、23號(hào)染色體均有1個(gè)基因，其余11個(gè)家族成員定位到Scaffold，染色體位置尚無法確定。結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，煙草YUCCA蛋白含有FAD、NADPH結(jié)合位點(diǎn)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析將煙草YUCCA家族成員分到了4個(gè)分支，在同一分支中，煙草與擬南芥YUCCA家族成員的親緣關(guān)系較近。

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