王倩文 李劍怡 王龍

隨著醫(yī)療技術(shù)的提高,大多數(shù)國(guó)家急性心肌梗死(MI)的死亡率呈下降趨勢(shì),但是MI后長(zhǎng)期幸存者的比例顯著增加,加重了社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)[1]。與健康人群相比,急性MI幸存者是發(fā)生心血管疾病的高風(fēng)險(xiǎn)人群,包括室性心律失常[2]。金合歡素是一種類黃酮化合物,作為傳統(tǒng)中藥有多種用途。近年來,不斷有研究證明金合歡素可以對(duì)心血管疾病產(chǎn)生多種有益的生物學(xué)效應(yīng)[3－5]。已證明,心肌缺血前給予金合歡素可以減少室性心律失常評(píng)分[6]。然而,MI后期時(shí)使用金合歡素是否會(huì)對(duì)室性心律失常產(chǎn)生影響鮮有相關(guān)研究。因此,筆者在建立MI大鼠模型4周后,利用單次尾靜脈給藥的方式研究金合歡素對(duì)MI誘發(fā)室性心律失常誘發(fā)率和持續(xù)時(shí)間的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 30只健康SPF級(jí)雄性大鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,體重為180～200 g,許可證號(hào):SCXK(湘)2016-0002。動(dòng)物在20～22 ℃,相對(duì)濕度55%～65%,12 h晝夜節(jié)律燈照,隨意進(jìn)食進(jìn)水的無菌環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。隨后將30只大鼠隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組、MI組、金合歡素組,每組10只。MI組和金合歡素組均采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)制備MI模型,造模前禁食12 h,禁水4 h。腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 ～60 mg/kg)麻醉,頸部及胸前剃毛備皮,將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上,利用水循環(huán)保溫系統(tǒng)(RWD-001)維持手術(shù)臺(tái)溫度為(22±2)℃,備皮區(qū)0.5%碘伏消毒,后爪傷害性刺激無反應(yīng)證實(shí)麻醉深度適當(dāng)。在大鼠甲狀軟骨水平將頸部皮膚縱向剪開一長(zhǎng)約1 cm 切口,鈍性分離組織,暴露氣管后插入自制氣管導(dǎo)管。確認(rèn)成功插入后,接通小動(dòng)物呼吸機(jī)(特力TKR 400H)行控制性機(jī)械輔助通氣,呼吸機(jī)設(shè)置參數(shù):呼吸頻率70次/分,吸呼比1∶1.5,潮氣量3.0 ml/kg。觀察氣道壓力以及胸廓?jiǎng)佣?保證呼吸回路通暢。大鼠四肢用針刺電極連接電生理記錄儀(MP150,BIOPAC),用Power Lab數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(AD Instruments)進(jìn)行Ⅱ?qū)?lián)心電圖監(jiān)測(cè)。于大鼠胸骨左側(cè)平行切開2 cm 的切口,鈍性分離胸大肌等組織,顯露助骨。將第三和第四根肋骨斷開,用開胸器撐開肋骨以顯露心臟,撕裂心包,在左心耳下方約2 mm 處以6/0縫線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支。結(jié)扎點(diǎn)以下心肌由紅變白、心尖搏動(dòng)減弱、心電圖示ST 段抬高證明MI模型制作成功。清理胸腔后逐層縫合關(guān)胸。待大鼠恢復(fù)規(guī)律自主呼吸后拔管撤離呼吸機(jī),保暖直至清醒。假手術(shù)組大鼠開胸后僅在冠狀動(dòng)脈下穿線但不結(jié)扎,其余步驟同MI造模。本實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物倫理規(guī)范,并獲得了武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理部門的倫理批準(zhǔn)。

1.2 心臟超聲檢查 MI造模4周后第1天,用超聲儀器(GE E95)評(píng)估大鼠心臟功能。腹腔注射少量3%戊巴比妥鈉(10～20 mg/kg)麻醉,保留大鼠自主呼吸。胸部備皮完成后,將大鼠仰臥位固定于操作臺(tái)上進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。測(cè)量左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)、左室收縮未期內(nèi)徑(LVIDS)及左室舒張未期內(nèi)徑(LVIDD)。檢查完成后大鼠充分保暖直至清醒。

1.3 體表心電圖記錄和電生理實(shí)驗(yàn) MI造模4周后第2天至第5天,假手術(shù)組、MI組和金合歡素組大鼠進(jìn)行電生理實(shí)驗(yàn)并同時(shí)記錄體表心電圖。腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 ～60 mg/kg)麻醉,頸部和胸前區(qū)備皮消毒,仰臥位固定于操作臺(tái),行氣管插管術(shù)并連接呼吸機(jī)正壓通氣,大鼠四肢用針刺電極連接Power Lab數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖,利用LabChart8.0 自 動(dòng) 分 析 心 率(HR)、RR 間 期、PR 間期、QRS波時(shí)限和QT 間期。用調(diào)整后的Bazett算法計(jì)算QTc間期,QTc ＝QT/ (RR/f),f＝150 ms[7－8]。金合歡素組大鼠尾靜脈注射金合歡素(大連美侖生物技術(shù)有限公司)10 mg/kg[6]。假手術(shù)組和MI組均以相同的給藥方式,給予等量生理鹽水。給藥30 min后于第3、4肋水平開胸,用開胸器固定,充分暴露左室游離壁同時(shí)注意避免損傷肺臟。將刺激電極置于梗死周邊區(qū),分別用6 V、8 V、10 V 的Burst刺激(50 Hz,100個(gè)脈沖,持續(xù)2 s)刺激大鼠心臟,誘發(fā)室性心律失常,包括室性早搏、室性心動(dòng)過速或心室顫動(dòng),每次進(jìn)行20次重復(fù)Brust刺激記錄室性心律失常的持續(xù)時(shí)間,計(jì)算誘發(fā)率(Burst刺激誘發(fā)出室性心律失常的次數(shù)除以總次數(shù))。每只大鼠每種強(qiáng)度下刺激6次,每次間隔3 min以恢復(fù)自發(fā)搏動(dòng)并消除心電記憶,每只大鼠心臟一共進(jìn)行了18次Burst刺激。

1.4 組織病理學(xué)觀察 電生理實(shí)驗(yàn)后剪取大鼠心臟,用PBS緩沖液反復(fù)沖洗心臟,除去左右心房、右室以及大血管等多余組織,取左室心肌組織,用4%的多聚甲醛溶液固定,酒精脫水、石蠟包埋、制作切片并進(jìn)行Masson染色,觀察心肌形態(tài)學(xué)變化。Masson染色藍(lán)色表示膠原纖維,紅色表示心肌細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以±s 表示,2組比較采用t 檢驗(yàn),多組比較采用單因素的方差分析,以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

造模過程中,假手術(shù)組、MI組和金合歡素組大鼠分別死亡2只、2只和1只。MI造模1周內(nèi),假手術(shù)組、MI組和金合歡素組大鼠分別死亡1 只、2只和3只。

2.1 三組大鼠心臟超聲指標(biāo)比較 與假手術(shù)組相比,MI組和金合歡素組大鼠LVEF 及LVFS明顯下降,LVIDS以及LVIDD 明顯增加。見表1。

表1 三組大鼠心臟超聲指標(biāo)比較

2.2 三組大鼠體表心電圖指標(biāo)比較 各項(xiàng)體表心電圖指標(biāo)中,與假手術(shù)組比較,金合歡素組的HR明顯增加,PR 間期顯著降低,MI組和金合歡素組的QTc間期降低。與MI組比較,金合歡素組的HR 增快,QTc間期縮短,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表2。

表2 三組心電圖指標(biāo)比較

2.3 三組大鼠室性心律失常誘發(fā)率和持續(xù)時(shí)間比較 用6 V、8 V 以及10 V 的Burst刺激大鼠心臟誘發(fā)室性心律失常時(shí)發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組大鼠未能誘導(dǎo),但MI組和金合歡素組均誘發(fā)出了室性心律失常。與MI組比較,金合歡素組在8 V 和10 V 的Burst刺激下,室性心律失常誘發(fā)率顯著降低,6 V 的Burst刺激時(shí)誘發(fā)率有下降趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表3)。與MI組比較,金合歡素組大鼠室性心律失常的持續(xù)時(shí)間顯著縮短(表4,圖1)。

表3 三組室性心律失常誘發(fā)率比較/%

2.4 三組大鼠心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)學(xué)變化 Masson染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組大鼠左室心肌細(xì)胞走行規(guī)整,大小形態(tài)均勻,細(xì)胞膜完整,無炎性細(xì)胞浸潤(rùn),未見明顯病理改變。MI組和金合歡素組大鼠左室心肌細(xì)胞排列紊亂,形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞膜不完整,心肌組織細(xì)胞漿著色變深,有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),存在大量藍(lán)色膠原纖維,心肌細(xì)胞間廣泛纖維化。見圖2。

表4 三組誘發(fā)室性心律失常持續(xù)時(shí)間比較/s

3 討論

圖1 三組室性心律失常誘發(fā)情況

圖2 三組左室心肌組織Masson染色比較

金合歡素是一種廣泛存在于自然界的天然類黃酮化合物。既往研究表明攝入類黃酮化合物會(huì)對(duì)MI和心律失常等心血管疾病產(chǎn)生有利影響。Chang等[3]和Liu等[6]實(shí)驗(yàn)表明,在急性MI治療窗口期給予金合歡素,可以改善左室心功能和心梗面積。此外,有文獻(xiàn)報(bào)道金合歡素可以抑制心律失常[4]。在本研究中,筆者發(fā)現(xiàn)金合歡素顯著降低了不同強(qiáng)度Burst刺激下MI大鼠誘發(fā)的室性心律失常誘發(fā)率以及持續(xù)時(shí)間,尤其是以8V 刺激時(shí)。這提示金合歡素可以抑制室性心律失常。QTc間期與室性心律失常密切相關(guān)。在心肌梗死和左室功能障礙患者中,QTc間期更容易延長(zhǎng)[9]。有研究報(bào)道,QTc間期每延長(zhǎng)10 ms,病人發(fā)生惡性心律失常事件的風(fēng)險(xiǎn)上升15%[10]。與MI組相比,金合歡素組大鼠的HR 增快,QTc間期縮短,表明金合歡素可能通過縮短QTc間期,影響心室復(fù)極過程,從而降低室性心律失常誘發(fā)率。但是與假手術(shù)組比,MI組及金合歡素組的QTc間期均縮短,這可能和樣本量較少有關(guān)?，F(xiàn)有臨床研究報(bào)道胺碘酮和索他洛爾等抗心律失常藥存在增加QTc間期的副作用[11]。因此,金合歡素有望作為即時(shí)抑制MI患者誘發(fā)的室性心律失常的選擇之一。

雖然本實(shí)驗(yàn)表明金合歡素可能是一種即時(shí)抑制MI誘發(fā)室性心律失常的候選藥物,但仍具有局限性。首先,離子通道與室性心律失常密切相關(guān)[12],金合歡素是否作用于離子通道抑制室性心律失常,有待進(jìn)一步研究。其次,鑒于本研究已證明金合歡素可即時(shí)抑制室性心律失常,長(zhǎng)期使用金合歡素對(duì)MI誘發(fā)室性心律的影響如何有待探討。最后,所有的結(jié)果都是在嚙齒類動(dòng)物模型上得到的,尚需在大型動(dòng)物(如犬)上進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究,獲得臨床前數(shù)據(jù),為將來的臨床試驗(yàn)提供參考。