陳 輝，趙丹霞，林敦尖，冉繼偉，劉 輝*

（廣東產品質量監(jiān)督檢驗研究院，廣東 佛山 528300）

普魯蘭酶（EC 3.2.1.41）是一種重要的淀粉脫支酶，已經(jīng)被廣泛應用到水解支鏈淀粉，糖原和其他含有α-1,6糖苷鍵的支鏈多糖中[1]。普魯蘭酶根據(jù)底物特異性和水解產物的不同可以分為五大類：（i）I型普魯蘭酶（EC 3.2.1.41）；（ii）II型普魯蘭酶（EC 3.2.1.41），除了水解普魯蘭糖中的α-1,6糖苷鍵，還能水解淀粉中的α-1,4糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵；（iii）新普魯蘭酶（EC 3.2.1.135）；（iv）異普魯蘭酶（EC 3.2.1.57）；（v）普魯蘭糖水解酶III型（EC 3.2.1-）[2-3]。

普魯蘭酶在工業(yè)生產中有著廣泛的應用。到目前為止，報道的產普魯蘭酶的微生物種類繁多，主要為芽孢桿菌屬，如Bacillus cereus，Bacillus subtilis和Paenibacillus，其普魯蘭酶酶活經(jīng)過優(yōu)化后分別達到1.18 U/mL，1.36 U/mL和11.1 U/mL[4-6]。關于巨大芽孢桿菌產野生普魯蘭酶的報道較少，有報道在大腸桿菌中成功克隆表達了巨大芽孢桿菌中的普魯蘭酶基因[7]。目前已發(fā)現(xiàn)的普魯蘭酶大多數(shù)是酸性普魯蘭酶，堿性普魯蘭酶卻鮮有報道，堿性普魯蘭酶添加到洗滌劑中可以極大提高洗滌效果，特別是針對淀粉類污漬[8]?，F(xiàn)已報道的產堿性普魯蘭酶的微生物有AlkalophilicBacillussp.S-1，AlkalophilicBacillussp.KSM-1876，Pseudoalteromonassp.M25[9-11]。

已有研究表明，普魯蘭酶與淀粉酶一起作用，可以高效協(xié)同的完全水解淀粉得到麥芽三糖和麥芽四糖[12]，有研究報道關于產麥芽六糖的α-淀粉酶[13-14]，未見有報道關于產麥芽六糖的普魯蘭酶。本研究在云南省昆明市玉米秸稈腐殖質土壤中篩選分離鑒定得到一株產堿性普魯蘭酶的巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），該普魯蘭酶可作用于普魯蘭糖得到麥芽六糖。本研究通過單因素和響應面優(yōu)化試驗對巨大芽孢桿菌培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以期得到產普魯蘭酶最佳培養(yǎng)條件，為普魯蘭酶的開發(fā)和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）Y103：從云南省昆明市玉米秸稈腐殖質土壤中篩選分離得到；蛋白胨、酵母膏、無機鹽等：北京奧博星生物技術有限公司；普魯蘭糖：日本林原公司；糯米淀粉、馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉、硫酸銨、醋酸銨、葡萄糖等（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠；蛋白質標準Markers：日本TAKARA公司；細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒（Qiagen）、Qiagen凝膠回收試劑盒、DNA標準Markers、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑、巨大芽孢桿菌16S rDNA通用引物（27f：5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；1495r：5'-GGTTACCTT GTTACGACTT-3'）：上海生工生物工程有限公司；麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽六糖、異麥芽六糖：美國Miragen公司；薄層層析（thin layer chromatography，TLC）硅膠板：德國Merck公司。

富集培養(yǎng)基：糯米淀粉10.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，pH自然；

鑒別培養(yǎng)基：普魯蘭糖3.0 g/L，瓊脂15.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，pH自然；

發(fā)酵培養(yǎng)基與種子培養(yǎng)基：糯米淀粉5.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，NaCl 2.0 g/L，MnSO4·7H2O 0.05 g/L，pH自然。

初始發(fā)酵都發(fā)生于裝有50 mL培養(yǎng)基的250 mL三角錐形瓶中，25 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)，PCR反應條件為95 ℃變性4 min，然后95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、90 s，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.2 儀器與設備

TS-200電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海天城實驗儀器制造有限公司；SW-CJ-2F超凈工作臺：FD50R高壓蒸汽滅菌鍋、XMTD-204數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；UV-2450S（E）紫外分光光度計：日本島津公司；XR1臺式高速冷凍離心機：賽默飛世爾科技有限公司；FE20 pH計、AL204電子分析天平、DYY-6C瓊脂糖凝膠電泳儀、T100梯度PCR儀：北京六一科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 巨大芽孢桿菌Y103發(fā)酵單因素試驗

安康市位于陜西省東南部，屬國務院公布的全國14個連片特困地區(qū)之一——秦巴山區(qū)核心地帶，脫貧攻堅任務十分艱巨［1］；呈貧困體量大、貧困程度深、脫貧難度大特點。為實現(xiàn)2020年脫貧的目標，安康市各級政府統(tǒng)籌部署，攻堅克難，目前已經(jīng)取得了顯著的成效：貧困人口數(shù)量逐步減少，貧困農村落后的基礎設施得到改善，貧困農民的生活水平有了明顯提高和改善。然而，課題組成員2016—2018年在安康市多個貧困村調查時發(fā)現(xiàn)，當?shù)剞r村還存在一個棘手難題，即已達婚齡的男青年婚戀越來越困難，具體表現(xiàn)在三個方面：一是可婚配的女青年少；二是婚姻支付昂貴；三是婚姻極不穩(wěn)定。

在發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，分別考察了以下因素對巨大芽孢桿菌Y103產普魯蘭酶的影響。碳源種類（普魯蘭糖、糯米淀粉、馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉和葡萄糖）及碳源添加量（5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L），氮源種類（酵母膏、蛋白胨、硫酸銨、醋酸銨、酵母膏＋蛋白胨（1∶1）、酵母膏＋蛋白胨（1∶2）、酵母膏＋蛋白胨（2∶1））及氮源添加量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L），培養(yǎng)基初始pH（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5），發(fā)酵溫度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃），發(fā)酵時間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h），接種量（1%、2%、3%、4%、5%）。根據(jù)單因素試驗結果和實際情況，挑選出影響產酶的顯著性因素進行響應面設計。

1.3.2 巨大芽孢桿菌Y103發(fā)酵響應面設計試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇4個對產普魯蘭酶影響著性的因素：發(fā)酵溫度（A），初始pH（B），發(fā)酵時間（C），碳源添加量（D）為自變量，以普魯蘭酶酶活（Y）為因變量。利用Design-Expert.V.8.0.6.1.軟件進行4因素3水平的響應面試驗設計。響應面試驗因素與水平編碼見表1。

表1 巨大芽孢桿菌Y103發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for fermentation conditions optimization of Bacillus megaterium Y103

1.3.3 普魯蘭酶蛋白純度及相對分子質量的測定

酶蛋白純度及相對分子質量的測定采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法，參照LAEMMLI U K等[16]的方法進行試驗，采用120 g/L分離膠和50 g/L濃縮膠進行凝膠電泳。蛋白條帶用考馬斯亮藍R250染色后脫色，蛋白質標準Markers作為標準品。

酶譜試驗：參照PAN D等[17]的方法有所修改，分離膠中添加1%的普魯蘭糖作為底物。

1.3.4 粗酶液酶學性質的研究

最適pH與最適溫度：將發(fā)酵液離心后的上清液作為粗酶液，在50 ℃、pH 5～10的條件下測定酶活。將最高酶活定義為100%，分別計算不同pH下的相對酶活。在pH 8.0、35～60 ℃的條件下測定酶活。將最高酶活定義為100%，分別計算不同溫度下的相對酶活。

1.3.5 水解產物單糖組成分析

參照LIU X等[18]的方法進行薄層層析試驗，定性分析粗酶液水解普魯蘭糖的水解產物，接著通過高效陰離子交換色譜（high performance anion exchange chromatography，HPAEC）定量分析粗酶液水解普魯蘭糖的產物，用流動相A（250 mmol/L氫氧化鈉溶液）和B（1 mol/L氫氧化鈉三水合物在250 mmol/L氫氧化鈉溶液中）進行梯度洗脫，用麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽六糖和異麥芽六糖作為標準品。

1.3.6 測定方法

普魯蘭酶酶活的測定：參考ROY A等[15]的方法進行實驗。酶活單位定義：一個普魯蘭酶酶活單位定義為在上述測定條件下從普魯蘭糖中每分鐘釋放1 μmolD-葡萄糖還原糖當量的酶量，以1 U/mL來表示。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗數(shù)據(jù)取3 次重復試驗的平均值，并計算標準誤差。用Origin 8.5進行單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）和最小顯著性差異分析（least significant difference，LSD），并用該軟件進行作圖。響應面試驗設計通過Design-Expert 8.0.6.1軟件進行分析與處理，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 巨大芽孢桿菌Y103發(fā)酵單因素試驗結果

圖1 碳源種類（A）、碳源添加量（B）、氮源種類（C）、氮源添加量（D）、發(fā)酵溫度（E）、培養(yǎng)基初始pH（F）、發(fā)酵時間（G）、接種量（H）對巨大芽孢桿菌Y103產普魯蘭酶的影響Fig.1 Effect of carbon source (A),carbon source addition (B),nitrogen source (C),nitrogen source addition (D),fermentation temperature (E),initial pH of medium (F),fermentation time (G) and inoculum (H) on pullulanase production by Bacillus megaterium Y103

由圖1A可知，用糯米淀粉作為碳源時普魯蘭酶的酶活最高，為0.06 U/mL，巨大芽孢桿菌Y103不能利用葡萄糖產普魯蘭酶，可能是因為葡萄糖中沒有α-1,6糖苷鍵，不能夠誘導該菌株產生普魯蘭酶，選擇糯米淀粉作為培養(yǎng)基的碳源。由圖1B可知，隨著糯米淀粉添加量的增加，普魯蘭酶的酶活也隨之提高，當糯米淀粉的添加量為10 g/L時，普魯蘭酶酶活最高，為0.09 U/mL，當添加量超過10 g/L時，普魯蘭酶酶活反而降低，可能是因為糯米淀粉添加量較高時培養(yǎng)基比較黏稠，降低了培養(yǎng)基中的溶解氧含量。由圖1C可知，復合氮源優(yōu)于單一氮源，且有機氮源優(yōu)于無機氮源，當使用復合氮源（酵母膏∶蛋白胨=1∶2）時，普魯蘭酶酶活最高，為0.11 U/mL。由圖1D可知，隨著復合氮源（酵母膏∶蛋白胨=1∶2）添加量的增加，普魯蘭酶的酶活也隨之提高，當復合氮源（酵母膏∶蛋白胨=1∶2）添加量為40 g/L時，得到普魯蘭酶酶活最高，為0.21 U/mL，當?shù)刺砑恿砍^40 g/L時反而降低，可能是由于過多的氮源誘導菌株產生蛋白酶將目標蛋白分解。由圖1E可知，隨著發(fā)酵溫度的不斷升高，普魯蘭酶的酶活呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當發(fā)酵溫度為20 ℃時，普魯蘭酶酶活最高，為0.41 U/mL，隨著溫度繼續(xù)升高酶活降低，可能因為溫度過高影響了該菌株的生長，有研究證明微生物產普魯蘭酶偏向一個較低的溫度，產酶溫度通常低于其最佳生長溫度[6，22]。由圖1F可知，隨著培養(yǎng)基初始pH由酸性向堿性變化時，普魯蘭酶酶活先上升后下降，培養(yǎng)基初始pH在8.5時普魯蘭酶產量最高，類似地，菌株Exiguobacteriumsp.SH3[3]，Bacillus acidopullulyticus[23]和Clostridium thermosulfurogenesSV2[24]產堿性普魯蘭酶也更喜歡一個偏堿性的培養(yǎng)基（pH 7.5～8.5）。由圖1G可知，該菌株產酶隨發(fā)酵時間延長呈先上升后下降的趨勢，在60 h時普魯蘭酶酶活最高，達到0.69 U/mL，隨后酶活開始降低，可能由于此時巨大芽孢桿菌的一些次級代謝產物如蛋白酶影響了普魯蘭酶的活性，而且在發(fā)酵過程中可能存在反饋抑制調節(jié)[4]。由圖1H可知，接種量對產酶沒有顯著影響接種量在2%時酶活最高，達到0.71 U/mL。

2.3 巨大芽孢桿菌Y103響應面試驗優(yōu)化結果

響應面試驗設計與結果見表2，方差分析結果見表3。對表2的數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合，得到普魯蘭酶酶活（Y）對發(fā)酵溫度（A），培養(yǎng)基初始pH（B），發(fā)酵時間（C）和碳源添加量（D）的二次回歸多項式方程：

Y=0.76+0.096A+0.073B-0.038C-0.023D+0.100AB+0.028AC-0.020AD-0.045BC+7.500E-003BD-0.033CD-0.25A2-0.16B2-0.087C2-0.032D2

表2 巨大芽孢桿菌Y103產普魯蘭酶條件優(yōu)化響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiments for fermentation conditions optimization of pullulanase production by Bacillus megaterium Y103

表3 響應面二次模型的方差分析Table 3 Variance analysis of response surface quadratic model

續(xù)表

由表3可知，回歸模型（P＜0.01），表明方程模型極顯著，失擬項值（P=0.126 7＞0.05），失擬項不顯著。一般來說，回歸模型的總決定系數(shù)R2高于90%，就認為有較高的可信度。該回歸模型的總決定系數(shù)R2=0.986 1，調整決定系數(shù)R2adj=0.972 1，預測決定系數(shù)R2pre=0.925 9，說明該模型可信度高，擬合程度較好，試驗誤差小[25]，因此該回歸方程模型成立，能夠準確分析普魯蘭酶產量與4個因素之間的關系及其交互作用的影響?；貧w模型的一次項A、B、C，交互項AB、BC與二次項A2、B2、C2對酶活影響極顯著（P＜0.01），一次項D，交互項CD與二次項D2對酶活影響顯著（P＜0.05），其他項對酶活影響不顯著（P＞0.05）。

響應面分析及交互作用對普魯蘭酶酶活的影響如圖2所示。由圖2a可知，當溫度較低時普魯蘭酶的酶活也較低，隨著溫度升高，普魯蘭酶的酶活也顯著提高，表明溫度有顯著性影響，隨著溫度的升高，在培養(yǎng)基初始pH值為8.5時有最大的響應值，且沿著pH軸的不同水平下響應值也有顯著性變化，表明發(fā)酵溫度和培養(yǎng)基初始pH對普魯蘭酶的酶活存在相當大的交互作用，這與B.halodurans產普魯蘭酶優(yōu)化時的結果類似[21]。由圖2b可知，培養(yǎng)基初始pH與發(fā)酵時間對普魯蘭酶的酶活也有極大的交互作用，在發(fā)酵時間持續(xù)到60 h時，隨著培養(yǎng)基初始pH的從7.5增加至8.5，普魯蘭酶的酶活從0.36 U/mL增加至0.60 U/mL，隨著培養(yǎng)基初始pH從8.5增加至9.5，普魯蘭酶的酶活從0.60 U/mL下降至0.53 U/mL。由圖2c可知，隨著發(fā)酵時間持續(xù)到60 h，當碳源添加量從0.5%增加至1%，普魯蘭酶酶活從0.38 U/mL增加至0.73 U/mL，超出這個時間和添加量范圍后酶活緩慢降低。

根據(jù)響應面軟件分析結果得到巨大芽孢桿菌Y103產普魯蘭酶的最佳培養(yǎng)基配方為糯米淀粉8.5 g/L，酵母膏13.3 g/L，蛋白胨26.7 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，MnSO4·7H2O 0.05 g/L，NaCl 2.0 g/L。最佳的發(fā)酵條件為：培養(yǎng)基初始pH8.8，發(fā)酵溫度21 ℃，發(fā)酵時間55 h。在最佳工藝條件下進行3次驗證試驗，得到普魯蘭酶酶活平均值為0.77 U/mL，與理論值（0.78 U/mL）接近，驗證了該模型的準確性和有效性。是優(yōu)化前（0.24±0.02）U/mL的3.21倍。

圖2 發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基初始pH、發(fā)酵時間交互作用對巨大芽孢桿菌Y103產普魯蘭酶酶活影響的響應曲面與等高線Fig.2 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between fermentation temperature,initial pH of medium and fermentation time on pullulanase production by Bacillus megaterium Y103

2.4 普魯蘭酶蛋白純度及相對分子質量的測定

圖3 普魯蘭酶的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳結果Fig.3 Results of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of pullulanase

由圖3可知，得到3條普魯蘭酶蛋白條帶和1條淀粉酶蛋白條帶。從SDS-PAGE估算得到2條普魯蘭酶蛋白質條帶的分子質量為102.5 kDa和79.1 kDa，與美國國家生物信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）中Genbank里面巨大芽孢桿菌兩個普魯蘭酶基因的預測普魯蘭酶大小相一致，表明兩條帶均是普魯蘭酶條帶[26]。

2.5 普魯蘭酶的部分酶學性質

圖4 普魯蘭酶粗酶液最適pHFig.4 Optimal pH of crude pullulanase solution

圖5 普魯蘭酶粗酶液最適溫度Fig.5 Optimal temperature of crude pullulanase solution

由圖4、圖5可知，普魯蘭酶粗酶液的最適作用pH為8.0，最適作用溫度為50 ℃，表明該普魯蘭酶是一種堿性的耐熱性普魯蘭酶。有報道稱B.halodurans，alkalophilicBacillussp.S-l和Bacillussp.KSM-1876幾種芽孢桿菌產堿性普魯蘭酶的最適作用pH為8.0～10.0，最適作用溫度是50 ℃[21，27]。

2.6 水解產物單糖組成分析

根據(jù)1.3.5的方法，普魯蘭酶水解普魯蘭糖后得到的產物有麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽六糖和異麥芽六糖，表明其既能水解α-1,6糖苷鍵，又能水解α-1,4糖苷鍵，推測該巨大芽孢桿菌Y103所產的普魯蘭酶為一種新穎的II型普魯蘭酶。由表4可知，普魯蘭酶水解普魯蘭糖后產物分別為麥芽三糖13.616 μg/mL，麥芽四糖1.882 μg/mL，麥芽六糖14.660 μg/mL，異麥芽六糖1.185 μg/mL。現(xiàn)有許多研究報道了產麥芽六糖的淀粉酶[14-15]，而關于產麥芽六糖的普魯蘭酶卻很少見報道。由此可見，本研究得到的普魯蘭酶在麥芽六糖的生產中有著潛在的巨大利用價值。

表4 水解普魯蘭糖的單糖組成分析Table 4 Analysis of monosaccharide composition of pullulan hydrolytic products

3 結論

本研究從云南省昆明市玉米秸稈腐殖質土壤中成功篩選鑒定出一株產普魯蘭酶的巨大芽孢桿菌Y103，通過單因素試驗和響應面優(yōu)化試驗成功對其產普魯蘭酶條件進行優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)基配方為糯米淀粉8.5 g/L，酵母膏13.3 g/L，蛋白胨26.7 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，MnSO4·7H2O 0.05 g/L，NaCl 2.0 g/L；最佳發(fā)酵條件為初始pH8.8，發(fā)酵溫度21 ℃，發(fā)酵時間55 h。此條件下普魯蘭酶酶活從優(yōu)化前的（0.24±0.02）U/mL提高至（0.77±0.03）U/mL，是之前的3.21倍，優(yōu)化效果明顯。該新穎的II型普魯蘭酶是一種堿性熱穩(wěn)定性普魯蘭酶，可以是洗滌劑中的有效添加劑，其水解普魯蘭糖的水解產物有大量的麥芽三糖和麥芽六糖，在高麥芽糖漿和麥芽六糖的生產中有著潛在的巨大利用價值。不足之處本研究在實驗室搖瓶條件下進行，要實現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模開發(fā)生產，還需要進一步發(fā)酵工藝的研究。